2020年分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文.doc

分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）也被稱為間質(zhì)祖細(xì)胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)、基因治療和細(xì)胞治療的理想種子，已被廣泛進行研究1-3.目前，BMSCs在動物實驗和臨床應(yīng)用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)膠質(zhì)修復(fù)、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破4-6,并且可避免胚胎干細(xì)胞和異基因干細(xì)胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問題，有利于細(xì)胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細(xì)胞的0.001%0.010%7;因此，需要在體外分離純化、培養(yǎng)擴增來滿足臨床應(yīng)用和實驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養(yǎng)有很大的影響8.本試驗通過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養(yǎng)及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養(yǎng)周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎(chǔ)。 1材料與方法 1.1實驗動物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由河南省實驗動物中心提供。 1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細(xì)胞裂解液（北京賽馳生物技術(shù)有限公司）；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。 HF151UV型CO2培養(yǎng)箱（HealForce）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動化儀器廠；數(shù)碼相機：日本佳能IXUS980IS;電子天平：METTLERTOLEDOAL104;超凈工作臺：AIRTECH;FX101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；pH計：上海雷磁儀器廠。 1.3BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復(fù)沖洗，剪斷兩側(cè)干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔于A、B兩個10mL的離心管內(nèi)，直至骨髓腔發(fā)白，1000r/min離心5min,棄上清。 1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細(xì)胞，1000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1100雙抗）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37、5%CO2條件下培養(yǎng)。以后每3d換液1次，待細(xì)胞生長融合至80%時傳代培養(yǎng)。先棄去舊培養(yǎng)液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以12的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.5紅細(xì)胞裂解法B管加入1mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置13min,待液體由紅色變?yōu)榘咨?，加?mLPBS液，1000r/min離心2次，5min/次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1100雙抗）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至3個25cm2培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37、5%CO2條件下培養(yǎng)。 2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細(xì)胞生長融合至80%時傳代培養(yǎng)。先棄去舊培養(yǎng)液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以12的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.6兔BMSCs細(xì)胞活性檢測及生長曲線繪制培養(yǎng)48h時，各取一瓶細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺盼藍(lán)染色，血球計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞（未著色）和死細(xì)胞（著色細(xì)胞）。分別計算出2種不同分離方法的細(xì)胞活性。上述試驗重復(fù)3次。 選取生長良好的P1、P3和P8代細(xì)胞，以2.0104個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計數(shù)，取其平均值為當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)，連測8d,以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。 1.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將用紅細(xì)胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組03代各代培養(yǎng)時間，各代細(xì)胞均保留3瓶。 1.8細(xì)胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細(xì)胞裂解法的P3代細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，常規(guī)SABC免疫組織化學(xué)方法檢測表面抗原CD34、CD、CD45、CD90的表達(dá)。 1.9統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-wayANOVA），用MicrosoftExcel軟件作圖。 2結(jié)果 2.1不同分離方法對兔BMSCs形態(tài)和生長的影響 剛接種時，2種不同分離方法所得的原代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，大小一致，折光性強，不容易區(qū)分。培養(yǎng)48h后，A、B兩組細(xì)胞均可看見有圓形、短梭形、多角形細(xì)胞貼壁。 B組貼壁細(xì)胞較A組細(xì)胞多（圖1）。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細(xì)胞裂解法（B組）為96%.隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，大量細(xì)胞貼壁，并出現(xiàn)典型的BMSCs細(xì)胞集落，緊密排列。 A組細(xì)胞生長較緩慢，所得細(xì)胞純度較低；B組細(xì)胞生長較快，純度較高。原代細(xì)胞達(dá)到傳代的時間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著（P0.05）。B組細(xì)胞P3代細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀生長，細(xì)胞形態(tài)大小均一（圖2）. 2.2兔BMSCs生長曲線繪制 通過細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，對兔BMSCs的生長特性進行鑒定。結(jié)果顯示，P1、P3、P8代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長具有相似的特點：12d細(xì)胞處于潛伏期；36d細(xì)胞處于對數(shù)生長期；68d生長逐漸減慢，開始進入平臺期（圖3）。傳代細(xì)胞生長相對穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞會出現(xiàn)衰老的特征，增殖速度減慢。 2.3兔BMSCs的鑒定 結(jié)果顯示，CD44、CD90抗原表達(dá)陽性，CD34抗原表達(dá)