AB7500熒光定量PCR儀使用維護校準標準操作規(guī)程.docx

sop04006 page 29 / 29文件名稱ab7500熒光定量pcr儀使用、維護、校準標準操作規(guī)程使用維護標準操作規(guī)程頒發(fā)部門制訂人： 復(fù)核人： 批準人： 質(zhì)保部制訂日期：復(fù)核日期：批準日期：執(zhí)行日期版本1.0編號sop04006制作份數(shù)_份發(fā)送部門修訂記錄修訂人修訂原因修訂內(nèi)容版本修訂日期1. 目的：確保熒光定量pcr儀能夠正確和正常的使用，保證擴增及結(jié)果分析的標準化、規(guī)范化。2. 范圍：適用于ab7500熒光定量pcr儀的使用及維護。3. 定義：無4. 職責(zé)：熒光定量pcr儀使用人員負責(zé)本規(guī)程的實施。質(zhì)保部對本規(guī)定的有效執(zhí)行承擔(dān)監(jiān)督檢查責(zé)任。5. 內(nèi)容：5.1 室內(nèi)溫度控制在1530，相對濕度4575%。5.2 儀器操作5.2.1 依次打開電腦顯示器和電腦主機的電源開關(guān)，進入windows界面。5.2.2 接著打開ab7500儀器電源開關(guān)，預(yù)熱10分鐘。5.2.3 點擊7500 software v2.3圖標，打開軟件。5.2.4 按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測的8聯(lián)pcr反應(yīng)管或者96孔pcr反應(yīng)板放入檢測孔位，記下放置位置。檢測8聯(lián)pcr反應(yīng)管用*反應(yīng)孔模塊，檢測96孔pcr反應(yīng)板用*反應(yīng)孔模塊。（檢測8聯(lián)pcr反應(yīng)管需放入蓋緊管蓋的空8聯(lián)pcr反應(yīng)管配平，檢測96孔pcr反應(yīng)板無需配平）5.2.5 再次按壓托盤使其滑入儀器。5.2.6 新建擴增參數(shù)模板：例如新建一個ug-63-62的模板，擴增參數(shù)是95，10；（95，10；63，45）5 cycles；（95，10；62，35）40 cycles，在62時收集熒光信號（hex、fam信號），20l反應(yīng)體系。5.2.6.1 在setup-plate setup-define targets and samples中，將target name下的target1改成fam；點擊add new target，將新增的target1改成hex，點擊reportee下拉菜單，選擇vic。5.2.6.2在setup-run method-graphical view中的reaction volume per well后面輸入20（20l反應(yīng)體系）。選中第一個holding stage，點擊delete selected刪除；在cycling stage中的number of cycles后輸入5，在step1中輸入時間10秒，在step2中輸入溫度63度，輸入時間45秒，將63度下面收集熒光圖標點掉；點擊add stage下拉菜單選擇cycling，在cycling stage中的number of cycles后輸入40，在step1中輸入時間10秒，在step2中輸入溫度62度，輸入時間35秒，在62度下面點擊圖標收集熒光。5.2.6.3 點擊save下拉菜單下的save as tamplate，文件名輸入ug-63-62，保存在默認ab7500-config-tamplates文件夾內(nèi)，關(guān)閉設(shè)置界面。5.2.7 已有擴增參數(shù)模板：在軟件home界面中點擊template，選擇需要的模板，點擊打開。例如：ug-63-62，其擴增參數(shù)就是95，10；（95，10；63，45）5 cycles；（95，10；62，35）40 cycles，在62時收集熒光信號（hex、fam信號），reaction volume per well:20l（20l反應(yīng)體系）。5.2.8 在setup-plate setup-assign targets and samples中選擇8聯(lián)管擺放的位置，全部勾選sample 1；ugt1a1*6勾選hex，ugt1a1*28勾選fam。5.2.9 在run-amplification plot中點擊start run，命名為20140101-1（當(dāng)日日期+當(dāng)日上機次數(shù)，例:2014年1月1日第1次上機編號為20140101-1），保存在默認文件夾中，開始運行。5.2.10 結(jié)果分析5.2.10.1 pcr反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，對擴增曲線進行分析。5.2.10.2 也可根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end值以（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在315、end值可設(shè)在520），threshold值（rn）推薦設(shè)定為500015000，點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄每個反應(yīng)的ct值。5.2.11實驗結(jié)束后取出反應(yīng)管（切勿打開管蓋），順序關(guān)閉ab7500軟件、定量pcr儀電源，關(guān)閉電腦。5.3 儀器維護5.3.1 每周維護5.3.1.1 檢查計算機磁盤空間。如需要，將實驗文件歸檔或備份。 至少每周檢查一次計算機磁盤空間。 如果硬盤的可用空間不足其總?cè)萘康?0%，應(yīng)將較陳舊的數(shù)據(jù)傳輸?shù)絺浞荽鎯υO(shè)備上保存。