第二章 dna重組.ppt

基因工程 鄭州大學生物工程系主講教師 劉紅濤 第二章DNA重組 DNA重組的概念及意義 在自然界 生物體內(nèi)時刻發(fā)生DNA的重組 呈現(xiàn)出對生物有利或有害的變異 這種重組不受人們意志控制 重組結(jié)果難以預測 基因工程涉及的DNA重組是根據(jù)人們的愿望 進行嚴密的設計 在生物體外通過人為的DNA片段化的重新連接 產(chǎn)生新的重組DNA分子 使其遺傳信息發(fā)生變化 達到人們希望的目的 2 1DNA的組成和結(jié)構 略 2 2天然DNA的制備 2 2 1天然DNA的來源和用途 2 2 2天然DNA的提取 準備生物材料 裂解細胞 分離和抽提DNA 1 準備生物材料選擇生物種類 選擇DNA易提取和含量高的組織 選擇DNA得率最高的生長期 如 大腸桿菌質(zhì)粒DNA 應在對數(shù)生長期后期 植物DNA 選幼嫩植株或黃化幼苗 減小淀粉對提取DNA的干擾 肝臟DNA 要清除膽囊 主要是去除多種高活性的酶 2 裂解細胞這步是關系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和質(zhì)量的關鍵步驟 原核細胞 用溶菌酶 NaOH和SDS 煮沸 冰凍 超聲波等方法 結(jié)構復雜的動 植物材料 先必須粉碎 液氮凍結(jié)后研磨 或搗碎機 研缽直接粉碎 再參照裂解原核的方法 3 分離和抽提DNA提取總DNA 在裂解液中加適量酚 氯仿 異戊醇或氯仿 異戊醇等有機溶液 使DNA與蛋白質(zhì)分開 用乙醇或異丙醇沉淀DNA 再離心 提取葉綠體或線粒體等細胞器DNA以及病毒和噬菌體的DNA 須先從裂解液中分離完整細胞器 病毒和噬菌體 抽提前必須經(jīng)DNase處理 水解附著于其表面的其它DNA 提取質(zhì)粒DNA 調(diào)節(jié)裂解液pH12 6 所有DNA都變性沉淀 再調(diào)節(jié)PH至中性 質(zhì)粒DNA復性后從沉淀物中釋出 除RNA 用RNase水解除RNA 分離抽提DNA最有效的方法 氯化銫梯度離心 氯化銫溶液中加適量溴化乙錠 紫外燈下DNA帶和RNA帶都發(fā)熒光 但沉降系數(shù)明顯不同而聚集于不同的氯化銫密度區(qū) 2 2 2 1大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法 原理 細菌懸浮液暴露在高pH值的強陰離子洗滌劑中 會使細胞壁破裂 染色體DNA和蛋白質(zhì)變性 相互纏繞成大型復合物 被SDS包蓋 當用鉀離子取代鈉離子時 復合物會從溶液中有效地沉淀下來 離心去除后 就可從上清中回收質(zhì)粒DNA 實驗步驟挑取一些獨立的轉(zhuǎn)化菌落進行小規(guī)模培養(yǎng) 用無菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于20ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中 于37 劇烈振搖下培養(yǎng)過夜 將1 2ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中 于4 以5000g離心5min 兩次 吸取并棄去培養(yǎng)液 使細菌沉淀盡可能干燥 將細菌沉淀重懸于100 l溶液 中 劇烈振蕩 加200 l溶液 蓋緊管口 快速顛倒離心管5次 以混合內(nèi)容物 確保離心管的整個表面均與溶液 接觸 不要振蕩 將離心管放置與冰上5min 加150 l溶液 蓋緊管口 將管倒置 溫和振蕩20s 使溶液 在黏稠的細菌裂解液中分散均勻 之后將管置于冰上5min 4 離心12000g 5min 上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中 加等體積酚 氯仿 異戊醇 25 24 1 振蕩混勻 4 離心12000g 5min 上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中 