中國(guó)科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文——柴達(dá)木枸杞活性.pdf

分類(lèi)號(hào) 密級(jí) UDC 編號(hào) 中國(guó)科學(xué)院研究生院 碩士學(xué)位論文 柴達(dá)木枸杞活性成分研究柴達(dá)木枸杞活性成分研究 李國(guó)梁 指導(dǎo)教師 劉永軍 研究員 索有瑞 研究員 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別 碩士 學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng) 植物學(xué) 論文提交日期 2010 年 5 月 論文答辯日期 2010 年 5 月 培養(yǎng)單位 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所 學(xué)位授予單位 中國(guó)科學(xué)院研究生院 答辯委員會(huì)主席 Thesis of Master Degree Graduate University of the Chinese Academy of Science The study on the active ingredient in Lycium barbarum from Qaidam Basin by Guoliang Li Phytochemistry Directed by Professor Yongjun Liu Yourui Suo Northwest Institute of Plateau Biology CAS May 2010 Xining Qinghai China 摘 要 摘要摘要 枸杞是茄科植物枸杞 Lycium barbarum 的成熟干燥果實(shí) 枸杞在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī) 學(xué)中具有重要的地位 其藥用價(jià)值備受歷代醫(yī)家的推崇 本草綱目 記載 枸 杞 補(bǔ)腎生精 養(yǎng)肝 明目 堅(jiān)精骨 去疲勞 易顏色 變白 明目安神 令人 長(zhǎng)壽 對(duì)于枸杞上述功能起重要作用的因子 一般認(rèn)為與其所含枸杞多糖 黃 酮類(lèi)物質(zhì)和不飽和脂肪酸等活性成分有關(guān) 本論文主要對(duì)柴達(dá)木枸杞中的主要活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究 主要內(nèi)容如下 1 通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了柴達(dá)木枸杞中多糖的含量 同時(shí)采用新合成 的衍生試劑 1 萘基 3 甲基 5 吡唑啉酮 NMP 對(duì)糖類(lèi)進(jìn)行柱前衍生 在毛細(xì)管 區(qū)帶電泳模式下多糖中的單糖組成進(jìn)行了研究 采用清除 DPPH 與 胡蘿卜素 亞油酸體系對(duì)柴達(dá)木枸杞多糖的體外抗氧化活性研究進(jìn)行了研究 2 利用超臨界 CO2萃取技術(shù)萃取了枸杞籽油 同時(shí)采用響應(yīng)面分析法對(duì)萃取條 件包括萃取溫度 萃取時(shí)間和夾帶劑 乙醇 等進(jìn)行了優(yōu)化 得到了最佳萃取 工藝 同時(shí)還考察了萃取條件間的相互作用對(duì)出油率的影響 采用清除 DPPH 與 胡蘿卜素 亞油酸體系對(duì)枸杞籽油的體外抗氧化活性研究進(jìn)行了研究 同時(shí)還 利用正交分析法考察了不同萃取條件對(duì)籽油抗氧化活性的影響 3 采用 2 11H 苯 a 咔唑 乙基對(duì)甲苯磺酸酯 BCETS 作為柱前熒光標(biāo)記試劑 通過(guò)響應(yīng)面分析法 對(duì)衍生溫度 衍生時(shí)間 衍生試劑量進(jìn)行了優(yōu)化 并建立了 30 種脂肪酸衍生物的同時(shí)分析測(cè)定方法 HPLC FLD MS 利用該方法對(duì)不同萃取 條件下籽油中的游離脂肪酸含量進(jìn)行了分析 同時(shí)研究了不同萃取條件對(duì)游離脂 肪酸的組成影響 4 對(duì)柴達(dá)木枸杞中的總黃酮 氨基酸與主要微量元素進(jìn)行了分析 本文中利用響應(yīng)面分析法對(duì)超臨界萃取柴達(dá)木枸杞籽油的工藝進(jìn)行了優(yōu)化 同時(shí)建立了一種新型 快速 靈敏測(cè)定籽油中游離脂肪酸的柱前衍生分析方法 該分析方法可以應(yīng)用于其他籽油或食用油 生物樣品中的痕量游離脂肪酸測(cè)定 同時(shí)還對(duì)柴達(dá)木枸杞中其它活性成分進(jìn)行了全面研究 這些基礎(chǔ)研究為柴達(dá)木枸 杞日后綜合開(kāi)發(fā)及應(yīng)用等提供基礎(chǔ)理論依據(jù) 關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞 柴達(dá)木枸杞 多糖 超臨界萃取 響應(yīng)面分析法 籽油 氨基酸 黃酮 微量元素 Abstract Abstract Fruit from Lycium barbarum L L barbarum in the family Solanaceae is well known in traditional Chinese herbal medicine which has an important role in traditional medicine Compendium of Materia Medica records that the pharmacological activities associated with L barbarum include hypoglycemic immunomodulation anti hypertension lipotropic protecting hepatic function anti aging anti fatigue antioxidant and so on The main active ingredients in L barbarum are polysaccharides flavonoids unsaturated fatty acids and so on In this study Lycium barbarum from Qaidam Basin was used as experimental Material The main main active ingredients in L barbarum were studied 1 The content of total flavonoids in L barbarum was determined by UV Vis spectrophotometry 1 naphthyl 3 methyl 5 pyrazolone NMP was