5.3.1.2 關(guān)閉控制7500 instrument的計算機，30秒后再次開啟計算機。5.3.1.3 用無絨布塊（不脫毛）蘸取75%酒精清潔7500 instrument的表面。（注：切勿使用有機溶劑清潔7500 instrument。）5.3.1.4 使用75%酒精浸泡反應(yīng)管托架（晾干后放回儀器內(nèi)）。5.3.2 每月維護5.3.2.1 執(zhí)行背景校準。（可執(zhí)行一次背景校準以檢查是否存在污染物）5.3.2.2 運行磁盤清理和磁盤碎片整理。 至少每月一次。 當(dāng)windows操作系統(tǒng)顯示消息提示執(zhí)行碎片整理時。 切勿同時運行磁盤管理實用工具和7500 real-time pcr software。5.3.3 每半年（6個月）維護5.3.3.1 檢查燈具狀態(tài)。在7500 software中，選擇instrumentlamp status/replacement以確定鹵素?zé)舻臓顟B(tài)。顯示lamp status/replacement對話框： condition 表示以下其中一種狀況： good 燈具工作良好，不需要更換。單擊close。 failed 必須更換燈具。單擊close，然后按照5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)簟?change soon 燈具使用超過2000小時；生產(chǎn)商建議將其更換。單擊close，然后決定是否更換燈具。如果決定更換，請按照5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)簟?usage (hours) 燈具已照明的總小時數(shù)。 lamp current 燈具的輸出電流，以安培為單位(a)。低電流意味著燈具可能將要失效。 date last replaced 上次更換燈具的日期。在執(zhí)行一次運行之前或期間，7500 software可能顯示以下警告：消息描述warning cannot detect sufficientcurrent from lamp. either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.在運行開始時，燈具電流低于可接受水平。在按照5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)艟咧埃瑹o法繼續(xù)該運行。warning cannot detect sufficientcurrent from lamp. either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.7500 software停止了該次運行，因為在運行中燈具電流下降到可接受水平之下。在按照5.3.4.3步驟更換鹵素?zé)艟咧?，無法繼續(xù)該運行。在消息框中單擊ok，檢查儀器日志，然后更換燈具。warning - the lamp usage hasexceeded 2000 hr. we recommendreplacing the lamp soon to ensure optimal assay performance.在運行開始時，燈具使用時間超過2000小時。單擊cancel run，然后更換燈具，或者單擊continue run。重新運行roi、背景、光學(xué)和染料校準。5.3.3.2 執(zhí)行目標區(qū)（roi）校正。5.3.3.3 執(zhí)行背景校準。5.3.3.4 執(zhí)行光學(xué)校準。5.3.3.5 執(zhí)行染料校準。5.3.3.6 執(zhí)行rnase p儀器驗證試驗。5.3.4 其它維護任務(wù)（需要時執(zhí)行）5.3.4.1 樣本塊污染清除。 執(zhí)行以下程序，去除7500 instrument樣本塊的熒光污染。熒光污染是導(dǎo)致背景運行失敗的常見原因，在此情況下，一個或多個反應(yīng)孔會持續(xù)表現(xiàn)出異常的高信號。注意！切勿移去設(shè)備上的蓋板。7500 instrument中沒有用戶可安全維修的組件。如果懷疑存在問題，請聯(lián)系生產(chǎn)商服務(wù)代表。 全程戴上一次性無粉手套操作。找到樣本塊中受污染的反應(yīng)孔（參閱5.4.2.13 “如何確定污染”）。從7500 real-time pcr instrument中取出反應(yīng)板和托盤支架。a.按壓托盤門，將其打開。b.取出反應(yīng)板和托盤支架。c.關(guān)閉托盤門。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力。手動降低樣本塊：a.在7500 software中，選擇 instrumentinstrument maintenance manager。b.在instrument maintenance manager的roi選項卡中，單擊start manual calibration。c .在roi inspector對話框中，單擊move block。d.當(dāng)roi inspector對話框顯示“block down”時，單擊done。關(guān)閉7500 real-time pcr instrument，然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。打開7500 real-time pcr instrument的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內(nèi)，然后推動以解開門栓。b.打開儀器前門。抬起門栓，然后將受熱的護蓋門推到儀器的背面。使用少量的雙蒸水，清潔樣本塊中被污染的反應(yīng)孔：a.