蛋白質(zhì)組學技術及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應用.doc

蛋白質(zhì)組學技術及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應用陳艷，田道法（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南長沙410007）摘要：蛋白質(zhì)組學技術的應用日益廣泛，并在向臨床實際應用發(fā)展，包括臨床標本的檢測性研究及相關疾病的診斷與分型等。本文對于蛋白質(zhì)組學技術及其在鼻咽癌臨床分型研究中的應用情況進行綜述，以介紹并推進該類技術在腫瘤臨床上的應用。鼻咽癌是來源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤，其死亡率約占全部惡性腫瘤死亡率的2.81，居第八位；在頭頸部惡性腫瘤中，鼻咽癌的發(fā)病率則居首位。早期轉(zhuǎn)移是鼻咽癌的顯著臨床特征之一，是由鼻咽癌細胞的特殊生物學特性所決定的，是造成患者病情惡化的主要原因。盡管人們一直在探索鼻咽癌的發(fā)病機制，但鼻咽癌的發(fā)病機制還不十分清楚。大量的研究結(jié)果表明2-3，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多階段發(fā)展的病理過程,涉及大量不同種類和性質(zhì)蛋白質(zhì)的功能活性。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,細胞惡變前后的蛋白質(zhì)組表達情況發(fā)生了非常復雜的變化，普通生化分析技術很難把握其全貌。應用蛋白質(zhì)組學研究技術分析比較腫瘤發(fā)生過程中的蛋白質(zhì)組變化,就可以比較全面地分析某一時間斷面相關蛋白質(zhì)總體變化趨勢，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤相關特異性蛋白質(zhì),不僅為腫瘤診斷提供分子標志,也可能為腫瘤的治療和藥物開發(fā)提供可靠靶標。蛋白質(zhì)組是指某一物種、個體、器官、組織或者細胞基因組的全部蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達譜，或稱一種細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)。澳大利亞的兩位學者Wilkins和Williams在1994年首先提出了蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，即基因組所表達的全部蛋白質(zhì)，是細胞、組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(proteomics)是研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其規(guī)律的科學。蛋白質(zhì)組學研究已廣泛應用于腫瘤生物學標記物的篩選和鑒定、腫瘤分類、治療及腫瘤發(fā)生機制等領域。利用功能蛋白質(zhì)資料，可以解釋腫瘤的癌變機理，且對篩查可疑病例、早期診斷、病情監(jiān)測、預后評估具有很大的臨床意義。比較正常細胞與疾病細胞之間的差異表達蛋白質(zhì)譜，尋找與疾病發(fā)生發(fā)展相關的關鍵蛋白質(zhì)，有助于深人探討疾病的發(fā)生機制；通過質(zhì)譜分析等技術確認差異蛋白質(zhì)，可以為疾病提供早期診斷標志物。一蛋白質(zhì)組學技術蛋白質(zhì)組學的核心在于大規(guī)模地對蛋白質(zhì)進行綜合分析,通過對某一物種、個體、器官、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)生物學特性(包括表達水平、結(jié)構、翻譯后修飾、細胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)相互作用)的研究,可以對蛋白質(zhì)所執(zhí)行的生理性、病理性活動作出精細、準確、本質(zhì)性的闡述4。蛋白質(zhì)組學最有價值的優(yōu)勢，是它可以在一個實驗中觀察一個完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在特定的時間下,其生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應的變化5。蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容包括:針對已知基因及轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫的生物體、組織及細胞,建立相應蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(蛋白質(zhì)表達譜)及其蛋白質(zhì)組連鎖群；識別執(zhí)行關鍵生命功能的多種蛋白質(zhì)復合物并分析控制這些多蛋白質(zhì)復合物的基因調(diào)控網(wǎng)絡的特征；以重要的生命過程或人類一些重大疾病為對象,進行重要的生理和病理體系或過程的研究,即比較蛋白質(zhì)組學研究；蛋白質(zhì)組學支撐技術平臺和生物信息學的研究。