used as derivatization reagent derivatived carbohydrates from L barbarum polysaccharides were separated by capillary zone electrophoresis The antioxidant activity of lyceum barbarum polysaccharide was assessed by means of 2 2 diphenyl 1 picrylhydrazyl DPPH radical scavenging assay and carotene bleaching test 2 The oil in L barbarum seed was extracted by supercritical CO2 To optimize the supercritical CO2 oil extraction process response surface methodology RSM was applied to optimize the extraction conditions including pressure temperature and amount of modifier ethanol The interaction effect between the parameters was also studied The effects of various extraction conditions on the antioxidant activity of extracted samples were investigated 3 2 11H benzo a carbazol 11 yl ethyl 4 methylbenzenesulfonate BCETS was used as pre column derivatization reagent response surface methodology was applied to optimize the derivatization conditions including reaction temperature reaction time and amount of reagent A facile and sensitive method for the simultaneous determination of 30 fatty acids was developed by HPLC with fluorescence detection and on line MS identification and this established method was used to analysis the free fatty acids in extracted samples The effects of various supercritical extraction conditions on the free fatty acids composition were investigated by orthogonal analysis Abstract 4 The content of total flavonoids amino acids and trace elements in Lycium barbarum from Qaidam Basin were determined In this paper the supercritical CO2 oil extraction from Lycium barbarum seed was optimized by response surface methodology and developed a new rapid and sensitive method for free fatty acids by pre column derivatization This established method could be applied in the determination of free fatty acids in other seed oils edible oils or biological samples Main active ingredients in Lycium barbarum from Qaidam Basin were also investigated which provide the theory basis for the application in the future Keyword Lycium barbarum from Qaidam Basin Polysaccharides Supercritical CO2 extraction Response surface methodology Seed oil Amino acids Flavonoids Trace elements 目 錄 目錄目錄 第一章 枸杞概述 1 1 枸杞研究進(jìn)展 1 1 1 枸杞多糖的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)研究 1 1 2 枸杞活性研究進(jìn)展 5 2 柴達(dá)木盆地產(chǎn)枸杞的生境 資源量及其分布規(guī)律 9 2 1 柴達(dá)木枸杞簡(jiǎn)介 9 2 2 柴達(dá)木枸杞生境基本特征 10 2 3 柴達(dá)木盆地產(chǎn)枸杞的種類(lèi)及其分布規(guī)律 10 2 4 柴達(dá)木枸杞的研究目的與意義 11 第二章 柴達(dá)木枸杞多糖及抗氧化活性研究 12 1 1 引言 12 1 2 柴達(dá)木枸杞多糖含量的測(cè)定 13 1 2 1 枸杞多糖的制備 13 1 2 2 多糖含量的測(cè)定方法 13 1 2 3 多糖含量的測(cè)定 14 1 3 柴達(dá)木枸杞的單糖組成研究 14 1 3 1 材料與儀器 14 1 3 2 枸杞多糖的制備 14 1 3 3 柴達(dá)木枸杞多糖單糖組成分析 15 1 3 4 結(jié)果與討論 16 1 4 柴達(dá)木枸杞多糖抗氧化活性研究 19 1 4 1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 19 1 4 2 試驗(yàn)方法 19 1 4 3 柴達(dá)木枸杞多糖的抗氧化活性 20 結(jié)論 21 第三章 超臨界二氧化碳萃取柴達(dá)木枸杞籽油工藝研究 23 引言 23 2 1 實(shí)驗(yàn)部分 24 2 1 1 實(shí)驗(yàn)材料 24 2 1 2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 24 2 1 3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 24 2 2 超臨界提取工藝優(yōu)化 25 2 2 1 