（植物學(xué)專業(yè)論文）桐花樹耐鹽相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

中山人學(xué)碩 ：論文 桐花樹耐鹽相關(guān)基因的克隆與表達(dá) 桐花樹耐鹽相關(guān)基因的克隆與表達(dá) 碩士生：劉晉 導(dǎo)師：黃椰林副教授 專業(yè)：植物學(xué) 研究方向：植物分子系統(tǒng)學(xué) 摘要 鹽脅迫對植物的生長和繁殖有著極大的影響，提高植物的耐鹽性是降低鹽脅 迫危害的有效方法，因此，研究植物耐鹽機(jī)理，通過基因工程培養(yǎng)耐鹽作物品種 已經(jīng)成為了當(dāng)前國際上關(guān)于植物耐鹽的研究熱點之一。紅樹植物所在的潮間帶高 鹽生境決定了其在長期的進(jìn)化發(fā)展中必然會形成其特有的耐鹽分子機(jī)制。 本研究通過r a c e 技術(shù)，利用本實驗室已有的紅樹植物桐花樹( a e g i c e r a s c o m i c “l(fā) a t u m ) 正向抑制性差減文庫中的部分基因片段克隆得到三個桐花樹耐鹽相 關(guān)基因：a c n h x l ，a c n h x 2 ，a c n h d 。通過分析這些基因的e d n a 序列和編 碼蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)構(gòu)上都具有n a + i r 轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的特 點，其中a c n h x i ，a c n i - 1 x 2 屬于n h x 基因家族，它們所編碼的蛋白a e n h x l 、 a c n h x 2 可能定位于液泡膜上，主要起n a + 液泡區(qū)隔化的功能；而a c n h d 基因 和已知的極少數(shù)植物n h d 基因構(gòu)成了n h x s o s i 兩大公認(rèn)類型之外的第三類 植物n a + ，h 十轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因。 通過熒光定量p c r 技術(shù)分析桐花樹葉中a c n h x i ，a c n h x 2 ，a c n h d 在 鹽和滲透物質(zhì)處理下的轉(zhuǎn)錄模式，我們發(fā)現(xiàn)a c n h x l 、a c n h x 2 ，a c n h d 的轉(zhuǎn) 錄水平變化不但與桐花樹葉中的n a + 濃度相關(guān)，還與k + 濃度有關(guān)，其中植物n h d 基因的轉(zhuǎn)錄與植物體內(nèi)k + 濃度有關(guān)為本研究首次發(fā)現(xiàn)；a c n i t x l 基因的轉(zhuǎn)錄變化 主要是由離子脅迫引起的，其功能很可能主要與降低離子脅迫對植物細(xì)胞的傷害 有關(guān)；而影響a c n h x 2 轉(zhuǎn)錄的主要次級脅迫與a c n h x i 不同，是高滲壓脅迫， 這說明a c n h x 2 在植物耐鹽機(jī)理中的作用很可能主要與減少高滲壓脅迫對植物 桐花樹耐鹽相關(guān)摧川的克降j 表達(dá) 細(xì)胞的傷害有關(guān)。a c n h d 轉(zhuǎn)錄模式與a c n h x l 相似，推測其有可能與a c n h x l 受到類似調(diào)控。 a c n t t x 2 與擬南芥的a t n h x l ，a t n h x 2 在同樣化學(xué)物質(zhì)處理同樣時問下的轉(zhuǎn)錄 卡楚式如出一轍，推測很可能受到類似于擬南芥a b a 依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控， j 在桐花樹中起著與擬南芥a t n h x l ，a t n h x 2 同樣的作用；而a c n h x l 與已知的 j 它植物n h x 基因在類似處理下的轉(zhuǎn)錄變化特點都不相同，說明桐花樹的耐鹽 分f 機(jī)理與其它植物既有共同點，又有其獨到之處。 a c n h x l 、a c h d 轉(zhuǎn)錄水平在2 5 0 i i l m 和5 0 0 m mn a c i 處理下不同，a c n h x l 、 一( p 5 c s 轉(zhuǎn)錄水平、k + n a + 比值、脯氨酸含量都隨著鹽激時間的增長而先升后降， 蛻明桐花樹在不同濃度、不同時間的鹽脅迫下有著不同適應(yīng)機(jī)制。( a c p 5 c s 基因 的克隆和a c n h x l 、a c n h d 基因在不同時間赫激下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)實驗已由本實驗 室傅新暉完成) 關(guān)鍵詞：耐鹽，桐花樹，鈉氫轉(zhuǎn)運蛋白，脯氨酸 i i 生盔蘭堡! 笙塞 塑些塑塑竺塑莖苧墮塑壅墮! 鍪 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i s o fs a l tt o l e r a n c e r e l a t e dg e n e si na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m n a m e ：l i uj i n s u p e r v i s o r ：p r o f s h is u h u a , a s s o c i a t ep r o f h u a n g y e l i n m a j o r ：b o t a n y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：p l a n tm o l e c u l a rs y s t e m a t i c s a b s t r a c t s a l ts t r e s ss e v e r e l ya f f e c t st h eg r o w t ha n dp r o d u c t i v i t yo fp l a n t sa n di m p r o v i n g t h ec a p a b i l i t yo fs a l t - t o l e r a n c eo fp l a n t si sa ne f f e c t i v ew a yt or e d u c et h ei m p a c tf r o m s a l ts t r e s s d i s s