植物組織培養(yǎng)技術(shù).ppt

1實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備 2實驗基本操作 3培養(yǎng)基的成分及其配制 4培養(yǎng)條件的選擇 植物細(xì)胞工程實驗室及基本操作 1實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備 實驗室是進(jìn)行組培研究的主要場所 應(yīng)能滿足清洗 培養(yǎng)基制備 儲藏 無菌操作 培養(yǎng) 鑒定等多方面的工作 1 基本實驗室 1 1洗滌間根據(jù)工作量的大小決定其大小 一般面積控制在30 50m2 在實驗室的一側(cè)設(shè)置專用的洗滌水槽 用來清洗玻璃器皿 中央實驗臺還應(yīng)配置2個水槽 用于清洗小型玻璃器皿 如果工作量大 可以購置一臺洗瓶機(jī) 準(zhǔn)備1 2個洗液缸 專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿 此外還應(yīng)配置落水架 干燥箱 柜子 超聲波清洗器等 地面應(yīng)耐濕并排水良好 面積60平方米左右 配備的主要儀器設(shè)備有 冰箱 天平 微波爐 pH計 培養(yǎng)基分裝器 藥品柜 器械柜 抽氣泵 電爐 各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)皿 移液管 燒杯 量筒 容量瓶 儲藏瓶等 冰箱以體積180 200L為宜 用于儲存培養(yǎng)基母液 激素維生素等貴重藥品 彩色膠卷 及保存植物材料 天平應(yīng)有不同感量 1 2培養(yǎng)基配制間 配備實驗臺 高壓滅菌鍋 排風(fēng)滅火設(shè)備 細(xì)菌過濾設(shè)備 干熱消毒柜 電爐等 滅菌鍋的選擇應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋 一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋 較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋 生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋 如果沒有條件的話 可以將上述工作間合并成一個準(zhǔn)備間 要求是設(shè)備的安裝和排列要合理 房間要寬敞 明亮 透風(fēng) 地面要便于清潔 防滑 1 3消毒間 無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作 所以又叫接種室 通常由里外兩間組成 外間是緩沖間 用于準(zhǔn)備工作 還有防止污染的作用 緩沖間的門應(yīng)該與接種室的門錯開 兩個門也不要同時開啟 以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌 緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽 實驗臺 鞋帽架 和柜子 紫外燈 無菌操作室的內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修 工作人員進(jìn)入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋 室內(nèi)應(yīng)配有超凈工作臺 紫外燈 解剖鏡 各種接種器械等 1 4無菌操作室 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強(qiáng)度 培養(yǎng)室的房間不要窗戶 但應(yīng)當(dāng)留一個通氣窗 并安上排氣扇 室內(nèi)溫度由空調(diào)控制 光照由日光燈控制 天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修 地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè) 一般要分兩間 一為光照培養(yǎng)室 一為暗培養(yǎng)室 培養(yǎng)室外應(yīng)有一預(yù)備間或走廊 培養(yǎng)室應(yīng)配有培養(yǎng)架 轉(zhuǎn)床 搖床 光照培養(yǎng)箱 生化培養(yǎng)箱 自動控時器等 日光燈一般用40W 固定在培養(yǎng)架的側(cè)面或擱板的下面 每層有兩支日光燈 距離在20cm 光照強(qiáng)度為2000 3000lx 1 5培養(yǎng)室 2 輔助實驗室 2 1鑒定室細(xì)胞學(xué)鑒定室其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究 要求清潔 明亮 干燥 使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染 應(yīng)配置各種顯微鏡 照相系統(tǒng)等 生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中 應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室 以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進(jìn)行取樣檢查 離心機(jī) 酶聯(lián)免疫檢測儀 天平 PCR儀等 為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件 2 2 溫室 1 洗滌液的配制 2實驗基本操作 一 洗滌技術(shù) A 新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì) 可先用0 5 的去污劑洗刷 再用自來水洗凈 然后浸泡在1 2 鹽酸溶液中過夜 不可少于四小時 