用移液管吸取少量雙蒸水并滴入每個受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的雙蒸水?dāng)?shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的雙蒸水水吸入廢液瓶中。d.使用棉花拭子，擦試每個被污染的反應(yīng)孔的內(nèi)壁。e.使用無絨布料，吸出殘余的雙蒸水。7500 real-time pcr instrument將受熱的護蓋門拉到儀器的正面。抬起門栓，然后將受熱的護蓋門緊固到交叉桿。打開7500 real-time pcr instrument的檢查門。插上電源插頭并開啟7500 instrument。通過執(zhí)行背景校準運行確認已消除污染（參閱5.4.2 “背景校準”）。如果污染仍然存在，重復(fù)步驟至，然后使用95%乙醇溶液清潔樣本塊中受污染的反應(yīng)孔：a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每個受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的溶液數(shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的乙醇溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應(yīng)孔之后，應(yīng)始終使用雙蒸水沖洗反應(yīng)孔。重復(fù)步驟至，以沖洗樣本塊的反應(yīng)孔，并驗證已清除掉污染物。如果污染仍然存在，重復(fù)步驟至，然后使用10%漂白劑溶液清潔樣本塊中受污染的反應(yīng)孔：a.用移液管吸取少量10%漂白劑溶液并滴入每個受污染的反應(yīng)孔中。b.抽吸并滴入反應(yīng)孔中的溶液數(shù)次，以沖洗反應(yīng)孔。c.將用過的漂白劑溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應(yīng)孔之后，應(yīng)始終使用去離子水沖洗反應(yīng)孔。重復(fù)步驟至，以沖洗樣本塊的反應(yīng)孔，并驗證已清除掉污染物。如果仍有污染，請與生產(chǎn)商技術(shù)支持聯(lián)系。確保受熱蓋門完全關(guān)閉并上閂。如果沒有，則7500 software顯示錯誤消息。5.3.4.2 移動pcr儀。（更換或移動光學(xué)器件的任何部件后，必須執(zhí)行roi校準、背景校準、光學(xué)校準、染料校準以及rnase p儀器驗證。）5.3.4.3 更換鹵素?zé)簟Ｈ檀魃弦淮涡詿o粉手套操作。關(guān)閉7500 instrument，然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。a.注意！灼熱。7500 instrument和燈具灼熱！燈具在使用中會變得非常灼熱。在處理燈具之前，應(yīng)允許燈具冷卻15分鐘，并戴上無粉防護手套。b.重要！為避免灼傷及縮短新燈具的使用壽命，處理燈具時請戴上一次性無粉手套。c.注意！7500 instrument按設(shè)計僅可使用12v、75w的鹵素?zé)?。打開 7500 instrument 的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內(nèi)，然后推動以解開門栓。b.打開儀器前門。 從儀器中取出燈具：a.向下滑動燈具釋放桿。b.用手緊緊地抓住鹵素?zé)舨⑾蛏咸?，使燈具從安裝槽口中脫出。 a b查看燈具并確定有無故障跡象（有故障的燈具內(nèi)壁上通常有碳黑層）。將新燈具安裝至儀器上：a.向上滑動燈具釋放桿。b.用手緊緊地握住燈具，將燈具放入帶槽口的安裝座內(nèi)，然后小心地向下滑動燈具，使其到位。關(guān)閉儀器前門。插上電源插頭并開啟7500 instrument。打開 roi inspector對話框：a.在 7500 software 中，選擇 instrumentinstrument maintenance manager。b.在instrument maintenance manager的roi選項卡中，單擊start manual calibration。在roi inspector對話框中，選擇lamp controlidle。當(dāng)儀器運行時，通過檢查門上的縫隙觀察，確保燈具發(fā)光，然后單擊done。如果燈具發(fā)光，在7500 software中選擇instrumentlamp status/replacement，單擊reset lamp timer，然后單擊ok。如果燈具不發(fā)光，則替換的鹵素?zé)艨赡苡腥毕?。重新更換燈具。如果再次更換燈具后仍不發(fā)光，檢查儀器的保險絲是否存在故障（參閱第 71 頁）。更換燈具后，按順序執(zhí)行以下校準。請參閱： 5.4.1 目標區(qū)（roi）校準 5.4.2 背景校準 5.4.3 光學(xué)校準 5.4.4 染料校準 5.4.5 驗證儀器性能5.3.4.4 更換7500 instrument保險絲。保險絲損壞時，更換7500 real-time pcr instrument保險絲。（注意！為在長時間內(nèi)防止火災(zāi)，更換保險絲時請使用類型和額定值與儀器原始保險絲相同的經(jīng)認可的保險絲。）全程戴上一次性無粉手套操作。關(guān)閉儀器電源，并拔下電源插頭。使用平口螺絲刀從儀器上旋松并卸下保險絲座。將每一個保險絲從其保險絲座中取出，然后檢查是否損壞。損壞的保險絲內(nèi)部通常有炭黑覆蓋。使用12.5a、250v、520mm保險絲更換損壞的保險絲。注：電壓和電流額定值見保險絲座。安裝保險絲座。插上電源插頭，然后開啟儀器。