用2倍體積無水乙醇于室溫沉淀質(zhì)粒DNA 振蕩混勻 于室溫放置2min 4 離心12000g 5min 小心吸去上清夜 將離心管倒置于一張紙巾上 以使所有液體流出 再將附于管壁的液滴除盡 用1ml70 乙醇溶液洗滌沉淀 4 離心12000 5min 棄去上清 在空氣中使核酸沉淀干燥 用50 l含無DNA酶的胰RNA酶 20 lg ml 的TE重新溶解核酸 振蕩 貯存于 20 試劑 1 溶液 50mmol l葡萄糖25mmol lTris HCl pH8 0 10mmol lEDTA Na2 pH8 0 5mg ml溶菌酶 臨用時加 2 溶液 新鮮配制 200mmol lNaOH1 W V SDS 3 溶液 100ml 5mol lKAc60ml冰乙酸11 5ml pH4 8 ddH2O28 5ml 2 2 2 2 噬菌體DNA的提取溶源周期溶菌周期提取 DNA的原理 先將溶源菌培養(yǎng)至一定密度 通過熱誘導 使 DNA從宿主染色體DNA上釋放出來 再經(jīng)過溶菌周期培養(yǎng) 獲得大量 噬菌體 從中提取線形的 DNA 提取過程 溶源菌誘導培養(yǎng)分離 噬菌體 DNA的提取 2 2 2 3氯化銫法制備植物基因組DNA材料準備細胞裂解DNA分離抽取 2 2 3DNA的純化2 2 3 1氯化銫 溴化乙錠連續(xù)梯度離心法2 2 3 2離子交換層析法用三烴甲基氯化銨層析樹脂純化DNA用羥基磷灰石純化DNA2 2 3 3瓊脂糖凝膠電泳洗脫法2 2 3 4 基因純 試劑純化2 2 3 5從DNA樣品中去掉EB正丁醇 或異戊醇 抽提法Dowex樹脂層析法 2 2 4DNA的濃縮乙醇沉淀法含一價陽離子的DNA溶液 2體積無水乙醇 沉淀DNA 離心 溶于適量TE緩沖液或無菌水 條件 20 30min以上 小于1kb或量較少時 于 70 沉淀 或延長時間 正丁醇抽提法DNA溶液 1體積正丁醇 混勻 離心 1600r min1min 棄上清 重復至所需體積 用水飽和乙醚抽提DNA溶液兩次 除正丁醇 空氣中蒸發(fā)乙醚 聚乙二醇濃縮法DNA溶液 透析袋 置高濃聚乙二醇溶液 4 濃縮至所需體積 2 3限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化 2 3 1限制性核酸內(nèi)切酶 restrictionendonuclease 定義是一類能識別雙鏈DNA中特殊的核苷酸序列 并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶 類型 型限制酶 型限制酶 型限制酶 EcoRI GAATTCCTTAAG 1 型限制酶 無用 分子量 30萬dal左右組成 3種亞基特異性亞基 具特異性識別DNA序列的特性 修飾亞基 具甲基化酶活性 限制亞基 具核酸內(nèi)切酶活性 輔助因子 需Mg2 ATP和SAM 即S 腺苷甲硫氨酸 識別和切割位點 不一致 距識別位點5 一側(cè)數(shù)千堿基處隨機切割DNA分子 2 型限制酶 十分有用 分子量 2萬 10萬dal 較小 組成 一種多肽 常以同源二聚體形式存在 輔助因子 無需輔助因子 或只需Mg2 識別和切割位點 有較為專一的識別位點 3 型限制酶 無用 組成 兩個亞基M亞基 負責位點的識別與修飾 R亞基 具核酸酶的活性 輔助因子 需Mg2 ATP和SAM識別和切割位點 不一致 距識別位點3 端約25bp處切割DNA分子 限制酶的命名 型限制酶的特性1 不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列 6個 大多數(shù) 如EcoR 5 GAATTC 3 識別序列 6個 如Asu 5 GGNCC 3 5個 Mbo 5 GATC 3 4個 6個 如Not 5 GCGGCCGC 3 8個 有的限制酶識別序列包含在另一種限制酶內(nèi) 如 Sau3A識別 GATCBamH 識別 GGATCC 有的限制酶識別多種核苷酸序列 如 Hind 識別4種核苷酸序列 5 CTPyPuAC 