再用自來水沖洗 最后用無離子水沖洗兩次 在100 120 烘箱內(nèi)烘干備用 2 洗滌方法 先用自來水洗刷至無污物 再用合適的毛刷沾去污劑 粉 洗刷 或浸泡在0 5 的清洗劑中超聲清洗 比色皿決不可超聲 然后用自來水徹底洗凈去污劑 用無離子水洗兩次 烘干備用 計量儀器不可烘干 清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠 否則重洗 若重洗后仍掛有水珠 則需用洗液浸泡數(shù)小時后 或用去污粉擦洗 重新清洗 B 使用過的玻璃儀器的清洗 聚乙烯 聚丙烯等制成的塑料器皿 在生物化學(xué)實驗中已用的越來越多 第一次使用塑料器皿時 可先用8mol L尿素 用濃鹽酸調(diào)pH 1 清洗 接著依次用無離子水 1mol LKOH和無離子水清洗 然后用10 3mol LEDTA除去金屬離子的污染 最后用無離子水徹底清洗 以后每次使用時 可只用0 5 的去污劑清洗 然后用自來水和無離子水洗凈即可 C 塑料器皿的清洗 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌 新的可以用熱洗衣粉水洗凈 需要清洗時 一般用酒精擦洗 然后火焰干燥 E 除菌過濾器用清水沖洗后 用洗液沖洗 再用清水沖洗 最后用蒸餾水沖洗 晾干備用 D 金屬用品洗滌 一 滅菌工作是極其重要的 首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念有菌的范疇 有菌 凡是暴露在空氣中的物體 至少其表面都是有菌的 如植物的表面 超凈工作臺的臺面 未處理的工具和手等 無菌 高壓高溫處理 工具 器皿 培養(yǎng)基等 物理或化學(xué)處理 火烤后的物體 健康的動植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無菌的 有時也有內(nèi)生菌 但不會影響培養(yǎng) 也不會污染 二 滅菌 1 物理方法 干熱 濕熱 過濾 0 25微米 紫外燈 超聲波等 2 化學(xué)方法 使用滅菌劑或抗菌素 如酒精 次氯酸鈉 升汞 漂白粉 高錳酸鉀 雙氧水 福爾馬林等 二 滅菌的方法 干熱滅菌玻璃器皿 器械濕熱滅菌培養(yǎng)基 蒸餾水 器械 棉塞等熏蒸滅菌接種室 培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基 蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械 瓶口 棉塞 包頭紙輻射滅菌接種室 培養(yǎng)間 各種滅菌方法及其使用范圍 適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌 操作方法 150 40min或120 120min 如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌 160 90 120min 1 干熱滅菌 適用于各種器皿 培養(yǎng)基 器皿 蒸餾水 棉塞 紙等 121 維持20 30min注意點(diǎn) 加足水 排盡氣 氣壓降到0時 才能開蓋 2 濕熱滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理 但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解 如某些生長調(diào)節(jié)劑GA3 玉米素等 就需要過濾滅菌 另外酶 血清等也需要過濾滅菌滅菌方法 將生長調(diào)節(jié)劑或酶配成一定濃度 用注射器注入微孔濾膜慮 濾膜孔徑0 22 0 45微米 制培養(yǎng)基時 現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌 待降至50 左右時 加入適量的激素 然后分裝 3 過濾滅菌 主要是利用紫外燈進(jìn)行照射 適合實驗室空氣 操作臺等 滅菌時間20 30min 注意 關(guān)燈后5min后再進(jìn)入 超凈工作臺關(guān)燈后要打開風(fēng)機(jī) 4 射線滅菌 用火焰灼燒達(dá)到滅菌目的 適用于接種器皿的滅菌 5 火焰灼燒滅菌 適用外植體 實驗器皿 操作表面 皮膚等 幾種常用消毒劑的效果比較 6 消毒劑 長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸 方法 甲醛 高錳酸鉀熏蒸 甲醛的用量通常按每立方米空間2 6毫升計算 高錳酸鉀的用量是甲醛的一半 室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后 把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi) 最好在碗或杯下面鋪一張報紙 以利清洗 然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi) 立即出屋關(guān)門 幾秒鐘后 甲醛溶液即沸騰揮發(fā) 高錳酸鉀是一種氧化劑 當(dāng)它與一部分甲醛作用時 由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體 熏蒸滅菌 甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時進(jìn)行 熏蒸后密閉保持4小時以上再進(jìn)入室內(nèi)工作 甲醛對人的眼 鼻有強(qiáng)烈刺激作用 因此 可在使用前用氨進(jìn)行中和 取與甲醛等量的氨水 倒在另一個燒杯里 迅速放入熏蒸室內(nèi) 使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng) 以消除甲醛味 減少對人體的刺激作用 使用氨水應(yīng)在工作前2小時進(jìn)行 對有材料的培養(yǎng)室 也可以采用乙二醇加熱熏蒸 人為因素 工作人員本身 工作服 帽 口罩 酒精擦手 物品因素 