如果儀器接通了電源，說明保險絲已安裝成功。注：保險絲損壞可能是由儀器供電電源波動導(dǎo)致。為了防止繼續(xù)出現(xiàn)故障，可以考慮安裝電氣保護設(shè)備，例如ups或其他電涌保護器。5.3.4.5 更新windows操作系統(tǒng)。5.3.4.6 更新7500 software。5.3.4.7 監(jiān)控儀器狀態(tài)（使用function test對話框?qū)χ饕?500 instrument組件執(zhí)行高級診斷。一般情況下不需要執(zhí)行功能測試，除非懷疑有硬件故障，或者life technologies代表指示這樣做。）在7500 software中，選擇instrumentfunction-test。根據(jù)需要執(zhí)行功能測試。要測試：l 所有組件單擊all tests，然后等候軟件執(zhí)行所有功能測試。l 一個或多個特定組件單擊以下其中一項或多項。 usb測試 7500 real-time pcr instrument和計算機之間的通用串行總線(usb)連接。如果7500 software能夠和7500 real-time pcr instrument建立通信，則表示測試通過。 ccd測試7500 real-time pcr instrument內(nèi)的ccd攝像機。如果攝像機能夠拍攝圖像，則表示測試通過。 filter wheel測試7500 real-time pcr instrument內(nèi)的過濾輪。如果過濾輪控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。 shutter測試7500 real-time pcr instrument的光學(xué)快門。如果快門控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。 lamp測試7500 real-time pcr instrument的鹵素?zé)?。如果燈具控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。 thermal cycler測試7500 real-time pcr instrument內(nèi)的熱循環(huán)儀樣本塊。如果熱循環(huán)儀的控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。當(dāng)7500 software完成一項測試時，軟件報告該測試的通過/失敗狀態(tài)，并提供結(jié)果描述。結(jié)束測試時，單擊close。5.4 儀器校準5.4.1 目標區(qū)（roi）校準5.4.1.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.1.2 從貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中取出roi校準反應(yīng)板。5.4.1.3 讓roi校準反應(yīng)板溫度上升至室內(nèi)溫度（約需5分鐘）。在立即運行反應(yīng)板之前，不要從包裝袋內(nèi)取出roi校準反應(yīng)板。反應(yīng)孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間曝光可降低染料在反應(yīng)板中的熒光。5.4.1.4 從包裝袋中取出roi校準反應(yīng)板。將光學(xué)薄膜留在反應(yīng)板上。不要丟棄存放roi校準反應(yīng)板的包裝袋。若貯存于原始包袋中，反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。5.4.1.5 振蕩roi校準反應(yīng)板5秒鐘。5.4.1.6 用板式離心機將反應(yīng)板離心2分鐘。roi校準反應(yīng)板必須充分混合并離心。5.4.1.7 確認roi校準反應(yīng)板每個反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更高的轉(zhuǎn)速及更長的時間離心反應(yīng)板。5.4.1.8 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對齊。（裝入標準反應(yīng)板，使a12凹口位置位于托盤的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力，從而關(guān)閉托盤門。5.4.1.10 執(zhí)行自動roi校準 在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。 在instrument maintenance manager的roi選項卡中，單擊start calibration。 按照向?qū)У闹甘荆瓿尚?。roi calibration對話框顯示三個選項卡： setup顯示roi校準設(shè)置說明。單擊next提示可以打開run選項卡。 run單擊start run可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊next提示可以打開analysis選項卡。 analysis指明校準狀態(tài)（passed/failed）。如果校準失敗，請參閱5.4.1.13 “排除roi校準故障”。5.4.1.11 執(zhí)行手動roi校準 在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。 在instrument maintenance manager的roi選項卡中，單擊start manual calibration。 在roi inspector對話框中（如圖1）：a.在exposure time字段中，輸入2048。