e c t i n gt h em e c h a n i s m so fs a l t - t o l e r a n c ei np l a n t sa n dd e v e l o p i n g s a l t - t o l e r a n tc r o p sb yg e n ee n g i n e e r i n gh a sb e c o m eac e n t r a li s s u ei ns t u d i e so fp l a n t s a l tt o l e r a n c e i n h a b i t i n gi n t e r t i d a lz o n e sw i t hh i g hs a l i n i t y , m a n g r o v e sh a v e d e v e l o p e du n i q u es a l t - t o l e r a n c em e c h a n i s md u r i n gl o n g t e r me v o l u t i o n a r yh i s t o r y i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h r e es a l t t o l e r a n c er e l a t e dg e n e sa c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h dw e r ei s o l a t e df r o mas s hl i b r a r yo f a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mt h r o u g hr a c e b a s e do nt h ea n a l y s i so ft h e i rc d n as e q u e n c e sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e s ，w ef o u n d t h a tt h e ya l lh a dc h a r a c t e r i s t i c so f g e n e se n c o d i n gn a + h + t r a n s p o r t e r a m o n gt h e s e g e n e s ，a c n h x ia n da c n h x 2c o m i n gf r o mt h en h xg e n ef a m i l y , a n da c n h x i a c n h x 2m a yl o c a l i z et ot o n o p l a s t ，w i t ham a j o r f u n c t i o ni nv a c u o l a r c e m p a r t m e n t a l i z a t i o no fn 礦：w h i l ea c n h dt o g e t h e rw i t ha f e wk n o w np l a n tn h d g e n e sf o r m e dt h e t h i r dp l a n tn a + wt r a n s p o r t e r - e n c o d i n gg e n eg r o u p ，w h i c hi s d i s t i n c tf r o mt h ea c k n o w l e d g e dp l a n tn h x a n ds o s lg r o u p s r e a l t i m ep c rw a su s e dt od e t e c tt r a n s c r i p tp a t t e r n so f a c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h di nt h el e a fo fa e g i c e r a sc o r n i c u l a m mu n d e rs a l ta n do s m o t i cm a t e r i a l s w e f o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e l so fa c n h x i ，a c n h x 2a n da c n h dn o to n l yh a v e i i i 桐花樹耐鹽相關(guān)皋吲的克降4 ，表返 r e l a t i o nt on a + c o n t e n tb u ta l s oa l er e l e v a n tt ok + c o n t e n ti nt h el e a fo fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u m t h a tt r a n s c r i p t i o nl e v e lo fp l a n tn h d g e n eh a sr e l a t i o nt ok + c o n c e n ti s f i r s td i s c o v e r e di nt h ep r e s e n ts t u d y t r a n s c r i p t i o nc h a n g eo f a c n h x lr e s u l t sm a i n l y f r o mi o ns t r e s s ，s oi t sf u n c t i o ni sp r o b a b l yr e d u c i n gt h ed a m a g eo fi o ns t r e s st op l a n t c e l l w h i l et r a n s c r i p t i o no fa c n h x 2m a yb ei n d u c e db yo s m o t i cs t r e s s ，a n dh a sa p r o b a b l ef u n c t i o ni nr e d u c i n gt h ed a m a g eo fo s m o t i cs t r e s s t o p l a n tc e l l t h e t r a n s c r i p t i o np a t t e mo fa c n h d w a ss i m i l a rt oa c n h x i ，w h i c hs u g g e s t si tm a