液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定無糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖.doc

精品論文，值得推薦液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定無糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖 作者：王浩 劉艷琴 楊紅梅 郭啟雷 史海良 閻龍寶 【摘要】 建立了無糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法。本方法以水提取樣品,以waters carbohydrate analysis柱（300 mm3.9 mm, 10 m）分離，流動(dòng)相為水乙腈（1585， v/v），電噴霧負(fù)離子mrm模式檢測(cè)。方法的檢出限為0.1 g/kg；線性范圍為2.5125.0 mg/l；加標(biāo)回收率為86.297.7；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%8.7。 【關(guān)鍵詞】 液質(zhì)聯(lián)用儀； 無糖食品; 葡萄糖; 果糖; 蔗糖; 麥芽糖; 乳糖 abstract a lcmsms method was developed for the determination of glucose, fructose, sucrose, maltose and lactose in sugarfree products. the mass spectrometer was operated in the negative mode using mrm. in this method, samples were extracted with water and chromatographic separation was carried out using a waters carbohydrate analysis column (300 mm 3.9 mm, 10 m) with a mobile phase of acetonitrilewater(8515, v/v). the limit of detection is 0.1 g/kg and the linear range was obtained from 2.5 to 125.0 mg/l. overall recoveries were between 86.2% and 97.7%, and rsd value were between 3.1and 8.7%. keywords liquid chromatographytandem mass spectrometry; sugarfree products; glucose; fructose; sucrose; lactose 1 引 言 20世紀(jì)70年代，無糖食品問世。最初的無糖食品只是除去食品中的蔗糖或是添加鹽分，隨著新型甜味劑的不斷出現(xiàn)，無糖食品得到迅速發(fā)展，品種由最初的十幾種發(fā)展到上萬(wàn)種。我國(guó)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)gb 134322004預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽通則中規(guī)定：只有符合糖(指所有的單糖和雙糖)在固體或液體食品中的總含量低于0.5 g/100 g(100 ml)，才可以在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)注“無糖”；低糖食品的標(biāo)準(zhǔn)為糖(指所有的單糖和雙糖)在固體或液體食品中的總含量低于5 g/100 g(100 ml)。 目前,檢測(cè)食品單糖和雙糖的方法有化學(xué)法、高效液相色譜法等和質(zhì)譜法9。液相色譜法與現(xiàn)在使用的測(cè)定糖含量的菲林滴定法相比具有靈敏度好、檢測(cè)速度快、適用范圍廣的特點(diǎn)，但是也存在方法檢出限低，排除干擾能力差等缺點(diǎn)。目前，我國(guó)檢測(cè)食品單糖和雙糖的最新標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法gb/t2222.12008食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定 高效液相色譜法中規(guī)定：葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的檢出限均為0.4%，而且，不能消除無糖食品中廣泛添加的糖醇等甜味劑對(duì)單糖和雙糖測(cè)定時(shí)產(chǎn)生干擾。因此，尋求簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高、選擇性好的無糖食品中單糖和雙糖的檢測(cè)方法，才能為我國(guó)無糖食品中單糖、雙糖的日常監(jiān)管工作提供技術(shù)支持，從而保障無糖食品的食用安全。本方法采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定和確證無糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、測(cè)定周期短等優(yōu)點(diǎn)。 2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器與試劑 6410 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（美國(guó)agilent公司）， 配agilent 1200型液相色譜儀； gl88b型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； kq5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）； tgl16m型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。 milliq去離子水發(fā)生器（美國(guó)milliq公司)。 乙腈（色譜純）；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖均購(gòu)自德國(guó)dr. ehrenstorfer公司，純度98%99%。 2.2 分析條件 2.2.1 色譜條件 waters carbohydrate analysis色譜柱（300 mm3.9 mm i.d., 10 m；預(yù)柱： 12.5 mm4.6 mm i.d., 10m）； 流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ；進(jìn)樣量：10 l；流動(dòng)相：水乙腈（1585， v/v）。 2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：大氣壓化學(xué)電離離子源(apci)；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣：n2 ；霧化氣壓力：344.8 kpa；干燥氣溫度：325 ；干燥氣流速：9 l/min；汽化溫度：350 。各種單糖、雙糖的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1。 表1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的質(zhì)譜參數(shù)（略） 2.3 樣品處理 2.3.1飲料等液態(tài)食品 準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.5 ml至50 ml容量瓶中，用水定容，渦旋混勻。準(zhǔn)確吸取此溶液5.00 ml于10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，渦旋混勻。用快速定性濾紙自然過濾（不易過濾的渾濁溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以5000 r/min離心10 min，吸取上清液以0.20 m濾膜過濾）。濾液過0.20 m濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。 2.3.2 糕點(diǎn)等固態(tài)食品 稱取2.5 g樣品(精確至0.01 g)，置于50 ml容量瓶中，用水定容，渦旋混勻，超聲提取30 min。