b.選擇filter a（濾光器1）。圖1 單擊snapshot，生成一張roi圖像。 確定roi圖像是否可接受（下圖所示為未飽和以及過飽和的圖像）?？山邮軋D像中的反應(yīng)孔： 在不過飽和的前提下，必須盡可能明亮。（生成roi校準時，如果反應(yīng)孔過飽和，則顯示一條警告。） 可以含有但不是必須含有紅色像素（表示飽和）。未飽和正常飽和過度飽和可接受不可接受 如果roi圖像可接受，轉(zhuǎn)至步驟。如果roi圖像過飽和，將exposure time降低一半，然后單擊snapshot。重復(fù)執(zhí)行，直至獲得可接受的roi圖像。如果無法獲得可接受的圖像，請參閱5.4.1.13 “排除roi校準故障”。 單擊generate calibration。7500 software采集一張截圖，然后顯示一個消息框或roi圖像：如果軟件顯示：執(zhí)行：或a. 單擊ok。b. 將exposure time降低一半（參閱5.4.1.11步驟a）。c. 重復(fù)步驟和。roi 圖像非常模糊或者無法成功校準。請參閱5.4.1.13 “排除roi校準故障”?？山邮艿男蕡D像注：在所有反應(yīng)孔周圍出現(xiàn)綠色圓圈，表示反應(yīng)孔成功校準。注：綠色圓圈表示反應(yīng)孔位置的目標區(qū)已足夠亮。驗證以下各項：wells found值為96。成功校準wells found必須為96。在roi圖像上每個反應(yīng)孔區(qū)的周圍顯示綠色圓圈。 單擊save calibration。軟件保存濾光器1新產(chǎn)生的roi校準。在roi inspector的filter masks loaded區(qū)域，“ok”出現(xiàn)在濾光器1旁邊。 對其余濾光器重復(fù)步驟至，對每個濾光器執(zhí)行校準之前，將exposure time重置為 2048。當(dāng)所有濾光器的filter masks loaded都顯示ok時，roi校準完成。當(dāng)所有濾光器的filter masks loaded都是ok時，校準完成。 點擊 done。5.4.1.12 拆卸反應(yīng)板（注意！灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過100c。若剛使用過儀器，在樣本塊恢復(fù)至室溫之前，請勿觸摸樣本塊。）取出校準反應(yīng)板：a.按壓托盤門，將其打開。b.取出校準反應(yīng)板。c.按壓托盤門，將其關(guān)閉。將校準反應(yīng)板放入其包裝套中。如果要執(zhí)行背景和光學(xué)校準：a.在接下來的8小時，將roi校準反應(yīng)板置于室溫下。光學(xué)校準使用roi校準反應(yīng)板。b.第二天將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中。c.重要！不要丟棄校準反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套內(nèi)貯存，在打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板3次。d.重要！執(zhí)行roi校準后，也必須執(zhí)行背景校準、光學(xué)校準、染料校準以及儀器驗證。5.4.1.13 排除roi校準故障問題/癥狀可能原因行動roi 校準失敗樣本塊可能位于降低的位置。1.如果roi inspector的ccd control/settings顯示“block up”，則單擊block up將樣本塊升高。2.檢查確認受熱的蓋組件已被全程向前拉出，以確保托盤可以被正確推入。如果7500 instrument安裝了受熱蓋栓，檢查確認蓋栓處于鎖定位置。3.如果roi校準仍然失敗，檢查7500 instrument內(nèi)的鹵素?zé)魻顟B(tài)（參閱5.3.3.1 “監(jiān)控?zé)艟郀顟B(tài)”），然后，如果需要時，更換燈具（參閱5.3.4.3 “更換鹵素?zé)簟保oi 圖像模糊5.4.2 背景校準5.4.2.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.2.2 從貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中取出準備好的背景反應(yīng)板。5.4.2.3 讓背景反應(yīng)板溫度上升至室溫（至少需要5分鐘）。5.4.2.4 從包裝袋中取出背景反應(yīng)板。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若將背景反應(yīng)板貯存在其原始包裝套內(nèi)，背景反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。）5.4.2.5 振蕩反應(yīng)板5秒鐘。5.4.2.6 用板式離心機將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認反應(yīng)板每個背景反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應(yīng)板。5.4.2.7 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力，從而關(guān)閉托盤門。（注：如果無法打開托盤，樣本塊可能位于其“升高”位置，鎖定了托盤門位置。要降低樣本塊，選擇 instrumentcalibrate，然后退出roi inspector。）5.4.2.8 在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。在instrument maintenance manager中，選擇background選項卡。