yb e r e g u l a t e dl i k ea c n h x l t h et r a n s c r i p t i o n a l p a t t e r n o fa c n h x 2u n d e rt r e a t m e n t sw i t hd i f f e r e n t b i o c h e m i c a l si ss i m i l a rt ot h a to fa t n h x ia n da t n h x 2i na r a b i d o p s i s t h u s ， a c n h x 2m a yb er e g u l a t e db yt h es a m es i g n a lp a s s w a ya sa b ad e p e n d e ds i g n a l p a s s w a yi na r a b i d o p s i sa n dm a yh a v et h es a n l ef u n c t i o na sa t n h x la n da t n h x 2i n a r a b i d o p s i s h o w e v e lt h et r a n s c r i p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fa c n h x lu n d e rt r e a t m e n t s w i t hd i f f e r e n tb i o c h e m i c a l sa r ed i f f e r e n tf r o ma n yo t h e rk n o w np l a n tn h x g e n e s o u r r e s u l t si n d i c a t et h a tt h em o l e c u l a rs a l t - t o l e r a n tm e c h a n i s m so fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u mn o to n l yh a v es o m ec o m m o n sw i t ho t h e rp l a n t s ，b u ta l s oh a v ei t su n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s ， t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n i i x la n da c n h da r ed i f f e r e n tu n d e rt r e a t m e n t s w i t h2 5 0 m mn a c ia n d5 0 0 m mn a c l ，r e s p e c t i v e l y t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n h x la n da c p 5 c s ，k + n dr a t i o ，p r o l i n ec o n t e n ta r ei n c r e a s e da tt h ee a r l ys t a g eo f t h es a l t s t r e s sp r o c e s s ，a n dt h e na l ed e c r e a s e da f t e rt h ep e a kv a l u e s b o t ho fw h i c h i n d i c a t e st h a ta e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mh a sd i f f e r e n ta d a p t a t i o nm e c h a n i s m su n d e r s a l t s t r e s sw i t hd i 舵r e n tc o n c e n t r a t i o na n dt i m e k e y w o r d s ：s a l tt o l e r a n c e ，a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ，n a + wt r a n s p o r t e r s ，p r o l i n e 中山大學(xué)碩：l 論文桐花樹耐赫相關(guān)基因的克隧與表達(dá) 1 1 文獻(xiàn)綜述 第1 章引言 1 1 1 植物耐鹽分子機(jī)理研究進(jìn)展 植物要在高鹽環(huán)境中生存，就必然有其相應(yīng)的抗鹽機(jī)理?？偟膩碚f，植物抗 鹽機(jī)理可以分為三類：一是避鹽機(jī)理，指植物不讓外界鹽分進(jìn)入體內(nèi)從而避免鹽 脅迫，主要依靠細(xì)胞對鹽的不透性來適應(yīng)鹽漬化環(huán)境：二是緩解機(jī)理，主要指通 過固定、稀釋、化學(xué)去活和泌鹽等方法消除鹽脅迫傷害；三是耐鹽機(jī)理，指通過 代謝或生理過程來適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)高鹽環(huán)境的現(xiàn)象( 李曉燕等，2 0 0 4 ) 。對于高等植 物而言，其細(xì)胞體內(nèi)的酶通常都是不耐鹽的，而在高鹽環(huán)境下，植物細(xì)胞內(nèi)的鹽 濃度又往往會不可避免地提高，因此通過耐鹽機(jī)理束維持植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微環(huán)境的 穩(wěn)定對于植物適應(yīng)高鹽環(huán)境有著至關(guān)重要地作用。 從分子生物學(xué)水平而吉，鹽脅迫對植物造成的不利影響主要有以下四方面： 一方面由于植物生長環(huán)境中的溶質(zhì)濃度過高對植物細(xì)胞產(chǎn)生滲透壓脅迫，以及由 此引發(fā)的植物缺水；另一方面因為高鹽環(huán)境中植物與外界的離子交換失常而使植 物體內(nèi)離子平衡發(fā)生改變，從而產(chǎn)生的離子脅迫，其主要表現(xiàn)為：n a + 和c l _ 在植 物體內(nèi)的富集和k + 的流失以及由此引起的n a + o 一比例改變而( e d u a r d o ，2 0 0 0 ； a p s ee ta 1 。2 0 0 2 ) 。第三方面是鹽脅迫還破壞植物體內(nèi)性氧代謝系統(tǒng)( a p s e e ta 1 ， 2 0 0 2 ；李曉燕等。