蛋白質(zhì)組學研究的一般過程，首先是獲取細胞或組織樣品，然后進行樣品制備；通過二維凝膠電泳(2DPAGE)對樣品蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的群體分離，借助計算機輔助分析軟件，確認2DPAGE圖譜上的差異表達蛋白質(zhì)；繼而利用準確的切取技術，獲得2DE膠上感興趣的差異蛋白質(zhì)斑點，再對此凝膠塊進行酶解消化，分離純化蛋白質(zhì)，在質(zhì)譜儀上進行質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖及其相關數(shù)據(jù)；然后進行數(shù)據(jù)庫檢索，對蛋白質(zhì)種類及相關理化特性和功能活性進行鑒定；最后分析蛋白質(zhì)在細胞與組織中的表達及其生物學意義。常用樣品來源有：體外培養(yǎng)細胞、活體組織標本、血清和體液等等。樣品制備與蛋白質(zhì)分離：雙向凝膠電泳2-DE于1975年由Ofarrll等6創(chuàng)立，主要應用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離。2D-PAGE主要過程包括樣品制備、水化與等電聚焦、膠條的平衡及SDS-PAGE等步驟。其基本原理，是先從組織和細胞中獲得蛋白質(zhì)，通過pH梯度(immobilizedpHgradient)凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異分離出不同pI值的蛋白質(zhì)條帶，再將此膠條經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，按蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小而加以分離。固相pH梯度凝膠電泳技術的發(fā)展，使得2-DE的穩(wěn)定性和可重復性得到明顯改善7。SDS-PAGE運行結(jié)束后，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過雙向電泳而得以分離，然后就要凝膠進行染色，再于凝膠圖象分析儀上進行蛋白質(zhì)分離結(jié)果的分析。常用染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染色。染色完畢后，利用計算機軟件對2-DE凝膠圖像進行分析，如PD-QUEST軟件、LIPS、HERMES、GEMINI等，并對凝膠圖像上的蛋白質(zhì)斑點進行匹配，經(jīng)過對圖像進行的數(shù)字化處理等程序，最后獲得差異表達蛋白質(zhì)的相關數(shù)據(jù)，然后就可以對感興趣的蛋白質(zhì)斑點進行質(zhì)譜分析。生物質(zhì)譜分析：對于雙向電泳中感興趣的差異表達蛋白質(zhì)斑點，可以將其從聚丙烯酰胺凝膠中切下，經(jīng)過酶解純化后，采用生物質(zhì)譜進行分析鑒定而獲得肽指紋圖。其基本原理，是在樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定其分子量。對于經(jīng)過雙向凝膠電泳分離的目標蛋白質(zhì)，先采用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的C端形成肽健）成肽段，再應用質(zhì)譜技術分別對這些肽段進行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜分析技術包括兩種，即基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（MALD1-TOF-MS）和離子阱質(zhì)譜（ESI-MS）。其基本原理，是將大分子待測樣品與基質(zhì)混合，通過基質(zhì)分子吸收激光能量，轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)的激發(fā)能，導致大分子樣品的電離和氣化，生成的離子在真空無場區(qū)飛行并到達檢測器，不同荷質(zhì)比的離子到達檢測器的時間不同從而得到該蛋白質(zhì)的肽質(zhì)指紋PMF8。實驗所得肽譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行匹配，再采用一定的方法對匹配結(jié)果進行打分和排序，最后根據(jù)分值高低，利用系列相應軟件在序列信息庫查找并鑒定蛋白質(zhì)，以確定其種類及相關數(shù)據(jù)9,10。二蛋白質(zhì)組學技術在腫瘤學研究領域中的應用在后基因組學時代,現(xiàn)代醫(yī)學面臨著嚴峻的挑戰(zhàn),即如何在分子水平剖析腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的相關事件。與基因組學不同,蛋白質(zhì)組學的目的是研究蛋白質(zhì)的表達和蛋白質(zhì)的功能,以使研究者更好地探索腫瘤的生物學本質(zhì)及相關分子機制11。目前的研究表明,有大量的蛋白質(zhì)分子參與了腫瘤細胞周期、凋亡及轉(zhuǎn)移的調(diào)控12。實踐證明,蛋白質(zhì)組學研究將為腫瘤的早期診斷、腫瘤標志物的篩選與鑒定、抗腫瘤藥物的篩選及開發(fā)探索新的治療靶標,提供新的平臺13。近年來蛋白質(zhì)組學在腫瘤標志物的篩選和鑒定中應用最為廣泛。蛋白質(zhì)組學在腫瘤的診斷與治療方面具有廣泛的臨床應用前景，它主要通過運用蛋白質(zhì)分離分析技術比較正常組織和腫瘤組織的差異，從中發(fā)現(xiàn)腫瘤的早期標志蛋白分子，并建立相應的疾病診斷模型14。蛋白質(zhì)組學研究已在多種腫瘤中展開，已經(jīng)涵蓋了包括乳腺癌15、肺癌16、膀胱癌17、肝癌18、卵巢癌19、等的大多數(shù)腫瘤，獲得了大量有用的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，并建立了一些相應的數(shù)據(jù)庫。