粒徑對(duì)萃取率的影響 25 2 2 2 Box Benhnken 的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析 26 2 2 3 萃取工藝優(yōu)化 28 結(jié)論 32 第四章 柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍HPLC FLD APCI MS 分析 33 引言 33 3 1 實(shí)驗(yàn)部分 34 3 1 1 儀器 34 3 1 2 試劑 34 3 1 3 HPLC標(biāo)準(zhǔn)液制備 35 目 錄 3 1 4 油樣HPLC供試液制備 35 3 1 5 衍生條件的優(yōu)化 36 3 1 6 HPLC MS 分析條件 41 3 2 結(jié)果與討論 42 3 2 1 HPLC色譜分離與質(zhì)譜鑒定 42 3 2 1 檢測(cè)線 線性回歸方程與重現(xiàn)性 43 3 2 2 不同提取條件下枸杞籽油中的游離脂肪酸分析 43 3 2 3 萃取壓力 溫度 CO2 流量及不同提取溶劑對(duì)枸杞籽油中游離脂肪酸組成的 影響 46 結(jié)論 48 第五章 柴達(dá)木枸杞中黃酮 氨基酸及微量元素的含量測(cè)定 49 引言 49 1 1 實(shí)驗(yàn)部分 50 1 1 1 實(shí)驗(yàn)材料 50 1 1 2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 50 1 2 柴達(dá)木枸杞中總黃酮含量的測(cè)定 51 1 2 1 總黃酮的提取 51 1 2 2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 87 51 1 2 3 總黃酮含量的測(cè)定 52 1 3 RP HPLC法測(cè)定柴達(dá)木枸杞中蘆丁的含量 52 1 3 1 色譜條件 52 1 3 2 對(duì)照品溶液的制備 53 1 3 3 供試溶液的制備 53 1 3 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 53 1 3 5 精密度實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收率實(shí)驗(yàn) 54 1 3 6 柴達(dá)木枸杞樣品中蘆丁的含量測(cè)定 54 1 4 柴達(dá)木枸杞中氨基酸分析 54 1 4 1 全自動(dòng)氨基酸分析儀分析氨基酸含量與組成 54 1 4 2 柴達(dá)木枸杞和多糖氨基酸測(cè)定結(jié)果 55 1 5 原子吸收分光光度儀測(cè)定元素含量 56 1 5 1 采用火焰法進(jìn)行測(cè)試 56 1 5 2 枸杞中無(wú)機(jī)元素測(cè)定 57 結(jié)論 57 參考文獻(xiàn) 59 攻讀碩士期間發(fā)表的論文 66 致 謝 67 第一章 枸杞概述 第一章第一章 枸杞概述枸杞概述 枸杞是茄科植物枸杞 Lycium barbarum 的成熟干燥果實(shí) 1988 年我國(guó)衛(wèi)生部正 式公布枸杞既是食品又是藥品 現(xiàn)寧夏 青海 山東 河南等地都有生產(chǎn) 枸杞在 祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有重要的地位 其藥用價(jià)值備受歷代醫(yī)家的推崇 本草綱目 記 載 枸杞 補(bǔ)腎生精 養(yǎng)肝 明目 堅(jiān)精骨 去疲勞 易顏色 變白 明目安神 令人長(zhǎng)壽 神農(nóng)本草經(jīng) 中就指出 久服堅(jiān)筋骨 名醫(yī)別錄 謂枸杞擅長(zhǎng) 補(bǔ)益 精氣 食療本草 也記載枸杞 能益人 去虛勞 現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究表明 枸杞具 有抗腫瘤 抗氧化 抗衰老 免疫調(diào)節(jié) 降血糖 降血脂等作用 1 2 對(duì)于枸杞上述 功能起重要作用的因子 一般認(rèn)為與其所含枸杞多糖 黃酮類(lèi)物質(zhì)和不飽和脂肪酸 等活性成分有關(guān) 特別是與枸杞多糖密切相關(guān)重要 因此枸杞多糖的藥理及臨床應(yīng) 用研究受到格外關(guān)注 3 4 又由于國(guó)際市場(chǎng)對(duì)我國(guó)中草藥認(rèn)可度的不斷上升 歐美國(guó) 家對(duì)中草藥研究也在不斷升溫 這使得枸杞子作為藥食兼用的名貴資源已為國(guó)內(nèi)外 學(xué)者所矚 5 據(jù)報(bào)道枸杞現(xiàn)在已經(jīng)在美國(guó) 歐洲等諸多國(guó)熱銷(xiāo) 在美國(guó)作為癌癥治療 的輔藥廣泛應(yīng)用 1 枸杞研究進(jìn)展枸杞研究進(jìn)展 1 1 枸杞多糖的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)研究枸杞多糖的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)研究 枸杞多糖的提取方法 傳統(tǒng)的方法先將枸杞子烘干用氯仿 甲醇脫脂 用乙醇脫 去小分子糖然后水提取濃縮 再用乙醇沉淀 有機(jī)溶劑脫水 真空干燥枸杞得到多 糖粗品 2 張自萍等 6 用超聲提取枸杞多糖的含量為 6 26 傳統(tǒng)法 5 17 潘泰安 毛忠英等 7 提出了超臨界 CO2萃取 水溶提取 電滲析 超濾 反滲透 冷凍升華 干燥工藝生產(chǎn)枸杞多糖 產(chǎn)品純度較高 可溶性好 利用生物活性膜分離技術(shù)的特 點(diǎn)是高效節(jié)能 它可在常溫下實(shí)現(xiàn)各組分分離 提純 濃縮 隨著膜材料 膜品種 1 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 膜組件及膜裝置的發(fā)展 應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛 方法手段先進(jìn) 操作簡(jiǎn)便 具有重要 的使用價(jià)值 純化以較常用的層析法 1 凝膠層析法 以蒸餾水溶解樣品 上已平 衡好的 SephadexG 300 層析柱 以 0 2 mol L NaCl 了洗脫 收集 苯酚法顯色 2 離子交換柱層析 用 DEAE 纖維素柱 B 40 型 以 0 2 mol L 硼砂同上進(jìn)行洗脫 收 集 顯色 經(jīng)層析 流出液均為單峰 可說(shuō)明為單一組分 8 何進(jìn) 張聲華等 9 對(duì)枸 杞多糖的提取及理化特性進(jìn)行了探討 將多糖粗品裝近 DEAE 纖維素柱 OH 按下行 法洗脫 得到的粗品溶于水 先以水洗脫然后用梯度濃度的 NaCl 洗脫 苯酚法顯色 流出峰部分合并 濃縮 得到四級(jí)多糖的級(jí)分 將半成品溶于水中加樣于 SephacrylS 