在background選項卡中，單擊start calibration。5.4.2.9 按照向?qū)У闹甘?，完成校準。background calibration對話框顯示四個選項卡： overview顯示校準相關(guān)信息。 setup顯示背景校準設(shè)置說明。單擊next提示可以打開run選項卡。 run單擊start run可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊next提示可以打開analysis選項卡。 analysis指明校準狀態(tài)(passed/failed)。如果校準失敗，請參閱5.4.2.12 “排除背景校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.2.10 校準完成后，取出校準反應(yīng)板：按壓托盤門，將其打開。取出校準反應(yīng)板。按壓托盤門，使其滑入儀器。5.4.2.11 將校準反應(yīng)板放入其包裝套內(nèi)，并將包裝好的反應(yīng)板放回冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中。（重要！ 不要丟棄校準反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套內(nèi)貯存，在初次打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板3次。）5.4.2.12 排除背景校準故障問題/癥狀可能原因行動背景校準失敗背景反應(yīng)板上的一個或多個反應(yīng)孔產(chǎn)生的光譜超過儀器的最高限度。1.使用相同的背景反應(yīng)板重復(fù)執(zhí)行校準。2.若校準再次失敗，請使用另一不同的背景反應(yīng)板重復(fù)執(zhí)行校準。3.若校準再次失敗，請按下文“如何確定污染”的說明，確定污染源。5.4.2.13 如何確定污染 若信號超過正常背景熒光的限度，則表明校準反應(yīng)板或樣本塊上存在熒光污染物。常見污染物包括記號筆中殘存的油墨、一次性手套灑落的粉末及灰塵。欲確定污染來源和位置：在查看原始數(shù)據(jù)時，選擇反應(yīng)板布局中數(shù)塊連續(xù)的較小區(qū)域，以找出受污染反應(yīng)孔的位置。將背景反應(yīng)板旋轉(zhuǎn)180，然后再次執(zhí)行背景校準。重復(fù)步驟以找出污染物的位置。如果步驟和中找到的包含污染物的反應(yīng)孔位置： 相同則表明樣本塊中含有污染物。請按照“5.3.4.1 樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。 相反則表明背景反應(yīng)板中含有污染物。丟棄當(dāng)前使用的背景反應(yīng)板，并使用新背景反應(yīng)板執(zhí)行背景校準程序。如果更換背景反應(yīng)板并且取出樣本塊的污染后校準失?。簩⒂煤诩埜采w的反應(yīng)板裝入7500 instrument。按照本章的說明，執(zhí)行背景校準程序。校準完成后，選擇反應(yīng)板布局中的所有反應(yīng)孔。查看光譜圖譜中的峰值。如果峰值： 可見則表明7500 instrument的光學(xué)部件可能已被污染。請與生產(chǎn)商聯(lián)系。 不存在則表明樣本塊已被污染。請按照“5.3.4.1 樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。5.4.3 光學(xué)校準5.4.3.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.3.2從貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中取出roi校準反應(yīng)板。5.4.3.3 讓roi校準反應(yīng)板溫度上升至室溫（至少需要5分鐘）。5.4.3.4 從包裝袋中取出roi校準反應(yīng)板，振蕩反應(yīng)板5秒鐘。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若將roi校準反應(yīng)板貯存在其原始包裝套內(nèi)，roi校準反應(yīng)板最多可重復(fù)使用三次。）（如果執(zhí)行roi校準后，將roi校準反應(yīng)板保持在室溫，則跳到步驟5.4.3.5，以減少在反應(yīng)板在室溫時形成的冷凝。如果roi校準反應(yīng)板位于冷凍柜中，轉(zhuǎn)至步驟5.4.3.2。5.4.3.5 用板式離心機將反應(yīng)板離心2分鐘。roi校準反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認roi校準反應(yīng)板每個反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應(yīng)板。5.4.3.6 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力，從而關(guān)閉托盤門。5.4.3.7 在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。在instrument maintenance manager中，選擇optical選項卡。在optical選項卡中，單擊start calibration。5.4.3.8 按照向?qū)У闹甘?，完成校準。optical calibration對話框顯示四個選項卡： overview顯示校準相關(guān)信息。 setup顯示光學(xué)校準設(shè)置說明。