準(zhǔn)確移取提取溶液5.00 ml于10 ml容量瓶中，用乙腈定容，渦旋混勻后用快速定性濾紙自然過濾。濾液過0.20 m濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。 3 結(jié)果與討論 3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 nh2色譜柱是以正相模式分離糖類物質(zhì)的色譜柱，是將氨丙基單體鍵合到高比表面積的球形硅膠載體上而制得。在正相操作條件下，水比乙腈的極性更強(qiáng)。因此，只有當(dāng)測(cè)定溶液中乙腈含量50%時(shí)，才能保證色譜峰的峰形尖銳，否則色譜峰會(huì)展寬；其次，樣品提取液與乙腈11(v/v)混合，可以有效去除提取液的蛋白質(zhì)。綜合以上考慮，實(shí)驗(yàn)采用節(jié)的樣品處理方法，既能減小樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，又能保證測(cè)定溶液中單糖和雙糖色譜峰的完好，同時(shí)除去樣品提取液中蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本處理方法使樣品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖有較高的穩(wěn)定性，并可獲得滿意的提取效率。 3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用直接進(jìn)樣方式分別將每種1 g/l的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源中，在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的分子離子分別為m/z 179， 179， 341.1， 341.1和341.1。以每種糖的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息， 然后再對(duì)得到每種糖的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使每種糖的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，從而得到每種糖的最佳質(zhì)譜參數(shù)(如表1所示)。 3.3 色譜條件的優(yōu)化 3.3. 色譜分離條件選擇 實(shí)驗(yàn)選擇nh2色譜柱以正相模式分離糖類物質(zhì)，選用水和乙腈的混合液為流動(dòng)相。適當(dāng)增加流動(dòng)相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用水乙腈（1585， v/v）時(shí)，可以較好地分離樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖(如圖1所示)。 3.3. 流速及進(jìn)樣量的選擇 本實(shí)驗(yàn)在0.22.0 ml/min范圍內(nèi)考察了流動(dòng)相流速的影響, 發(fā)現(xiàn)流速為1.0 ml/min時(shí)，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖出峰時(shí)間合適, 且峰形較好。 大進(jìn)樣量可提高測(cè)定的靈敏度,但是容易污染色譜柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到10 l時(shí), 靈敏度能達(dá)到要求，且對(duì)色譜柱影響不大。 3.4 線性范圍與檢出限 用50%(v/v)乙腈水溶液逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液（2.5, 5.0, 25, 50.0和2.0 mg/l）分別進(jìn)樣10 l，以樣品的峰面積(y，counts)對(duì)濃度（x， mg/l）進(jìn)行線性回歸（表2），線性范圍為2.5125.0 mg/l。用空白樣品提取液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，在信噪比均大于3的條件下能檢出，將此添加量定為檢出限。按照2.3節(jié)的步驟操作，進(jìn)樣量為10.0 l時(shí)，樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的方法檢出限均為0.1 g/kg。表2 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的工作曲線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（略） 3.5 方法的回收率和精密度 每組準(zhǔn)確稱取無糖糕點(diǎn)樣品6份，,每份2.5 g, 共3組，分別定量加入果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，添加水平分別為0.2， 1.0和5.0 g/kg，按供試品溶液制備方法制備后進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果見表3。從表3可見，平均加標(biāo)回收率為86.2%105.5%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%8.72%（n=6）。表3 無糖糕點(diǎn)樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖加標(biāo)回收率（略） 3.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 利用本方法對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷售的55種無糖或低糖食品（包括：飲料、糕點(diǎn)、餅干、燕麥片、核桃粉、黑芝麻糊、口香糖等）進(jìn)行檢測(cè)。5種糖的含量分別為; 果糖09.06 g/kg；葡萄糖051.05 g/kg；蔗糖0111.36 g/kg；麥芽糖0230.74 g/kg；乳糖045.73 g/kg。55種無糖或低糖食品中，有30種食品的總糖含量(包括果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖等) 小于5 g/kg，占總數(shù)的54.5%。實(shí)驗(yàn)表明，本法樣品操作簡(jiǎn)單， 靈敏度高， 明顯提高了檢測(cè)效率，適用于快速測(cè)定無糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖。 【參考文獻(xiàn)】 1 ma nailiang（馬乃良）, xu sizhao(許思昭), chen meihong(陳美洪), mo lingbin(莫玲賓), wang yaner(王燕兒). modern food science and technology(現(xiàn)代食品科技), 2006， 22（1）： 139141 liu yufeng（劉玉峰）, li li(李 黎), li dong(李 東) , wang jing(王 晶) , fang xiang(方 向), wu fangdi(吳方迪). food science(食品科學(xué)), 2007， 28（3）： 293295 jiang min(姜 岷), lei dang(雷 丹), chen kequan(陳可泉), li jian(李 建), yao jiamin(姚嘉昊), wei ping(韋 萍). chinese j. anal. chem.(分析化學(xué)),2009, 37(4): 6056084 wang jinxia(王金霞), zhao xia(趙 峽), yu guangli(于廣利), li guangsheng(李廣生), hao cui(郝 翠). chinese j. anal. chem.(分析化學(xué)), 2009, 37(5): 6486525 hu changping(胡長(zhǎng)平) . anhui chemical(安徽化工), 2005， 134（2）： 57586 wei yang（魏 泱）, guo liang(郭 亮), ding mingyu(丁明玉). chinese journal of chromatography(色譜), 2001， 19（6）： 5205227 deng yongzhi(鄧永智), li wenquan(李文權(quán)), yuan dongxing(袁東星). chinese