器皿和用具 培養(yǎng)皿 洗 熱壓玻璃器皿 洗 干熱 干熱箱 或晾干接種用具 用CCL4布擦 濕布擦 泡75 95 酒精 燒 培養(yǎng)基 濕熱 培養(yǎng)材料 外部細(xì)菌 用水沖洗 化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌 莖尖培養(yǎng)加抗生素 青霉素 利福平 操作的空氣 洗刷地板95 酒精擦超凈工作臺用化學(xué)試劑薰蒸 污染來源 三 無菌操作技術(shù) 1 實驗器具和材料的準(zhǔn)備2 用75 的酒精擦拭超凈工作臺 然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min 30min 注意 臺面上的用品不要放置太多或重疊放置 以免降低滅菌效果 3 關(guān)紫外燈 打開風(fēng)機(jī) 過5 10min進(jìn)入緩沖間 以75 洗手和手臂 更換無菌服 帽子和口罩 進(jìn)入接種室 注 沒有特別情況 盡量不要下工作臺 4 用70 75 的酒精拭擦臺面并消毒雙手 試驗用具也應(yīng)該用酒精消毒 點(diǎn)燃酒精燈 將金屬器械在其火焰上灼燒 冷卻待用 注意 所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行 金屬器械不能過度灼燒 以防退火 移液管不能灼燒 培養(yǎng)瓶口 塑料材料 橡膠材料過火焰不能時間太長 5 取流水沖洗 至少30min 過的外植體 用一定的消毒劑浸泡消毒 用無菌水沖洗3 4次 放入無菌培養(yǎng)皿中 置于酒精燈火焰下方 用無菌的接種器械進(jìn)行分離 切割或其他處理 6 打開培養(yǎng)瓶 瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒 用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上 灼燒鑷子放回 灼燒瓶口 蓋上瓶塞 7 用酒精擦洗工作臺和手 進(jìn)行下一輪操作 注意 1 進(jìn)行培養(yǎng)時 動作要準(zhǔn)確敏捷 但又不必太快 以防空氣流動 增加污染機(jī)會 2 不能用手觸及已消毒器皿 如已接觸 要用火焰燒灼消毒或取備品更換 3 為拿取方便 工作臺面上的用品要有合理的布局 原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè) 左手用品在左側(cè) 酒精燈置于中央 4 工作由始至終要保持一定順序性 組織或細(xì)胞在未做處理之前 勿過早暴露在空氣中 同樣 培養(yǎng)液在未用前 不要過早開瓶 用過之后如不再重復(fù)使用 應(yīng)立即封閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會 5 吸取營養(yǎng)液 細(xì)胞懸液及其它各種用液時 均應(yīng)分別使用吸管 不能混用 以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染 6 工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽 以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染 7 手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方 瓶口最易污染 加液時如吸管尖碰到瓶口 則應(yīng)將吸管丟掉 接種時在近火焰處打開瓶口 使瓶傾斜 以免空氣中微生物落入瓶中 正確錯誤 整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行 且動作要迅速 正確錯誤 接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求 防止操作帶來的污染 正確錯誤 接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口 正確錯誤 瓶蓋朝上放 接種完畢后立即蓋好瓶口 正確錯誤 接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生 種子和分生組織 培養(yǎng)時通常將其貼放在培養(yǎng)基表面 而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部 以免供氧不足 正確錯誤 接種莖段 注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi) 而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中 正確錯誤 用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源 一是生長在自然環(huán)境下的植物 二是在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物 三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物 四 外植體的選擇與處理技術(shù) 1 選擇優(yōu)良的基因型試驗首先要明確目的 例如 蔬菜 作物等的脫毒快繁 是為了脫去病毒 提高產(chǎn)量和質(zhì)量 就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料 并且品種一定要可靠 花卉 觀賞植物的快繁 也應(yīng)選擇有價值的植物 2 取材從生長旺盛 健壯 無病蟲害的植株上取材 母柱代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng) 試驗容易成功 一 外植體的選擇 3 外植體大小選擇因外植體不同而不同 如利用莖尖培養(yǎng) 莖尖大小對脫毒效果非常明顯 再如幼胚培養(yǎng) 