單擊next提示可以打開run選項卡。 run單擊start run可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊next提示可以打開analysis選項卡。 analysis指明校準狀態(tài)(passed/failed)。如果校準失敗，請參閱5.4.2.12 “排除背景校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.3.9 取出校準反應(yīng)板：按壓托盤門，將其打開。取出校準反應(yīng)板。按壓托盤門，使其滑入儀器。5.4.3.10 將校準反應(yīng)板放入其包裝套中。將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中。（重要！不要丟棄校準反應(yīng)板。如果將反應(yīng)板裝在其原始包裝套內(nèi)貯存，在打開其包裝后最多可重復(fù)使用反應(yīng)板3次。）5.4.4 染料校準5.4.4.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.4.2 從冷凍柜中取出光譜校準套件，并從套件內(nèi)取出所有染料反應(yīng)板。5.4.4.3 將光譜校準套件放回冷凍柜貯藏。5.4.4.4 讓染料反應(yīng)板溫度上升至室內(nèi)溫度（約需5分鐘）。（重要！在立即運行之前，請勿從包裝袋內(nèi)取出染料反應(yīng)板。在每個染料反應(yīng)板上，反應(yīng)孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間暴露在光線中會降低反應(yīng)板的熒光信號強度。）注：如果將7500 real-time pcr instrument染料反應(yīng)板貯存在其原始包裝內(nèi)并放在冷凍柜中， 則在打開包裝后6個月內(nèi)可以校準7500 real-time pcr instrument最多3次。5.4.4.5 在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。在instrument maintenance manager中，選擇dye選項卡。在dye屏幕上，選擇system dye calibration。單擊start calibration。5.4.4.6 按照向?qū)У闹甘?，完成每個反應(yīng)板的校準。（重要！在每個校準中，向?qū)为氈甘?。必須獨立設(shè)置、運行和分析每個染料反應(yīng)板。）dye calibration對話框顯示四個選項卡： overview顯示校準相關(guān)信息。當(dāng)軟件提示獲取需要的材料時，選擇要校準的染料。 setup顯示染料校準設(shè)置說明。單擊next提示可以打開run選項卡。當(dāng)軟件提示裝入染料反應(yīng)板時，按照步驟5.4.4.10所述準備并裝載反應(yīng)板。 run單擊start run可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊next提示可以打開analysis選項卡。 analysis指明校準狀態(tài)(passed/failed)。當(dāng)軟件提示分析從每個染料反應(yīng)板采集的光譜時，核實校準的狀態(tài)： passed7500 instrument校準通過。轉(zhuǎn)到步驟5.4.4.11的。 failed7500 instrument校準失敗。請參閱5.4.4.15 “排除染料校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.4.7 將軟件所需的染料反應(yīng)板從其包裝中取出。振蕩反應(yīng)板5秒鐘。（重要！不要丟棄存放反應(yīng)板的包裝袋。若貯存于原包袋中，反應(yīng)板最多可重復(fù)使用3次。5.4.4.8 用板式離心機將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認反應(yīng)板每個背景反應(yīng)孔中的液體均位于反應(yīng)孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應(yīng)板。5.4.4.9 檢查并確保要裝入的染料反應(yīng)板與在7500 software中選取的熒光匹配。5.4.4.10 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對齊。關(guān)閉托盤門。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力。（注：如果無法打開托盤，樣本塊可能位于其“升高”位置，鎖定了托盤位置。要降低樣本塊，選擇instrumentcalibrate，然后退出roi inspector。）5.4.4.11 因為向?qū)γ總€染料校準單獨提供指示，所以請對校準的每個染料執(zhí)行以下程序。ab驗證校準狀態(tài)： passed7500 instrument校準通過。轉(zhuǎn)到b）。 failed7500 instrument校準失敗。請參閱5.4.4.15 “排除染料校準故障”。核實染料光譜的分組：a.在反應(yīng)板布局中，選擇反應(yīng)板的孔。b.檢查原始數(shù)據(jù)。對于每個光譜，請確認峰值： 位于7500 instrument的可檢測范圍內(nèi)。 無不規(guī)格光譜峰值。 出現(xiàn)在染料的正確通道上。如果某光譜不符合上述標準，請參閱5.4.4.15 “排除染料校準故障”。注：在含有相同染料的各反應(yīng)孔中，光譜位置和峰值位置的差異是由于不同反應(yīng)孔之間的光學(xué)屬性及激發(fā)能存在細微差異而引起的。