300 上 以重蒸水洗脫 收集 苯酚法顯色 濃縮冷凍干燥后合并得到對(duì) 應(yīng)的四個(gè)級(jí)分純化的枸杞多糖 田庚元等 10 用離子交換柱層析從 Lbp 中分離出的組 份再用凝膠層析和離子交換層析等方法進(jìn)行純化 從 Lbpl Lbp5 五個(gè)組份分別得到五 種糖白 經(jīng)高壓液相 HPLC 毛細(xì)管電泳 CE 檢測(cè)均為單峰 證明這些糖蛋白是均 一的過(guò)程如圖 1 Lbp Lbp1 Lbp2 Lbp3 Lbp4 Lbp5 SephadexG 100 CM SephadexC 50 Lbp5 Lbp4 SephadexG 100 SephadexG 100 Sephadex 100 Sephadex 100 Sephadex 100 SephadexG 100 SephadexG 50 Lbp1 Lbp2 Lbp3 圖 1 枸杞多糖純化過(guò)程圖 1 枸杞多糖純化過(guò)程 Fig 1 The Purification process of LBP 趙春久等 11 從枸杞總多糖中分離得到 4 個(gè)水溶性多糖均一體 以完全酸水解 過(guò)碘酸氧化 Smith 降解 酶解及光譜分析 氨基酸組成分析測(cè)定 對(duì)各均一體的結(jié) 第一章 枸杞概述 構(gòu)進(jìn)行化學(xué)研究得出 除 LBP 4 分子量是 1 0 l04 為 1 4 1 6 連接的葡聚糖肽 外 LBP 3 LBP 1 LBP 2 分別為分子量 6 6 104 1 8 104 1 2 l04 均為 1 4 1 6 連接的雜多糖肽 枸杞多糖通常與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合成為糖蛋白 籠統(tǒng)的稱(chēng)為枸杞多糖 通過(guò)測(cè)定 了它們的分子量 C H N 元素分析 糖含量 蛋白含量 糖基組成 氨基酸組成 及紫外 UV 紅外 IR 核磁共振 NMR 等物理化學(xué)性質(zhì) 結(jié)果證明它們都是一些糖 與肽共價(jià)結(jié)合的糖綴合物 10 12 其中以 LbGp4 含量最高 該糖蛋白含糖 70 蛋白 質(zhì) 30 檢測(cè)出 16 種氨基酸 單糖組成為阿拉伯糖 半乳糖 葡萄糖 25 10 1 0 摩爾 為 Gly O Ser 連結(jié)的糖蛋白 其中多糖鏈達(dá) 40KD 此糖鏈主鏈?zhǔn)怯?1 6 半乳 糖組成 平均每 8 個(gè)糖單元有 7 個(gè)分支 分支鏈含少量 1 3 半乳糖和大量阿拉 伯糖 末端糖基均為 1 呋喃阿拉伯糖 其化學(xué)物理性具體如表 1 2 所示 表表 1 枸杞多糖的組成枸杞多糖的組成 Table 1 The composition of LBP Composition of Glycosylation Sample M Content of N Content of protein Ara Gal Xyl Rha Glc GalA LbGp1 8 80 4 62 70 0 2 5 1 0 1 0 LbGp2 6 80 1 48 82 7 3 0 4 0 LbGp3 9 25 0 83 93 6 1 0 1 0 LbGp4 21 48 1 72 85 6 1 5 2 5 0 23 0 43 LbGp5 2 37 9 58 8 6 1 0 0 3 0 1 1 2 9 0 3 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 表表 2 枸杞多糖的氨基酸含量 枸杞多糖的氨基酸含量 g kg Table 2 The content of amino acids in LBP g kg 氨基酸 LbGp1 LbGp2 LbGp3 LbGp4 LbGp5 Asp 8 46 10 56 9 65 9 61 13 70 Thr 6 50 7 93 6 68 6 77 5 76 Ser 23 15 8 85 9 98 12 80 6 95 Glu 12 22 9 81 11 00 10 33 11 32 Pro 8 84 5 41 4 90 5 15 4 87 Gly 13 28 11 81 13 24 12 57 10 55 Ala 7 53 10 76 16 86 11 64 6 46 Cyc 0 41 1 53 0 67 1 52 1 91 Val 2 45 6 43 5 95 6 04 6 54 Met 0 24 2 10 1 12 1 03 023 Ile 3 46 4 21 4 51 3 74 4 17 Leu 2 15 6 45 3 79 4 64 8 65 Tyr 3 68 3 27 2 33 3 06 3 65 Phe 1 74 2 93 2 91 3 00 3 97 Lys 0 93 4 19 2 82 3 94 5 91 His 0 81 0 73 1 25 1 19 Arg 4 98 3 49 2 85 2 92 4 18 姚瑞祺等 13 用采用 5 個(gè)不同截流分子量的超濾膜 對(duì) LBP 進(jìn)行分級(jí)分離在 25 入口壓力 70kPa 出口壓力 30kPa 下 可得到分子量為 10 30 萬(wàn)的多糖樣品液 按 多糖分子量大小被分為 6 份 如表 3 表 3 各分子量 LBP 所占比例及 FRAP 值 表 3 各分子量 LBP 所占比例及 FRAP 值 Table 3 The content of different LBP and the FRAP M Proportion FRAP Proportion FPAP 5000 以下 74 5 0 745 0 555 5000 1 萬(wàn) 11 0 0 597 0 066 1 萬(wàn) 3 萬(wàn) 7 7 0 923 0 071 3 萬(wàn) 10 萬(wàn) 2 4 1 060 0 025 10 萬(wàn) 30 萬(wàn) 2 4 0 720 0 017 30 萬(wàn)以上 1 9 0 401 0 008 第一章 枸杞概述 1 2 枸杞活性研究進(jìn)展枸杞活性研究進(jìn)展 1 2 1 抗癌活性研究 1 2 1 抗癌活性研究 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究充分表明 LBP 具有較強(qiáng)抗腫瘤作用 對(duì)人體大多數(shù)癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 均有抑制作用 對(duì)放 化療后的不良反應(yīng)有較好的預(yù)防作用 LBP 可顯著提高荷瘤鼠 胸腺指數(shù) 巨噬細(xì)胞吞噬功能 脾細(xì)胞抗體形成 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng) 細(xì)胞毒性 T 淋 巴細(xì)胞殺傷功能及降低脂質(zhì)過(guò)氧化值 具有明顯的抗腫瘤活性 14 肖琳等 15 研究還發(fā) 現(xiàn) LBP 