2 0 0 4 ) ；最后，鹽脅迫還對植物的生長相關(guān)調(diào)節(jié)造成嚴(yán)重影響 ( z h u , 2 0 0 l b ) 。在以上的四方面中，離子脅迫和滲透壓脅迫被認(rèn)為是鹽脅迫對 植物造成的主要次級脅迫，已得到了較為全面深入研究。相應(yīng)的，植物的耐鹽分 子機(jī)理亦可分為四個方面：1 、植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡的維持；2 、細(xì)胞滲透壓的調(diào) 節(jié)；3 、生成抗氧化劑減少活性氧傷害；4 、生長相關(guān)調(diào)節(jié)。 1 1 1 1 植物細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)平衡的維持 細(xì)胞內(nèi)的離子動態(tài)平衡是植物存活與生長的基礎(chǔ)條件之一，要有效維持細(xì)胞 中山人學(xué)碩i ，論義 桐花樹耐鹽相關(guān)是閃的克降j 表達(dá) 內(nèi)有害離子低濃度水平和聚集細(xì)胞所需離子就必需適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子流 動( z h u ，2 0 0 3 ) 。目前，針對植物在能脅迫下如何維持細(xì)胞內(nèi)離子動念平衡的研 口 究主要集中在降低細(xì)胞液中n a + 和c 1 濃度，提高k + 濃度的分子機(jī)理上( z h u 。 2 0 0 1 a ；b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；a p s ee ta 1 ，2 0 0 2 ：m a n s o u r ，2 0 0 3 ；z h u ，2 0 0 3 ) 。 n 植物細(xì)胞內(nèi)n a + 的濃度維持 植物細(xì)胞內(nèi)n a + 濃度維持主要通過調(diào)控n a + 進(jìn)入細(xì)胞、n a + 排出細(xì)胞和n a + 的區(qū)室化區(qū)隔化( c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n ) 來實現(xiàn)，在這些過程中又必然會涉及到 n a + 流動的能量束源以及信號調(diào)節(jié)途徑的問題，下面就這些方面逐一進(jìn)行論述。 ( 1 ) n a + 進(jìn)入細(xì)胞 已知的n a + 進(jìn)入植物細(xì)胞方式有三種：通過高親合力的k + 轉(zhuǎn)運蛋白；通過 非選擇性的離子通道和通過蒸騰流。 在擬南芥中，n a + 通過高親合力的k + 轉(zhuǎn)運蛋白a t h k t l 轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞已經(jīng)得 到了實驗的證實( r u s ae ta 1 ，2 0 0 1 ；m a 7s e fe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。小麥中也有類似發(fā)現(xiàn) ( l a u r i ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。a m t m a n na n ds a n d e r s ( 1 9 9 9 ) 發(fā)現(xiàn)n a + 可以通過非選擇性 離子通道進(jìn)入細(xì)胞。此外，y e 等( 1 9 9 9 ) 的實驗表明，在水稻中，n 礦可以利用 蒸騰流進(jìn)入植物體內(nèi)，而這種過程受到硅的抑制。 ( 2 ) n a + 排出細(xì)胞 與n a + 排出細(xì)胞相關(guān)的基因中，研究最為深入的是模式植物擬南芥中的s o s i 基因。大量研究表明，a t s o s l 是一種定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的n a + w 轉(zhuǎn)運蛋白的編碼 基因，其編碼的蛋白能夠?qū) a + 通過細(xì)胞質(zhì)膜排出體外( s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ；q u i n t e r o e ta 1 ，2 0 0 2 ；q i ue ta 1 ，2 0 0 2 ；s h ie la 1 ，2 0 0 2 a ) ，提高彳t s o s l 表達(dá)量能使擬南芥耐 鹽能力得到增強(qiáng)( s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。另外，鹽脅迫能使爿t s o s l 的表達(dá)上調(diào)，卻不 能增= c j i m t s o s l 啟動子的活性，但是當(dāng)a t s o s l 與花椰菜花葉病毒( c a u l i f l o w e r m o s a i cv i r u s ) 3 5 s 啟動子相連時，其表達(dá)卻能受到鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，因此，鹽 脅迫對表達(dá)的調(diào)節(jié)可能時發(fā)生在轉(zhuǎn)錄自u 水平。( s h ie t a l ，2 0 0 0 ： s h i e t a l ，2 0 0 3 ； w a r de ta l ，2 0 0 3 ) 。 中山大學(xué)碩上論文 桐花樹耐鹽相關(guān)肇w 的克隆與表達(dá) 除了對a t s o s i 的研究外，g a x i o l a 等( 2 0 0 1 ) 發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達(dá)a v p i 能夠提高植物耐鹽能力。n i u 等( 1 9 9 3 ) 發(fā)現(xiàn)鹽土植物濱藜細(xì)胞質(zhì)膜上的一些 r c - a t p a s e g e n e 基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)。j u l i a n a 等( 2 0 0 7 ) 在水稻中克隆得到 a t s o s l 的功能同系物o ss o s i ，研究表明o ss o s l 能夠替代a t s o s l 的功能。 ( 3 ) n a + 的區(qū)隔化 為了減少對細(xì)胞的傷害，植物細(xì)胞除了將n a + 外排外，還能通過將n a + 聚集 于一些細(xì)胞器中達(dá)到維持細(xì)胞液中低n a + 濃度的目的。n a + 的區(qū)隔化主要發(fā)生在 液泡中，質(zhì)體和線粒體也能聚集一些n a + ( b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；y o k o ie ta 1 ，2 0 0 2 ；a p s e e ta 1 ，2 0 0 2 ；z h u ，2 0 0 3 ) ，將n a + 隔離在液泡中，不但可以降低細(xì)胞液中n a + 的濃 度，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，使細(xì)胞能在高赫環(huán)境中吸收水分( z h u , 2 0 0 3 ) 。 n h x 基因在n a 十的液泡區(qū)隔化中起著關(guān)鍵作用。在本論文的第一章1 2 部分 將做詳細(xì)介紹。 ( 4 ) n a + 流動的能量來源 細(xì)胞內(nèi)n a + 流動的能量主要來源于a t p a s e s 通過水解a t p 推動質(zhì)子跨過細(xì)胞 內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生的膜兩側(cè)電化學(xué)梯度( d u p o n t , 1 9 9 2 ；s z e ，1 9 8 5 ；s e r r a n o 。e t a 1 ，1 9 8 9 ；p a l m g r e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；g a r b a r i n oe ta 1 ，1 9 8 8 ；s t a a le ta 1 ，1 9 9 1 ) 。m a n s o u r 等( 2 0 0 3 ) 認(rèn)為，在細(xì)胞質(zhì)膜上，質(zhì)膜a t p 酶( p - a t p a s e s ) 水解a t p 所產(chǎn)生的 質(zhì)子梯度為質(zhì)膜上的n a + h + 轉(zhuǎn)運蛋白將n a + 運出細(xì)胞提供了能量；類似的，在液 泡膜上，液泡膜a t p 酶( v - a t p a s e s ) 和液泡膜焦磷酸酶( v - p p a s e ) 所產(chǎn)生的質(zhì) 子梯度為質(zhì)膜上的n a + h + 轉(zhuǎn)運蛋白將n a + 運入液泡提供能量。主要關(guān)系圖1 - 1 所 示： 中山人學(xué)塒。論文 荊化樹耐豁相關(guān)基洲的克降j 表_ i 占 m 馘fm a m c 榭r 斟d | p l = ms d t n 撐| 甜，2 0 0 3 ；a 糾一9 0 0 圖1 - 1 植物細(xì)胞內(nèi)n a + f i 蔬動的能量來源示意圖( 引自m a n s o u r e t a l 。2 0 0 3 ) f i g 1 - 1r e s o u r c eo f e n e r g yf o rt h ef l u xo f n a + i np l a n tc e l l 有研究表明，在艙脅迫下，甜土植物傾向于將n a + 通過質(zhì)膜外排( l a u c h l ie t a 1 ，1 9 9 0 ) ，而鹽土植物則傾向于將n a + 和c l 留在液泡膜中( g r e e n w a ye ta 1 ，1 9 8 0 ) 。 ( 5 ) 信號調(diào)節(jié)途徑 目耵所知的與離子平衡相關(guān)信號調(diào)節(jié)途徑主要來自于對甜土模式植物擬南 芥的研究。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 在總結(jié)i i 人研究植物逆境脅迫相關(guān)信號途徑的基礎(chǔ) 上( i s h i t a n ie ta 1 ，1 9 9 8 ；z h u ，2 0 0 1 a ；s h i n o z a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ；) ，結(jié)合實驗分析得出 擬南芥的n a + h + 轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因參與的耐鹽相關(guān)信號途徑至少有三條：滲 透壓通過a b a 、m y c m y b 作用元件活化a t n h x l ；離子脅迫通過s o s 3 、s o s 2 活化s o s l ，再由s o s l 將n a + 外排；離子脅迫通過類似但不同于s o s l 的途徑 活化4 小h 耵。( 如圖1 2 所示) 中山人學(xué)碩1 ：論文桐花樹耐鹽相關(guān)基閃的克隧嚀表達(dá) 圖1 2 高滲透壓、離子脅迫調(diào)節(jié)彳t n h x i 。2 和5 的信號途徑( 引n y o k o ie t a 1 ，2 0 0 2 ) f i g 1 2h y p e r o s m o t i ca n di o n i cs t r e s ss i g n a l l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t ea t n h x l 2 a n dj e x p r e s s i o n 不久之后，z h uj k 于2 0 0 3 年提出了著名的s o s 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其主要觀點 為：細(xì)胞中過量的n a + 和高滲透壓能夠分別被尚未研究清楚的傳感器感受到； n a + 濃度增高所引發(fā)的信號能通過c a + 傳給s o s 3 s o s 2 蛋白激酶復(fù)合物，該復(fù) 合物可以活化s o s i ，從而將n a + 排出細(xì)胞外；另一方面，高滲透壓所引發(fā)的 信號能導(dǎo)致a b a 的合成，而a b a 將使a t n h x l 和其他一些基因的轉(zhuǎn)錄水平上 調(diào)，進(jìn)而通過a t n h x l 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)加快將細(xì)胞液中n a + 的運入液泡產(chǎn)生區(qū)隔化效 應(yīng)；n a + 的積累有可能通過抑制a k t ! 進(jìn)而阻礙的k + 攝入。