若所有光譜均可接受，則單擊next。5.4.4.12 取出校準反應(yīng)板：（注意！ 灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過 100c。若剛使用過儀器，在樣本塊恢復(fù)至室溫之前，請勿觸摸樣本塊。）按壓托盤門，將其打開。取出校準反應(yīng)板。按壓托盤門，將其關(guān)閉。將校準反應(yīng)板放入其包裝套中。將放入包裝套的反應(yīng)板放回貯存在冷凍柜內(nèi)的光譜校準套件中。（注：如果將7500 real-time pcr instrument染料反應(yīng)板貯存在其原始包裝內(nèi)并放在冷凍柜中，則在打開包裝后6個月內(nèi)可以校準7500 real-time pcr instrument最多3次。）5.4.4.13 在按照指示將染料反應(yīng)板取出后，單擊finish。5.4.4.14 按照5.4.4.1開始操作，準備并運行下一個反應(yīng)板。濾光器峰值(nm)染料/光譜1-520fam染料 sybr green染料 2-550joe染料 vic染料 3-580cy3染料 ned染料 tamra染料 4-610rox染料 texas red染料 5-670cy5 染料5.4.4.15 排除染料校準故障問題/癥狀可能原因行動一個或多個原始光譜達到或低于校準的可檢測閾值。光譜校準反應(yīng)板未充分離心。光譜校準反應(yīng)板含有陳舊試劑或試劑體積不足。若正運行定制光譜校準反應(yīng)板，染料可能濃度不足。1.卸載 7500 instrument 并查看光譜校準反應(yīng)板的反應(yīng)孔。若反應(yīng)孔中的液體不是： 位于反應(yīng)孔底部，請將反應(yīng)板離心更長時間，然后重復(fù)執(zhí)行校準。 體積相等，則表明反應(yīng)板未密封致使試劑揮發(fā)。請將其丟棄，并運行另一反應(yīng)板。2.若光譜校準反應(yīng)板顯示正常， 則丟棄該反應(yīng)板并運行另一塊反應(yīng)板。3.如果問題依然存在，請與生產(chǎn)商聯(lián)系。注：若正運行定制光譜校準反應(yīng)板，請創(chuàng)建另一反應(yīng)板但要增加產(chǎn)生不足信號的染料的濃度。一個或多個原始光譜超過7500 instrument的最高限量。樣本塊或光譜校準反應(yīng)板含有熒光污染物。若正運行定制光譜校準反應(yīng)板，染料可能濃度過大。請按照5.4.2 “背景校準”操作，以確認是否存在污染物。若背景校準未顯示樣本塊含有污染物，則光譜校準反應(yīng)板可能含有污染物。注：若正運行定制光譜校準反應(yīng)板，請創(chuàng)建另一反應(yīng)板但要降低超過可檢測限量的染料的濃度。光譜在一個以上的濾光器中含有峰值。樣本塊或光譜校準反應(yīng)板含有熒光污染物。5.4.5 驗證儀器性能5.4.5.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.5.2 冷凍柜中取出taqman rnase p 96-well instrument verification plate，然后讓反應(yīng)板溫度上升到室溫（大約需要5分鐘）。5.4.5.3 從包裝袋中取出rnase p反應(yīng)板。振蕩反應(yīng)板5秒鐘。5.4.5.4 用板式離心機將反應(yīng)板離心2分鐘。反應(yīng)板必須充分混合并離心。確認液體位于反應(yīng)板每個反應(yīng)孔底部。如果不是，則再次以更長的時間離心反應(yīng)板。（重要！注意不要讓rnase p反應(yīng)板的底部染上塵污。反應(yīng)板底部沾上的液體和其它污染物可污染樣品區(qū)組，導(dǎo)致異常高的背景信號。）上圖為rnase p反應(yīng)板上標準和未知種群的分布情況。rnase p反應(yīng)板包括五個重復(fù)組的標準物（1250、2500、5000、10,000和20,000拷貝）、兩個未知重復(fù)組（5000和10,000拷貝）和陰性對照反應(yīng)孔(nc)。5.4.5.5 按壓托盤門，將其打開。將反應(yīng)板裝入儀器中的反應(yīng)板架。確保放置時反應(yīng)板在反應(yīng)孔板適配器中被正確對齊。關(guān)閉托盤門。以一定角度向托盤右側(cè)施加壓力。5.4.5.6 開始運行反應(yīng)板：在7500 software中，選擇instrumentinstrument maintenance manager。在instrument maintenance manager中，選擇rnase p選項卡。在rnase p屏幕，單擊start rnase p run。5.4.5.7 按照向?qū)У闹甘?，完成校準。rnase p對話框顯示四個選項卡： overview顯示校準相關(guān)信息。 setup顯示rnase p運行設(shè)置說明。單擊next提示可以打開run選項卡。 run單擊start run可以開始運行流程并顯示處理消息。單擊next提示可以打開 analysis選項卡。 analysis指明運行狀態(tài)(passed/failed)。注：開始運行之前，儀器可能暫停（最長10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。注：7500 software完成rnase p運行后，會自動分析運行，并在analysis屏幕顯示結(jié)果。5.4.5.8 在rnase p run向?qū)У腶nalysis屏幕上，確認運行狀態(tài)： passed7500 instrument rnase p運行通過。轉(zhuǎn)到步驟5.4.5.12。 failed7500 instru