有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用 細(xì)胞凋亡的過(guò)程受到來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外多種信號(hào)的調(diào)控 其中 Ca 2 作為第二信使在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要的作用 這可能是其抗腫瘤作用 的主要機(jī)制之一 何彥麗等 16 用H22荷瘤小鼠 以枸杞多糖連續(xù)灌胃兩周后觀察胸腺 腫瘤重量 計(jì)算胸腺指數(shù)及腫瘤生長(zhǎng)抑制率 結(jié)果枸杞多糖可明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤 的生長(zhǎng) 對(duì)小鼠的胸腺具有一定的保護(hù)作用 可下調(diào)血清中 VEGF TGF B1 水平 表明枸 杞多糖的抗腫瘤作用與抑制腫瘤組織 VEGF TGF B1 因子的分泌 干預(yù)機(jī)體的免疫 逃逸狀態(tài)有關(guān) 崔濤等 17 研究枸杞多糖對(duì)人類(lèi)慢性髓系白血病 K562 細(xì)胞株作用 LBP 作用 48 h 后可明顯抑制 K562 細(xì)胞的生長(zhǎng) 瓊脂糖凝膠電泳 DNA 梯帶跟流式細(xì) 胞儀可見(jiàn)白血病 K562 細(xì)胞株明顯的凋亡 提示 LBP 能誘導(dǎo) K562 細(xì)胞的凋亡 并出 現(xiàn)一定時(shí)間與濃度的依賴(lài)關(guān)系 LBP 在體內(nèi) 體外對(duì) LAK 細(xì)胞抗腫瘤活性具有一定 調(diào)節(jié)作用 LBP 注射老齡小鼠可顯著促進(jìn)脾細(xì)胞增殖 LAK 活性可提高 120 200 體外 IL22 用量可降低大于 75 LBP 在體內(nèi)不但可以提高常規(guī) LAK 活性 也可快速提高 LAK 活性 用 LBP 聯(lián)合 LAK IL22 療法臨床試驗(yàn)治療惡性黑色素瘤 腎癌 直結(jié)腸癌 肺癌 惡性胸腔積液和鼻咽癌 75 例可評(píng)估資料分析表明 LBP 聯(lián) 合 LAK IL22 療法的總緩解率和緩解時(shí)間均優(yōu)于單用 LAKP IL22 療法 聯(lián)合療法治 療前后外周血淋巴細(xì)胞 PBL 的 NK LAK 活性增高程度均顯著大于單用療法 說(shuō)明 了 LBP 能夠提高 LAK IL22 療法對(duì)晚期腫瘤的治療效果 18 黃文書(shū) 楊海燕等 19 5 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 研究發(fā)現(xiàn)枸杞粗多糖具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用 其機(jī)制可能是枸杞粗多 糖直接破壞癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 使 DNA 分子損傷 DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能受抑 進(jìn)而阻 礙了細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡 也可能是枸杞多糖結(jié)合到腫瘤細(xì)胞膜 上 抑制胞外葡萄糖進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi) 使之缺乏能量而致死 1 2 2 抗衰老作用 1 2 2 抗衰老作用 人體衰老主要是細(xì)胞氧化所致 體內(nèi)自由基脂質(zhì)過(guò)氧化是導(dǎo)致衰老的主要原因 LBP 在體外可直接清除羥自由基 并能抑制自發(fā)或由羥自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反 應(yīng) 灌服 LBP 能提高半乳糖致衰老小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 GSH Px 和超氧化 物歧化酶 SOD 活性 從而可以清除過(guò)量的自由基 降低 MDA 和脂褐素含量 起到延 緩衰老的作用 2 所以 LBP 在動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化途徑可能有兩種 一是 LBP 直接清 除體內(nèi)過(guò)多的自由基 二是通過(guò)提高動(dòng)物抗氧化酶活力的間接作用來(lái)清除過(guò)多自由 基 陳智松等 24 報(bào)道 枸杞多糖能使年老小鼠骨髓 c myc 基因表達(dá)水平明顯下降 說(shuō)明 枸杞多糖的作用機(jī)理之一可能是通過(guò)抑制原癌基因c myc的表達(dá) 從而抑制細(xì)胞凋亡 最終達(dá)到延緩衰老 提高機(jī)體生命力的目的 朱彩平等 20 研究表明 LBP 可顯著降 低肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化程度 顯著提高肝組織中 SOD 的活性 維持機(jī)體氧化及抗氧 化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡 從而使組織細(xì)胞免受自由基的侵害 余江等 21 對(duì)醋酸鉛染青的小 鼠血漿中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 GSH Px 和超氧化物歧化酶 SOD 的活性與MDA含 量研究表明 陽(yáng)性對(duì)照組血漿中 SOD 水平明顯低于陰性對(duì)照組和觀察組 P 0 05 而且觀察組中用藥劑量越大 血漿中 SOD 活性越高 陽(yáng)性對(duì)照組血漿中 GSH Px 水平明顯低于陰性對(duì)照組和觀察組 P 0 05 陽(yáng)性對(duì)照組血漿中 MDA 丙二醛 水 平明顯高于陰性對(duì)照組和觀察組 P 0 05 表明回歸 模型無(wú)失擬因素存在 該模型可用于此試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)和分析 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸 擬合 得多元二次回歸模型 Y 19 11 4 83X1 1 33X2 2 46X3 1 44X12 1 40X22 1 21X32 2 26X1X2 3 41X1X3 2 03 X2X3 第三章 超臨界二氧化碳萃取柴達(dá)木枸杞籽油工藝研究 表表 2 Box Benhnken 的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析 n 3 Table 2 Experimental data for the peak