( 如圖1 3 所示) 進(jìn)一步的研究表明，液泡膜上的n a + w 轉(zhuǎn)運蛋白也受到s o s 途徑調(diào)控，而s o s 途徑本身也有分支( q i ue t a l , 2 0 0 4 ) ?？梢娪嘘P(guān)n a + h + 轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的信號 調(diào)節(jié)是極為復(fù)雜的，仍有待進(jìn)一步深入研究。 5 中山人學(xué)頌l ：論文 桐托樹耐鹽相關(guān)基吲的克降表達(dá) 圖1 3 在赫脅迫下維持細(xì)胞液中低n a + 濃度的離子轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)、活性調(diào)節(jié)信 號途徑( 引自z h u 2 0 0 3 ) f i g 1 3s i g n a l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t et h ee x p r e s s i o na n da c t i v i t i e so f i o n t r a n s p o r t e r st om a i n t a i nal o wc y t o p l a s m i cc o n c e n t r a t i o no f n a + u n d e rs a l ts t r e s s o 植物細(xì)胞內(nèi)心的濃度維持 關(guān)于植物細(xì)胞內(nèi)維持k + 濃度的分子機(jī)理研究并不深入，但也有一些實驗證明 部分與k + 轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因調(diào)控受到赫脅迫影響，如：豁脅迫會導(dǎo)致擬南芥根中的 k 5 轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因a t k c l 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)( p i l o t e t a l 。2 0 0 3 ) ，而在另一些植物 ( c o m m o ni c ep l a n t ) 中鹽脅迫能提高k m t l k t k a t 基因家族成員) 和一些 h a k k u p ( 高親和性k + 轉(zhuǎn)運蛋白k + 攝入轉(zhuǎn)運蛋白) 的轉(zhuǎn)錄水平，同時降低刪丌 似k t k a t 基因家族的另一成員) 的轉(zhuǎn)錄水平( s u e ta 1 ，2 0 0 1 ；s ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 這些受到赫脅迫調(diào)節(jié)的基因可能與植物耐鹽相關(guān)，但需要進(jìn)步的實驗證明。 1 1 1 2 細(xì)胞滲透調(diào)節(jié) 鹽分的次生脅迫主要是滲透脅迫，其對植物引起的主要脅變是細(xì)胞脫水。植 物主要通過避脫水來適應(yīng)這種次生脅迫，而最有效的避脫水措施就是植物細(xì)胞的 滲透調(diào)節(jié)。所謂滲透調(diào)節(jié)，是指植物生長在滲透脅迫條件下，其細(xì)胞在滲透上 有活性和無毒害的溶質(zhì)( 滲透保護(hù)物質(zhì)) 主動凈增長的過程，這種增長的結(jié)果是 6 中山人學(xué)碩士論文桐花樹耐鹽相關(guān)基閡的克隆與表達(dá) 細(xì)胞濃度增加，滲透勢降低，使其在低滲透勢生境種能夠吸收水分( 林棲 風(fēng), 2 0 0 4 ) 。y a n e e y 等( 1 9 8 2 ) 認(rèn)為，滲透保護(hù)物質(zhì)是一類無毒的小分子復(fù)合物， 除了增加滲透壓外，還有在細(xì)胞內(nèi)起穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的作用。a p s e 等( 2 0 0 2 ) 認(rèn)為，通過在細(xì)胞液中聚集滲透保護(hù)物質(zhì)，能夠增加細(xì)胞液的滲透勢， 從而使植物細(xì)胞在細(xì)胞外界高滲壓和液泡內(nèi)聚集高濃度n a + 、c l 的情況下仍然有 可能保持質(zhì)膜和液泡膜內(nèi)外的滲透壓平衡。從短期來看，這種平衡可以避免細(xì)胞 失水；就植物在鹽脅迫環(huán)境下長期生存而言，這種平衡能夠維持細(xì)胞的正常形態(tài)， 吸水和生長。 目前研究比較多的滲透保護(hù)物質(zhì)，主要有脯氨酸( k i s h o r e t a l 1 9 9 5 ；r o o s e n s e t a l ，1 9 9 9 ；h o n g e t a l ，2 0 0 0 ；h u a e t a l ，2 0 0 1 ；n a n j oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、甜菜堿( r o n t e i n e ta 1 ，2 0 0 2 ；r a t h i n a s a b a p a t h i ，2 0 0 0 ；s a k a m o t oe la 1 ，2 0 0 0 ；h a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 7 ； p r a s a de ta 1 ，2 0 0 0 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 、四氫嘧啶( o n oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、海藻糖 ( g o o d i j ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 等。但這些物質(zhì)的具體作用方式、調(diào)節(jié)機(jī)理在目前仍不是 完全清楚。其中，脯氨酸的分子機(jī)理已有較為深入的研究。 早在1 9 9 5 年，k i s h o r 等就發(fā)現(xiàn)在煙草中過量表達(dá)脯氨酸合成途徑前兩步的關(guān) 鍵基因a 1 一p y r r o l i n e - 5 - - e a r b o x y l a t es y n t h a s e ( p 5 c s ) 和a l - p y r r o l i n e - 5 - c a r b o x y l a t e r e d u c t a s e ( p 5 c r ) 能夠有效提高轉(zhuǎn)基因植物中的游歷脯氨酸含量，然而，植物體內(nèi) 的脯氨酸代謝卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此。