三蛋白質(zhì)組學技術在不同類型鼻咽癌細胞生物學行為特性研究中的應用鼻咽腔位于鼻腔后方第1和2頸椎的前方蝶骨底或枕骨基底部的下方，呈不規(guī)則的立方體，垂直徑約5.56.0cm，橫徑約3.03.5cm，前后徑為2.03.0cm。鼻咽與其周圍組織的關系密切而又復雜。鼻咽上鄰顱底，下接口咽，側(cè)聯(lián)中耳，前通鼻腔，后貼頸椎，可謂四通八達。因此，鼻咽癌引起的癥狀比較多樣化1。鼻咽癌的局部生長方式是以浸潤性蔓延為主，但在不同個體，其發(fā)展有一定的傾向性。在臨床上，腫瘤局限于鼻咽部即為鼻咽型；病變向上發(fā)展，出現(xiàn)對顱神經(jīng)損害和/或顱底骨質(zhì)破壞，但不伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，此為上行型，亦稱顱神經(jīng)侵犯型；往下發(fā)展，可以表現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)頸部單個或多個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫大，不伴有前組顱神經(jīng)受累或顱底骨質(zhì)破壞，但可以出現(xiàn)、-顱神經(jīng)受損癥狀，此為下行型，亦稱頸部腫塊型或頸淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移型；既表現(xiàn)有前組顱神經(jīng)受累和/或顱底骨質(zhì)破壞，又出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兼有上行、下行兩型情況者,為上下行型，也稱混合型。大量的研究資料表明，鼻咽癌的發(fā)病具有一定的遺傳傾向，是一種多基因遺傳相關性疾病。應用蛋白質(zhì)組學技術，直接從蛋白質(zhì)表達譜角度入手來研究鼻咽癌的相關問題，并與鼻咽癌細胞基因組的相應變化情況相印證，將更全面、真實地揭示鼻咽癌變的過程和本質(zhì)。Guo等20應用SELDI-TOF-MS及人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術分析了上行型及下行型鼻咽癌58例患者的血清蛋白質(zhì)，得到11個潛在的生物標記物，對不同類型腫瘤的區(qū)分率達到90%。此外，Cho等21通過對鼻咽癌復發(fā)患者、肺癌患者、單純性甲狀腺腫大患者及正常人的血清進行蛋白質(zhì)譜分析，識別出兩種分子量分別為11.6kDa和11.8kDa的同型血清淀粉樣A蛋白，它們與鼻咽癌的復發(fā)傾向呈正相關，可以作為一種有效監(jiān)測鼻咽癌復發(fā)趨勢的腫瘤標志物。王暉22等觀察不同類型鼻咽癌細胞系中蛋白質(zhì)表達的差異，認為放射生物學特性不同的鼻咽癌細胞系中，存在差異表達蛋白，其中p73可能成為預后預測的侯選標志物。孫懿23等用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜。在鼻咽癌細胞中驗證鑒定了22個差異表達蛋白質(zhì)。并認為它們可能作為p53功能相關蛋白質(zhì)，為闡明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的機制提供了重要依據(jù)和線索。向亞莉24等運用蛋白質(zhì)組學技術，建立了5-8F和6-10B分泌蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，質(zhì)譜分析鑒定出14個非冗余的分泌蛋白質(zhì)，作為研究NPC轉(zhuǎn)移機制以及篩選NPC轉(zhuǎn)移分子標志物的實驗依據(jù)。張文靜25等用蛋白質(zhì)組學技術篩選鼻咽癌的甲基化失活基因，認為15個5-aza-2-dC處理后表達上調(diào)蛋白質(zhì)的編碼基因可能是5-8F細胞的甲基化沉默基因。周異群26等研究人鼻咽癌細胞CNE一2L2惡性生物學行為相關的蛋白，認為高與低惡性生物學行為細胞間有l(wèi)2個差異表達蛋白質(zhì)，CD44表達減弱與As細胞的惡性行為減弱相關。但是，這些結(jié)果或現(xiàn)象，都還需要組織蛋白質(zhì)組學的進一步證實。劉宇勤等對下行型鼻咽癌原發(fā)灶組織細胞核的亞細胞蛋白質(zhì)組學特征及其中醫(yī)證型之間的關系研究下行型鼻咽癌不同中醫(yī)證型差異蛋白表達核蛋白點的質(zhì)譜分析，正常分析了氣血凝結(jié)型組織樣本223號核蛋白二維電泳凝膠斑點和火毒困結(jié)型組織樣本20號核蛋白二維電泳凝膠斑點，并初步驗證了223號和20號蛋白質(zhì)的相關生物學意義。四結(jié)語利用蛋白質(zhì)組學技術，可以全面、動態(tài)地分析腫瘤患者血清樣品、腫瘤細胞分泌物、腫瘤組織間隙中混合蛋白質(zhì)的種類及數(shù)量的改變，并通過探討其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的動態(tài)變化及分子作用網(wǎng)絡，有利于進一步闡明腫瘤的發(fā)病機制，尋找可以應用于腫瘤診斷、治療及預后評估的特異性標志物，并可以促進抗腫瘤新藥的開發(fā)27,28。不同類型的的鼻咽癌細胞，其細胞生物學特性顯然差異極大，預后與應該采用的治療方式也應該有所不同。應用蛋白質(zhì)組學技術深入探討其分子基礎，將有利于早期診斷和個體化治療。參考文獻：1閔華慶,洪明晃,郭翔.鼻咽癌M.