area obtained from Box Behnken design n 3 Run X1 X2 X3 Oil yield 1 22 50 40 00 7 50 19 19 2 15 00 30 00 7 50 9 37 3 22 50 40 00 7 50 19 61 4 30 00 40 00 0 00 19 41 5 22 50 30 00 0 00 10 72 6 22 50 40 00 7 50 19 30 7 15 00 50 00 7 50 8 93 8 22 50 40 00 7 50 18 38 9 15 00 40 00 15 00 13 02 10 30 00 40 00 15 00 21 00 11 22 50 40 00 7 50 19 06 12 30 00 50 00 7 50 20 37 13 15 00 40 00 0 00 5 85 14 22 50 50 00 0 00 11 17 15 22 5 30 15 13 74 16 22 50 50 00 15 00 19 04 17 30 00 30 00 7 50 15 06 表表 3 回歸模型中回歸系數(shù)及顯著性分析回歸模型中回歸系數(shù)及顯著性分析 Table 3 Regression coefficients and significance analysis 系數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)誤差 DF F 值 顯著性 常變量 19 11 0 33 1 73 10 0 0001 1 4 83 0 26 1 333 55 0 0001 2 1 33 0 26 1 25 16 0 0015 3 2 46 0 26 1 86 13 0 0001 11 1 44 0 37 1 14 75 0 0064 22 1 40 0 37 1 13 89 0 0074 33 1 21 0 37 1 10 49 0 0143 12 2 26 0 36 1 38 43 0 0004 13 3 41 0 36 1 87 57 0 0001 23 2 03 0 36 1 30 86 0 0009 Lack of fit 4 98 0 078 R2 0 9895 Adjusted R2 0 9759 27 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 2 2 3 萃取工藝優(yōu)化萃取工藝優(yōu)化 表 3 為模型中各項(xiàng)系數(shù)估計(jì)值以及各項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著性分析 可見(jiàn)在 3 個(gè)因素中 影響最顯著的因素是萃取壓力 影響作用從大到小依次為 萃取壓力 萃 取溫度 夾帶劑 通過(guò)響應(yīng)面三維及等高線圖 可直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響 從而確定最佳工藝參數(shù)范圍 由于響應(yīng)面圖為三維圖 只能表達(dá)含兩個(gè)影響因素的 函數(shù) 故應(yīng)固定其中一個(gè)影響因素 圖2中 夾帶劑的量 X3 固定為編碼0 即 夾帶劑為7 5 vol 繪制萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率的影響的三維及等高線 比較 響應(yīng)面三維圖可知 萃取壓力與萃取溫度之間交互作用顯著 P 0 05 并且在所 選范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點(diǎn) 隨著萃取壓力的升高 出油率不斷增加 隨著溫度由 30 升高到45 出油率一直升高 但當(dāng)溫度超過(guò)45 時(shí) 隨著溫度的升高出油 率不斷下降 圖3中 萃取溫度 X2 固定為編碼0 即夾帶劑為 40 繪制萃取壓力與夾帶 劑對(duì)出油率影響的三維及等高線 比較響應(yīng)面三維圖可知 萃取壓力與夾帶劑間交 互作用顯著 P 0 05 隨著夾帶劑的用量的增加至9 0 vol 附近 出油率一直升 高 當(dāng)夾帶劑的量達(dá)到一定值以后 隨著夾帶劑的用量增加 出油率無(wú)明顯變化 圖4 萃取壓力 X1 固定為編碼0 即夾帶劑為 22 5 MPa 繪制萃取溫度與夾帶劑 對(duì)出油率影響的三維及等高線 比較響應(yīng)面三維圖可知 夾帶劑與萃取溫度之間交 互作用顯著 P 0 05 通過(guò)回歸擬合方程我們得出最佳提取工藝 X1 0 805 X2 0 002 X3 0 083 即 萃取壓力為28 54 MPa 萃取溫度為40 2 夾帶量為 6 88 vol 在此條件下實(shí)際出油率為21 02 與預(yù)測(cè)值相差 0 39 與模型比較吻合 第三章 超臨界二氧化碳萃取柴達(dá)木枸杞籽油工藝研究 萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖 萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響的等高曲線圖萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響的等高曲線圖 圖圖 2 萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響萃取壓力與萃取溫度對(duì)出油率影響 Fig 2 Effect of extraction pressure and temperature on the oil yields 29 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 萃取壓力與夾帶劑對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖萃取壓力與夾帶劑對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖 萃取壓力與夾帶劑對(duì)出油率影響的等高曲線圖萃取壓力與夾帶劑對(duì)出油率影響的等高曲線圖 圖圖 3 萃取壓力與夾帶劑的量對(duì)出油率的影響萃取壓力與夾帶劑的量對(duì)出油率的影響 Fig 3 Effect of extraction pressure and amount of modifier on the oil yields 第三章 超臨界二氧化碳萃取柴達(dá)木枸杞籽油工藝研究 萃取溫度與夾帶劑對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖萃取溫度與夾帶劑對(duì)出油率影響的響應(yīng)面圖 萃取溫度與夾帶劑對(duì)出油率影響的等高曲線圖萃取溫度與夾帶劑對(duì)出油率影響的等高曲線圖 圖圖 4 萃取溫度與夾帶劑的量對(duì)出油率的影響萃取溫度與夾帶劑的量對(duì)出油率的影響 Fig 4 Effect of