更為深入的研究表明，植物體內(nèi)的游離脯氨酸能 夠抑制脯氨酸降解的關(guān)鍵酶脯氨酸脫氫酶，并得到了實驗證據(jù)的支持( r o o s e n s e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同時，p 5 c r 基因啟動子分析表明p 5 c r m r n a 的翻譯水平在脯氨酸 濃度增高的情況下下降，而5 非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一段9 2 b p 的序列在鹽脅迫條件下使 p 5 c r m r n a 更為穩(wěn)定，并抑制其翻譯( h u ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，n a n j o 等人( 2 0 0 0 ) 還通過反義c d n a 轉(zhuǎn)化降低脯氨酸脫氫酶表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥的脯氨酸水 平在無鹽脅迫條件下和鹽脅迫條件下分別為未轉(zhuǎn)基因擬南芥中脯氨酸水平的兩 倍( 1 0 0 u g g 鮮重) 、三倍( 6 0 0 u g g 鮮重) 。 1 1 1 3 生成抗氧化劑減少活性氧傷害 鹽脅迫給植物帶來傷害的另一個主要方面是由活性氧自由基r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( r o s ) j 粼( z h u 2 0 0 1 b ) ?；钚匝踝杂苫侵参锏娜~綠體和線粒體代謝 7 中山人學(xué)壩| 論文 0 花樹耐鹽相關(guān)皋川的克降j 表達(dá) 在逆境脅迫下發(fā)生改變而生成的類有害物質(zhì)，包括超氧陰離子s u p e r o x i d e r a d i c a l s ( 0 2 一) 、過氧化氫、h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) 、羥基自由基h y d r o x y lr a d i c a l s ( o h ) 等( a p s e e la 1 ，2 0 0 2 ) 。它們對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、膜脂質(zhì)等成分造 成嚴(yán)重傷害( h a l i w e l le ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 為了避免活性氧自由基的傷害，植物細(xì)胞內(nèi)一些與氧化還原相關(guān)的酶發(fā)揮了 重要的作用。r o x a s 等( 1 9 9 7 ) 研究表明，過表達(dá)谷胱甘肽過氧化物酶( g x p ) 和谷胱甘肽s 轉(zhuǎn)移酶( g s t ) 的煙草在鹽脅迫條件下能夠比未轉(zhuǎn)基因的煙草對照 株更好地萌發(fā)和生長。k o v t u n 等人( 2 0 0 0 ) 的研究表明，一種能夠介導(dǎo)氧化脅迫 反應(yīng)的有絲分裂原活化蛋白激酶n p k i 與耐鹽相關(guān)。另外，在擬南芥的一種突變 體p s t l 中， 由于與氰化脅迫相關(guān)的一個負(fù)調(diào)控子發(fā)生了突變，從而使筇r ，突變 體擁有了比詐常擬南芥更加耐鹽的能力( t s u g a n ee ta 1 1 9 9 9 ) 。 此外，z h u ( 2 0 0 0 ) 認(rèn)為一些滲調(diào)劑如：甘露醇、果聚糖、海藻糖、芒丙醇、 脯氨酸、氨基乙酸等和一些非酶的蛋白質(zhì)如：大麥h v a l 、c b f d r e b s 能夠增強(qiáng) 植物耐鹽能力很可能也與減少植物細(xì)胞內(nèi)活性氧有關(guān)。其中具有代表性的推測 是：s h e n 等( 1 9 9 7 ) 通過將甘露醇引入植物葉綠體的方法提高植物抗性，由于 葉綠體是植物細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧自由基的主要細(xì)胞器之一，所以這種抗性被認(rèn)為 很可能是由于進(jìn)入葉綠體的甘露醇清除了其中的活性氧自由基而產(chǎn)生的。 1 1 1 4 生長相關(guān)調(diào)節(jié) 鹽脅迫對植物的危害最終表現(xiàn)為抑制植物的詎常生長，而植物的生長是由其 細(xì)胞的生長和分裂構(gòu)成的。因此，通過影響細(xì)胞生長、分化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控 而造成抑制植物的正常生長也是鹽脅迫對植物危害的主要方面之一。有關(guān)這一方 面的分子機(jī)理研究并不深入，但仍有部分受鹽脅迫影響的植物生長相關(guān)基因得到 了實驗證明。 w a n g 等( 1 9 9 8 ) 研究表明，在擬南芥中，脫落酸能夠誘導(dǎo)一種細(xì)胞周期依賴 性蛋白激酶抑制子i c k l ，其產(chǎn)物i c k i 蛋白能夠通過降低細(xì)胞周期依賴性蛋白的 活性來抑制細(xì)胞分裂。而赫脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)脫落酸的合成增加，從而通過使 i c k l 表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞分裂減少最終實現(xiàn)抑制植物的生長。 此外，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻髅{迫相關(guān)基因c b 刀。d 兄融，爿4 乃培7 能夠減緩被轉(zhuǎn)入 中山大學(xué)碩士論文 桐花樹耐鹽相關(guān)基瞰的克隆與表達(dá) 這些基因的植物生長( l i ue t a l ，1 9 9 8 ；h j e l l s t r o me ta 1 ，2 0 0 0 ；h o l m s t r o me ta 1 ， 1 9 9 6 ) ，而這些基因都與植物細(xì)胞生長、分裂相關(guān)，能夠抑制植物生長( l i u e ta 1 ， 1 9 9 8 ；s o d e n n a ne ta l 一19 9 6 ) 。 