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2003；922JonesPAEpigeneticsincarcinogenesisandcancerpreventionJAnnNYAcadSci，2003，983：213-2193HermanJG，BaylinSBGenesilencingincancerinassociationwithpromoterypermethylationJNEnglJMed，2003，349(21)：2042-20544BlackstockW,MannM.Aboundlessfutureforproteomics.Trendsiotechnol,2001,19(suppl):s1-s2.5HeQY,ChiuJF.Proteomicsinbiomarkerdiscoveryanddrugdeveloment.JCellBiochem,2003,89(5):868286.6OFARRELLPH，GOODMANHMResolufinoofsimianvirus40proteinsinwholecellextractsbytwo-dimensionalelectrophoresis：heterngeneityofmajorcapsidJcell，1976，9(2)：2892987GLLESPIEMAllfordableproteomics：thetwo-hybirdsystemsJCurrOpinMolTher，2003，5(3)：266-2708ZhangW，CzemikAJ，YungwirthT,eta1Matrix-assistedlaserdesorptionmassspectrometricpeptidemappingofproteinsseparatedbytwo-dimensionalgelelectrophoresis：DeterminationofphosphorylationinsynapsinIJProtenSci，1994，3(4)：6776869ChamradDC，KortingG，StuhlerK，eto2EvaluationofalgorithmsforpmteinidentificationfromsequencedatabasesusingmassspectrometrydataJProteome20044(3)：61962810VonEggelingF，DaviesH，LamasL，eta1Tissue-specificmicrodissectioncoupledwithproteinchiparraytechnologles：applicationsincancerresearchJBiotechniques，200029：1066107011MocellinS,RossiCR,TraldiP,etal.Molecularoncologyinthepost2genomicera:thechallengeofproteomics.TrendsMolMed,2004,10(1):243212LivingstonDM,ShivdasaniR.Towardmechanism2basedcancercare.JAMA,2001,285:58893.13PetricoinEF,LiottaLA.Clinicalapplicationsofproteomics.JNutr,2003,133(7Suppl):2476S84S.14HoebenaA，LanduytB，BotrusG，eta1Proteomicsincancerresearch：MethodsandapplicationofarraybasedproteinprefilingtechnologiesJAnalytieaChimicaActa，2006，564(1)：193315ZhangGQ，DUJ，PangDDetectionandclinicalsignificanceofserumproteomicpatternsofbreastcancersbysurfaceenhancedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometryZhonghuaZhongLiuZaZhi，2006，28(3)：20420716WuX，XiaoZ，ChenZ，eta1Differentialanalysisoftwodimensiongelelectrophoresisprofilesfromthenormalmetaplasia1dysplasiacarcinomatissueofhumanbronchialepitheliumJPatholInt，2004，54(10)：765-77317吳登龍,張元芳,關明,等.蛋白質(zhì)芯片技術篩選膀胱癌尿液標記物的研究.中華泌尿外科雜志，2004，25(7)；45345518FungET,YipTT,LomasL,etal.ClassificationofcancertypesbyMeasuringvariantsofhostresponseproteinsusingSELDIserumassays.IntJCancer,2005,115(5):783-78919YokoyamaY，KuramitsuY，TakashimaM，eta1ProteomicprofilingofproteinsdecreasedinhepatocellularcarcinomafrompatientsinfectedwithhepatitisCvirusProteomics，2004，4(7)：21ll-l620GuoX，CaoSM，YuJK，etalDistinctserumalproteomicpatternsbetweenascendinganddescendingtypesofloco-regionallyadvancednasopharyngealcarcinomaassessedbysurfaceenhancedlaserdesorptionionizationandanalysesChinMedJ(Engl)，2005，118：1912-191721ChoWC，YipTT，YipC，etalIdentificationofserumamyloidaprot