extraction temperature and amount of modifier on the oil yields 31 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 結(jié)論結(jié)論 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化 我們最終得出提取柴達(dá)木枸杞籽油的最佳提取工藝 X1 0 805 X2 0 002 X3 0 083 即 萃取壓力為28 54MPa 萃取溫度為40 2 夾 帶量為 6 88 vol 在此條件下實(shí)際出油率為21 02 與預(yù)測(cè)值相差 0 39 與模型 比較吻合 第四章 柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍生 HPLC FLD APCI MS 第四章第四章 柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍 HPLC FLD APCI MS 分析分析 引言引言 分子中含有羧基的化合物稱(chēng)為羧酸 根據(jù)與羧基相連的烴基的不同 可將羧酸 分為脂肪酸和芳香酸 前者又可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸 根據(jù)分子中所含 羧基數(shù)目的不同 可將羧酸分為一元酸 二元酸 多元酸 自然界存在的脂肪中 含有大量的高級(jí)的一元飽和羧酸 因此一元飽和羧酸亦稱(chēng)為脂肪酸 脂肪是動(dòng)植物 體內(nèi)脂肪貯藏細(xì)胞的主要成分 也是有機(jī)體的重要儲(chǔ)備物質(zhì)之一 我們可以將這些 動(dòng)植物脂肪 固態(tài)的常稱(chēng)為脂 fat 液態(tài)的常稱(chēng)為油 oil 萃取出來(lái) 從而獲得 了諸如牛脂 羊脂 玉米油 花生油等 從化學(xué)角度講 脂肪是甘油與各種羧酸形 成的甘油酯 脂肪酸在紫外 可見(jiàn)光區(qū)吸收較弱 光度法難以準(zhǔn)確測(cè)定 63 脂肪酸分析方法已 有大量報(bào)導(dǎo) 最常見(jiàn)的是 GC MS 法 GC MS 法常采用酸催化法 64 與堿催化法 65 制 備脂肪酸甲酯化產(chǎn)物 普通實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)現(xiàn) 成本低 速度快 已報(bào)導(dǎo)的波棱瓜子 油中脂肪酸的分析方法都是采用 GC 或 GC MS 法 66 68 但該法的缺點(diǎn)是靈敏度欠佳 穩(wěn)定性差 衍生重現(xiàn)性不夠理想等 高效液相色譜熒光檢測(cè)法 HPLC FLD 分析脂肪 酸國(guó)外報(bào)導(dǎo)較多 它具有較高的靈敏度 已報(bào)導(dǎo)的用于羧酸類(lèi)化合物的標(biāo)記試劑主 要有 溴代香豆素類(lèi) 重氮甲烷類(lèi) 聯(lián)氨類(lèi) 胺類(lèi) 醇類(lèi)及磺酸酯類(lèi)化合物 溴代 香豆素類(lèi)標(biāo)記試劑主要有 4 溴甲基 7 甲氧基香豆素 Br MMC 69 4 溴甲基 6 7 二 甲氧基香豆素 Br DMC 70 4 溴甲基 6 7 二氧亞甲基香豆素 Br MDC 71 4 溴甲基 7 乙酰氧基香豆素 Br MAC 72 等 但與羧酸的衍生化一般要有 K2CO3催化劑及 18 冠 6 相轉(zhuǎn)移試劑的存在 重氮甲烷類(lèi)化合物主要有 9 蒽基重氮甲烷 ADAM 73 1 芘基重氮甲烷 PDAM 74 4 重氮甲基 7 甲氧基香豆素 DAM MC 75 等 但此類(lèi)試劑 33 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 對(duì)潮氣及水的穩(wěn)定性較差 磺酸酯類(lèi)試劑主要有 2 2 3 蒽二羰基酰亞胺基 乙基三 氟甲基磺酸酯 AE OTf 76 2 2 3 萘二羰基酰亞胺基 乙基三氟甲基磺酸酯 NE OTf 77 2 2 萘氧基 乙基 2 哌啶子基 乙基磺酸酯 NOEPES 78 等 磺酸酯對(duì) 脂肪酸類(lèi)化合物的衍生化有理想的衍生化產(chǎn)率 但需在較高溫度下 碳酸鉀催化劑 和冠醚相轉(zhuǎn)移試劑的參與下于苯或甲苯溶劑完成 分離前需預(yù)處理 既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力 2002 年 Toshimasa Toyo oka 對(duì)這些已報(bào)道羧酸衍生試劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)與展望 79 本文采用本課題組新合成的 2 11H 苯 a 咔唑 乙基對(duì)甲苯磺酸酯 BCETS 作 為柱前熒光標(biāo)記試劑 通過(guò)響應(yīng)面分析法 對(duì)衍生溫度 衍生時(shí)間 衍生試劑量進(jìn) 行了優(yōu)化 并建立了 30 種脂肪酸衍生物的同時(shí)分析測(cè)定方法 并應(yīng)用到枸杞籽油中 脂肪酸的分析 結(jié)果滿意 3 1 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分 3 1 1 儀器儀器 Agilent 1100型高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀 HPLC MS Agilent公司 配備四元梯 度泵 在線真空脫氣機(jī) 熒光檢測(cè)器 100 位自動(dòng)進(jìn)樣器 大氣壓化學(xué)電離源 APCI Eclipse XDB C8色譜柱 4 6 150 mm 5 m Agilent 公司 KQ 100DE 型數(shù)控超聲波 清洗器 昆山市超聲儀器有限公司 XH 100A 型微波催化合成 萃取儀 帶冷凝回流和 磁力攪拌 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司 3 1 2 試劑試劑 BCETS 自制 30 種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)品 上海試劑廠 9 種不飽和脂肪酸標(biāo)品 Sigma 公司 枸杞籽油 超臨界 CO2萃取 光譜純乙腈 ACN 德國(guó) Merck 公司 氫氧化鉀 鹽酸 硫酸 分析純 西安化學(xué)試劑廠 甲醇 色譜純 山東禹城化學(xué) 試劑廠 其他試劑皆為分析純 純水由 Milli Q 超純水系統(tǒng)制備 N N 二甲基甲酰 第四章 柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍生 HPLC FLD APCI MS 胺 DMF 經(jīng)減壓蒸餾后使用 3 1 3 HPLC標(biāo)準(zhǔn)液制備標(biāo)準(zhǔn)液制備 