胚齡也非常重要 以后具體講 4 選擇外植體的時期外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律 生物鐘 有關(guān) 因此 最好在植物生長的最適宜時期取材培養(yǎng) 會得到較好的結(jié)果 1 取材母株的預(yù)處理人工管理 促進(jìn)母株生長旺盛 代謝活躍 從其上取材培養(yǎng) 容易成功 2 外植體休眠的處理有些植物的種子 幼胚 或芽 存在休眠 為了打破休眠 可利用低溫處理 或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理 因植物不同處理溫度和時間有所不同 二 外植體的處理 3 組織內(nèi)生菌的處理 1 加入抗生素 注意抗生素的用量 高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡 2 取生長期旺盛的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的外植體 3 取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的莖尖不停的轉(zhuǎn)接 3 培養(yǎng)基的成分及其配制一 培養(yǎng)基的成分及其作用 一 無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)的植物組織 器官 細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機(jī)化學(xué)物質(zhì) 除了C H O之外 需要量比較多的元素叫大量元素 需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素 培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克 大量元素包括N P K Ca Mg S 培養(yǎng)基中加入量最多的是N N一般以硝酸鹽或氨鹽 或者兩者結(jié)合的鹽提供 大量元素 微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克 植物所需的微量元素有Fe Cu Zn B Mo Mn Co Cl其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì) 因此要注意微量元素的用量不能過多 多會引起生長抑制等毒害現(xiàn)象 微量元素 二 有機(jī)化合物 有機(jī)物質(zhì)包括維生素類物質(zhì) 氨基酸類物質(zhì) 糖類物質(zhì)和一些其它的有機(jī)添加物1 維生素類物質(zhì)維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能 硫胺素 VB1 與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān) 可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素 而鹽酸吡哆醇 VB6 促進(jìn)根的生長 煙酸 VB3 又稱維生素PP 促進(jìn)胚的發(fā)育 有的配方中還使用了泛酸鈣 VB5 生物素 VH 鈷胺素 VB12 葉酸 VBc Vc等 2 AA類物質(zhì)絕大多數(shù)AA適量時對培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng) 常用的有Gly Asn Gln 在植物組織培養(yǎng)中 有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白 3 糖類糖在培養(yǎng)基的作用 1 為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架2 為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量3 維持滲透壓蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源 葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源 4 其它有機(jī)物質(zhì)1 肌醇 環(huán)己六醇 肌醇可以形成果膠物質(zhì) 是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸 與陽離子結(jié)合或形成磷脂 參與細(xì)胞膜的組成 利于胚和芽的形成2 天然有機(jī)物一些天然的有機(jī)物如椰乳 番茄提取物 酵母提取物 馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng) 并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用 植物激素是在植物體內(nèi)合成的 對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物 而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì) 無機(jī)元素和有機(jī)營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動 只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂 脫分化和再分化 三 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 1 生長素類 1 吲哚類 IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 IPA 吲哚丙酸 2 萘酸類 NAA 萘乙酸 3 苯氧羧酸類 