1 1 2 w x 基因研究進(jìn)展 植物n h x 基因的主要功能是編碼植物細(xì)胞液泡膜上的n a + h + 轉(zhuǎn)運蛋白，將 細(xì)胞液中n a + 運入液泡，從而維持細(xì)胞液中的低n a + 濃度，保持細(xì)胞內(nèi)的離子平 衡，這對于植物在鹽脅迫條件下生存有著至關(guān)重要的作用。( n a s se ta 1 ，1 9 9 7 ； a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ；b l u m w a l dc ta 1 ，2 0 0 0 ；h a s e g a w ae ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；) 因此，關(guān)于植物n h x 基因的研究長期是耐鹽相關(guān)基因研究中的熱點，其中又以 擬南芥n h x 基因家族最為清楚。 1 2 2 1a t n h x 基因家族研究進(jìn)展 在a t n h x 基因功能方面，早在1 9 9 9 年，o a x i o l a 等的研究就表明擬南芥中 與酵母n h x 基因同源的基因a t n h x l 能夠抑制酵母n h x l 突變體的一些表型，并 且用2 5 0 r a mn a c l 或2 5 0 m mk c i 處理6 小時會引起擬南芥中的a t n i - i x i m r n a 增加。q u i n t e r o 等( 2 0 0 0 ) 也通過類似的實驗證明了a t n h x l 能夠替代酵母n h x l 的功能，并且n a c i 和a b a 都能提高a t n h x i 的轉(zhuǎn)錄水平。d 訓(xùn)e y 等( 2 0 0 0 ) 進(jìn) 一步證明了a t n h x l 能夠使細(xì)胞液中的n a + 進(jìn)入液泡。 在a t n h x 的編碼蛋白定位、轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面，a p s e 等( 1 9 9 9 ) 的研究證實了 a t n h x l 蛋白定位于液泡膜上。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 也通過實驗證實了a t n h x 2 同 樣定位于液泡膜上，并且通過n o r t h e r n 技術(shù)發(fā)現(xiàn)a t n h x l ，a t n i - 1 x 2 在擬南芥莖、 根中都有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，a t n h x 3 在根中轉(zhuǎn)錄明顯而在莖中僅有弱轉(zhuǎn)錄，a t n h x 5 在 莖、根中有轉(zhuǎn)錄，a t n h x 4 、a t n h x 6 在莖、根中轉(zhuǎn)錄不明顯；s l l i 和z h u ( 2 0 0 2 b ) 通過實驗發(fā)現(xiàn)a t n i - i x l 在擬南芥生長發(fā)育的各階段都有表達(dá)，因而很可能具有抗 鹽之外的普通生理功能，并且a t n h x l 在n a c ! 、a b a 、k c ! 誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄水平上 調(diào)，而干旱和寒冷脅迫則不能，同時，通過對比不同擬南芥突變體( a b i l j ， a b i l 2 ，a b a 2 - 1 、a b a 3 ，s o s l ，s o s 2 、s o s 3 ) 在n a c ! 、a b a 處理下的轉(zhuǎn)錄 情況，得出a t n h x l 的表達(dá)依賴a b a 而非s o s 途徑。另外其編碼蛋白很可能與 9 山人學(xué)碩i ：論文枷1 飩樹耐鹽相關(guān)基斟的克降j 表達(dá) k + 的轉(zhuǎn)運有關(guān)。 后來的許多轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灦歼M(jìn)步展現(xiàn)了a t n h x l 對植物耐鹽的重要作用，其 。 巾具代表性的成果有：擬南芥中a t n h x l 的過表達(dá)能使其生長于2 0 0 m mn a c l 中，并伴隨有a t n h x l 的活性、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、編碼蛋白都升高的現(xiàn)象( a p 睇e ta 1 。 1 9 9 9 ) ；被轉(zhuǎn)入a t n h x l 的番茄能在2 0 0 m mn a c i 中生長、結(jié)果，并且其果實中 不富集n a c i ，因而不影響其食用( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) ；被轉(zhuǎn)入a t n h x l 的小麥能 詛極高鹽堿條件下具有高于普通小麥的萌發(fā)率和產(chǎn)量，并能保持細(xì)胞內(nèi)的低n a + 島k + 水平( x u ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 此外，眾多的研究表明，a t n h x 基因是植物耐鹽相關(guān)信號途徑中的重要組 成成分。( 詳見本文第一章的1 1 1 1 ( 5 ) 信號調(diào)節(jié)途徑) 1 2 2 2 其它植物n h x 基因研究進(jìn)展 隨著擬南芥中a t n h x 基因家族的重要性為人們所逐漸認(rèn)識，其他植物的n h x 叢因克隆和表達(dá)、功能研究也在不斷地進(jìn)行著。 關(guān)于單子葉植物中j 科基因的研究主要有：f u k u d a 等( 1 9 9 9 ) 克隆得到水稻 的n h x l ，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析推測其定位于液泡膜上。之后，f u k u d a 等( 2 0 0 4 b ) 進(jìn)一步通過試驗證明其編碼蛋白確實定位于液泡膜，而且其轉(zhuǎn)錄水平在n a c i 、 k c i 作用下上調(diào)，將o s n h x l 轉(zhuǎn)入水稻后能有效提高轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽能力。w u 等 ( 2 0 0 5 )