準(zhǔn)確取定量脂肪酸標(biāo)品 用光譜純乙腈配成 1 0 10 2 mol L 的溶液 長(zhǎng)鏈脂肪酸需 加入少量 DMF 作為助溶劑 稱(chēng)取 8 32 mg BCETS 用 DMF 定容至 10 mL 濃度為 0 01 mol L 低濃度的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液 1 0 10 4 mol L 用光譜純乙腈稀釋而成 3 1 4 油樣油樣HPLC供試液制備供試液制備 超臨界提取枸杞籽油的條件按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 表 1 進(jìn)行 提取后的油樣進(jìn) 行標(biāo)號(hào) 籽油前處理過(guò)程 稱(chēng)取 0 1 g 油 精確到 0 0001 置于 3 mL 的安培瓶中 加入 2 0 mL DMF 后搖勻待衍生 9 個(gè)正交實(shí)驗(yàn)的油樣都如此操作 衍生方法 向盛 有 10 mg 無(wú)水 K2CO3的 2 mL 安培瓶中依次加入 100 L DMF 100 L 上述油樣的 DMF 溶液 200 L 衍生試劑溶液 0 01 mol L 封口后于 90 恒溫水浴下振蕩反應(yīng) 30 min 取 100 L 衍生液加入 300 L 稀釋液后搖勻進(jìn)樣分 表表 1 枸杞籽油提取條件枸杞籽油提取條件 Table 1 The seed oil extraction conditions Run Pressure MPa Time min Temperature C 1 20 20 40 2 25 40 40 3 30 60 40 4 25 60 45 5 30 20 45 6 20 40 45 7 30 40 50 8 20 60 50 9 25 20 50 35 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 3 1 5 衍生條件的優(yōu)化衍生條件的優(yōu)化 BCETS 與脂肪酸的衍生反應(yīng)隨溶劑不同產(chǎn)率有顯著差異 本文分別選取乙腈 N N 二甲基甲酰胺 DMF 干燥后減壓蒸餾處理 四氫呋喃 二甲亞砜 DMSO 干 燥后減壓蒸餾處理 作為衍生溶劑體系 對(duì)衍生產(chǎn)率進(jìn)行了考察 結(jié)果表明在其它條 件相同的情況下 DMF 和 DMSO 具有最大衍生化產(chǎn)率 但 DMSO 衍生物洗脫時(shí)前 面增加兩個(gè)未知峰 副反應(yīng)產(chǎn)物 因而本實(shí)驗(yàn)選取 DMF 作衍生化溶劑 實(shí)驗(yàn)中選取 K2CO3 K2C2O4 酒石酸鉀 檸檬酸鉀和 NaAc 作堿性催化劑 對(duì)衍生化產(chǎn)率的考察 表明 K2CO3具有最高衍生產(chǎn)率 故實(shí)驗(yàn)選取 K2CO3作為堿性催化劑 根據(jù)Box Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理 選擇影響衍生效率 Y 峰面積 的3個(gè)主要影響因素 衍生時(shí)間 衍生溫度 BCETS試劑量進(jìn)行組合 以 1 0 1 代 表自變量水平 按方程xi Xi X0 X 對(duì)自變量進(jìn)行編碼 其中 xi 為自變量 的編碼值 Xi 為自變量的真實(shí)值 X0 為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值 X為自變 量的變化步長(zhǎng) 試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表2 采用SAS 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析 擬合得到二次多項(xiàng)式方程 Y 1102 39 53 75X1 202 50X2 20 08X3 181X12 368 50X22 76 00X32 7 50X1X2 37 50X2X3 第四章 柴達(dá)木枸杞籽油中脂肪酸的柱前衍生 HPLC FLD APCI MS 表表2 Box Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果 n 3 Table 2 Experimental data for the peak area obtained from Box Behnken design n 3 Independent variable Run X1 Amount of BCETS X2 Temperature C X3 Time min Y Peak area 1 4 1 80 0 40 1 850 2 12 1 80 0 10 1 800 3 4 1 80 0 10 1 650 4 4 1 100 1 25 0 700 5 12 1 100 1 25 0 750 6 12 1 60 1 25 0 380 7 8 0 80 0 25 0 1100 8 8 0 80 0 25 0 1050 9 8 0 60 1 10 1 450 10 8 0 100 1 40 1 900 11 8 0 60 1 40 1 500 12 8 0 80 0 25 0 1080 13 8 0 80 0 25 0 1060 14 8 0 100 1 10 1 700 15 8 0 80 0 25 0 1120 16 12 1 80 0 40 1 1000 17 4 1 60 1 25 0 300 通過(guò)響應(yīng)面三維及等高線圖 可直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響 從而確定最佳衍生條件 由于響應(yīng)面圖為三維圖 只能表達(dá)含兩個(gè)影響因素的函數(shù) 故應(yīng)固定其中一個(gè)影響因素 圖 1 中 衍生時(shí)間 X3 固定為編碼 0 即夾帶劑為 25 min 繪制衍生溫度與衍生試劑量對(duì)響應(yīng)值影響的三維及等高線 如圖所示隨著衍 生試劑量得增加衍生效率也隨著增加 當(dāng)衍生試劑量達(dá)到一定值時(shí) 隨著衍生試劑 量的增加衍生效率增加不顯著 衍生溫度從 60 升到 100 過(guò)程中 隨著衍生溫 度的升高 衍生效率先升高后降低 圖 2 為衍生時(shí)間與衍生試劑量對(duì)衍生效率的影 響 37 柴達(dá)木枸杞活性成分研究 圖圖 1 衍生試劑量與衍生溫度對(duì)衍生效率的影響衍生試劑量與衍生溫度對(duì)衍生效率的影響 Fig 1 The 3D response surface and 2D contour plots of detection responses peak area affected by the amount of BCETS mol BCETS mol total fatty acids and reaction temperature