2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 5 T 2 4 5 三氯苯氧乙酸 2 4 5 TP 2 4 5 三氯苯氧丙酸 等 其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在 是生理活性最強(qiáng)的生長素 生長素的生理作用1 促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂2 誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力3 形成愈傷組織 促進(jìn)生根4 與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化 側(cè)芽的萌發(fā)與生長 胚狀體的誘導(dǎo) A NAA0mg L 芽 少 根 無 B NAA0 1mg L 芽 少 根 無 愈傷組織 少量 C NAA5 0mg L 芽 少 根 多 愈傷組織 一定量 ABC 2 細(xì)胞分裂素 是一類腺嘌呤衍生物 主要有激動素 6 糠基氨基嘌呤KT 6 芐基氨基嘌呤 6 BA 和玉米素 ZT 等 其中最常用的是6 芐基氨基嘌呤 功能 1 促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化2 誘導(dǎo)芽的分化3 促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長4 抑制衰老 AB A BA 0mg L 芽 減少 根 增多 愈傷組織 一定量 B BA 0 1mg L 芽 適量 根 適量 愈傷組織 一定量 控制植物細(xì)胞分化 分裂素 生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件比例高時 產(chǎn)生芽 比例低時 產(chǎn)生根 生理作用 1 誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長 對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效 對根無效2 對形成層的細(xì)胞分化有影響 往往同生長素有協(xié)同作用 IAA GA比值高有利于木質(zhì)部的分化 比值低有利于韌皮部的分化 3 破除種子 鱗莖 塊莖休眠 使之提前萌發(fā) 4 對生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用注 不耐熱 應(yīng)采用過濾滅菌加入 3 赤霉素 GA3 生理作用 1 抑制蛋白質(zhì)的合成2 抵消和抑制生長素 細(xì)胞分裂素 GA的作用3 誘導(dǎo)休眠 促進(jìn)衰老和脫落 4 脫落酸 ABA 以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 前兩類用的多 后兩類只是補(bǔ)充 對某些植物有利 對某些植物不僅沒有利 還有害 實際工作中要具體分析 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微 濃度很低 一般用ppm表示1ppm 1mg L 1 固化劑瓊脂 瓊脂糖 用于原生質(zhì)體 細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng) 瓊脂的用量一般在4 10g L 所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力 一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加 瓊脂以顏色淺 透明度好 潔凈的為上品 2 懸浮劑Ficoll 聚蔗糖 四 固化劑和懸浮劑 培養(yǎng)基的種類 根據(jù)無機(jī)鹽的濃度 1 高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基鉀鹽 銨鹽及硝酸鹽含量較高 微量元素種類齊全 比例適當(dāng) 離子平衡性好 具有較強(qiáng)的緩沖性 養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適 廣泛用于植物的器官 花藥 細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng) 主要有MS LS BL BM ER培養(yǎng)基 二 培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇 2 高硝態(tài)氮培養(yǎng)基硝酸鉀含量高 氨態(tài)氮的含量低 含有較高的VB1 主要適合與木本植物 十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng) 主要有B5 N6 SH培養(yǎng)基 3 中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半 微量元素種類減少 但含量較MS的高 維生素種類比MS多 如增加了生物素 葉酸等 適合于花藥培養(yǎng) 主要有Nitch NT H Miller培養(yǎng)基 4 低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素含量大幅度降低而且種類減少 有機(jī)含量相對也很低 多數(shù)用于生根培養(yǎng)基 主要有White Heller WS HE HB 初代培養(yǎng)基 用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基 用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基 根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程 培養(yǎng)基分為 根據(jù)其作用不同 培養(yǎng)基分為 誘導(dǎo)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基 4 根據(jù)其營養(yǎng)水平不同 培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 就是通常稱呼的培養(yǎng)基 主要有MS White N6 B5 改良MS Heller Nitsh SH Miller等 完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上 根據(jù)試驗的不同需要 附加一些物質(zhì) 如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等 MS 6 BA0 5 KT0 5 NAA0 5 Su3 Ag0 7 1 無機(jī)營養(yǎng)成分 一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇 可以參考前人的經(jīng)驗 例如 MS是廣譜性培養(yǎng)基 N6用于單子葉植物的培養(yǎng) 豆科多用B5培養(yǎng)基 2 植物生長調(diào)節(jié)劑 必須進(jìn)行篩選試驗 總體原則 當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時 細(xì)胞分裂素和生長素相對平衡 誘導(dǎo)芽分化時 細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長素 誘導(dǎo)根則要低 3 有機(jī)成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮 如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng) 一般不加復(fù)雜有機(jī)成分 而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加 培養(yǎng)基的篩選 一 貯備液 母液 的配制為什么要配制母液 1 方便2 準(zhǔn)確 有些成分量太小 三 培養(yǎng)基的配制 1 大量元素母液的配制各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍 按順序逐步混合 后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中 即為10倍的大量元素母液 到入細(xì)口瓶 貼好標(biāo)簽保存于冰箱中 配制培養(yǎng)基時 每配1L培養(yǎng)基取此液100ml 注意 1 某些無機(jī)成分如Ca2 SO42一 Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 產(chǎn)生沉淀物 為避免此現(xiàn)象發(fā)生 母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解 藥品采用等級較高的分析純 各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合 混合時應(yīng)注意先后順序 特別應(yīng)將Ca2 SO42一 Mg2十和H2PO4一等離子錯開混合 速度宜慢 邊攪拌邊混合 2 CaCl2 2H2O要在最后單獨(dú)加入 在溶解CaCl2 2H2O時 蒸餾水需加熱沸騰 除去水中的CO2 以防沉淀 另外 CaCl2 2H2O放入沸水中易沸騰 操作時要防止其溢出 微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物 除Fe 組成 微量元素用量較少 特別是CuSO4 5H2O CoCl2 6H2O 因此在配制中分微量 配制 按照表2 表3配方 用感量為0 0001g的分析天平稱量 其它同大量元素 配制培養(yǎng)基時 每配制1L培養(yǎng)基 取微量 10ml 微量 ml 3 鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液 如檸檬酸鐵 只需和大量元素一起配成母液即可 目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物 必須單獨(dú)配成母液 這種螯合物使用起來方便 又比較穩(wěn)定 不易發(fā)生沉淀 配制方法同上 直接用蒸餾水加熱攪拌溶解 配制培養(yǎng)基時 配制1L取此液10ml 在配制鐵鹽時 如果加熱攪拌時間過短 會造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底 此時若將其冷藏 FeS04會結(jié)晶析出 為避免此現(xiàn)象發(fā)生 配制鐵鹽母液時 FeS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合 并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色 約加熱20 30min 調(diào)pH值至5 5 室溫放置冷卻后 再冷藏 4 有機(jī)母液的配制MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸 肌醇 煙酸 鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素 培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制 配制直接用蒸餾水溶解 注意稱量時用電子分析天平 并貯存在棕色無菌瓶中 配制生物素 葉酸 用稀氨水溶解 然后定容 一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0 5mg ml為好 需要注意的是 配制生長素類 例如IAA NAA 2 4 D IBA 應(yīng)先用少量95 乙醇或無水乙醇充分溶解 或者用1mol L的NaOH溶解 然后用蒸餾水定容到一定的濃度 以后者效果好 細(xì)胞分裂素 例如KT 應(yīng)先用少量95 乙醇或無水乙醇加3 4滴1mol L的鹽酸溶解 或直接用1mol LHCl溶解 再用蒸餾水定容 GA3以95 酒精溶解 不耐高溫 過濾滅菌 保存在棕色試劑瓶中 5 植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制 注意 所有母液都要貼上標(biāo)簽 注明名稱 配制倍數(shù) 日期 所有的母液都應(yīng)保存在0 4 冰箱中 若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用 在培養(yǎng)基的配制過程中 常需要用氫氧化鉀或氫氧化鈉和鹽酸來來調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度 1 1摩爾 升KOH液的配制 稱取57 1克KOH 加蒸餾水至1000毫升 2 1摩爾 升NaOH液的配制 稱取40克NaOH 加蒸餾水至1000毫升 3 1摩爾 升HCL液的配制 取濃鹽酸 比重1 19 82 5毫升加蒸餾水至1000毫升 配制時先將濃鹽酸緩緩加入約800毫升的蒸餾水中 然后用蒸餾水補(bǔ)足至1000毫升 1 計量根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量 計算公式 吸取量ml 培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量 mg L 1000ml 母液濃度 mg L 2 移液取醫(yī)用瓷缸一只 加入少量的蒸餾水 按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用 二 培養(yǎng)基的配制 注意 1 用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前 必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次 2 量取母液時 不要漏掉或多加 3 移液管不能混用 3 稱取瓊脂蔗糖備用4 融化用搪瓷量杯量取600 700ml的蒸餾水放在電爐上 加入瓊脂 邊加熱邊用玻璃棒攪拌 直到液體呈半透明狀將其取下 加入蔗糖 大燒杯底的外表面不能沾水 否則加熱時燒杯容易炸裂 使溶液外溢 造成燙傷 5 混合將融化的瓊脂和母液充分混合 用蒸餾水定容到1000ml 來回混合幾次 6 調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol L的NaOH或HCl溶液 逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中 邊滴邊攪拌 并隨時用精密的pH試紙 5 4 7 0 測培養(yǎng)基的pH 一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止 在調(diào)制時要比目標(biāo)pH值偏高0 2 0 5個單位 因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解 pH值會下降0 2 0 5個單位左右 7 分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝 注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上 錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1 5 1 4 每1L培養(yǎng)基 可分裝20 30瓶 8 包扎用封口膜封口 外邊可加一層牛皮紙 扎好繩子 用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號 9 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)中溫度 光照 濕度等各種環(huán)境條件 培養(yǎng)基組成 pH值 滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織 4培養(yǎng)條件的選擇 一 光照的影響 培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一 主要表現(xiàn)在光強(qiáng) 光質(zhì) 以及光周期等方面 光周期 黑暗與光照交替的時間光量 光照強(qiáng)度光質(zhì) 光的波長 例1 黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥 其胚狀體的分化與幼植物的生長 同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多例2 短日照敏感的葡萄品種 它的莖切段 僅在短日照條件下才能分化成根例3 對日照不敏感的葡萄品種 可在任何光周期下分化成根結(jié)論 光周期的需要與否 應(yīng)根據(jù)植物種類 培養(yǎng)的目的來決定 1 光周期對植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng) 最常用的周期是16h的光照 8h的黑暗 愈傷組織誘導(dǎo)階段 一般采用三種做法 全暗 周期性光照 散射性光照 依據(jù)植物種類不同做法不同 多數(shù)植物適合全暗或周期性光照 器官發(fā)生階段 一般給予周期性光照比較好 離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié) 光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響 從