3 Py 嘧啶堿基C或T Pu 嘌呤堿基A或G 2 各種限制酶的識別序列一般都具有回文結(jié)構 類限制酶識別序列特點 回文結(jié)構 palindrome GGATCCCCTAGG 5 3 5 3 限制酶 BamH 正讀與反讀都相同 以識別序列的中線為對稱軸 左右兩側(cè)的堿基互補 為便于書寫 識別序列可以以5 3 走向的單鏈DNA表示 3 各種限制酶的切割類型是各式各樣的 切割后形成各種粘性末端或平整末端 1 粘性末端和平整末端 a 5 P單鏈延伸的粘性末端 b 3 OH單鏈延伸的粘性末端 粘性末端 粘端 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 如 EcoR 5 3 5 3 5 3 5 3 CTGCAG GACGTC 5 3 5 3 5 3 5 3 平頭末端 平端 CCCGGG GGGCCC 5 3 5 3 5 3 5 3 2 兩種特殊的限制酶 同尾酶和同裂酶 同尾酶 isocaudamer 有些限制性內(nèi)切酶雖然來源各異 識別的靶序列也各不相同 但切割DNA后 產(chǎn)生相同的粘性末端 這一類限制酶特稱為同尾酶 這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端 BamH Bgl 同裂酶 isoschizomer 有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列 這類酶特稱為同裂酶 同裂酶的切點位置可相同或不同 BamH Bst a 切點位置相同 b 切點位置不相同 4 某些限制酶在非標準反應條件下 可能導致酶的識別序列特異性發(fā)生改變 限制酶的第二活性 在甘油濃度 離子強度 pH值 有機溶劑 二價陽離子 酶與DNA的比例等參數(shù)單獨或同時發(fā)生改變時 會導致限制酶的識別序列特異性發(fā)生改變 在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割 稱為限制酶的第二活性 又稱Star活性 能產(chǎn)生第二活性的酶常在酶名稱的右上角加一星號 如EcoR 2 3 5限制性核酸內(nèi)切酶反應系統(tǒng)反應系統(tǒng)包括 酶 底物 反應緩沖液 合適的反應溫度等 2 3 5 1底物DNA限制酶的催化效率與DNA樣品純度 DNA分子構型 識別序列兩側(cè)序列長短以及序列堿基甲基化等密切相關 DNA純度 DNA分子構型 識別序列側(cè)面的序列 保護堿基 如EcoRI GAATTC 位點偏愛 DNA甲基化 2 3 5 2限制性核酸內(nèi)切酶用量主要取決于酶本身的催化活性和底物DNA樣品1酶活性單位 U 某種限制性核酸內(nèi)切酶在最適反應條件下 60min內(nèi)完全切割1 g DNA所需的酶活性 酶活性高的用量少 反之則多 能被高效切割的DNA樣品用酶量少 反之則多 等量的兩種DNA樣品 限制酶識別序列密度大的用酶量多 反之則少 2 3 5 3限制性核酸內(nèi)切酶反應緩沖液包含 氯化鎂或醋酸鎂 氯化鈉或醋酸鉀 二硫蘇糖醇 DTT 或 巰基乙醇 2 Me Tris HCI或Tris Ac 2 3 5 4限制性核酸內(nèi)切酶反應溫度大多數(shù)的最適反應溫度是37 而少數(shù)酶的最適反應溫度高于或低于37 2 3 6限制性核酸內(nèi)切酶的Star活性 見前 幾乎所有的限制酶都具有Star活性 Star活性的影響 導致切割中出現(xiàn)非特異性DNA片段 甚至不能獲得預計的DNA片段 影響進一步的DNA連接重組 排除方法 如降低反應系統(tǒng)中甘油含量 控制pH中性和高鹽濃度下進行反應 2 3 7DNA分子片段化天然DNA或化學合成的DNA常需酶切成可連接重組的DNA片段 即DNA分子的片段化 常用的切割方法有單酶切 雙酶切和部分酶切等方法 單酶切法 用一種限制性內(nèi)切酶切割DNA樣品 最常用 雙酶切法 用兩種不同的限制酶切割同一種DNA分子 部分酶切 指選用的限制性核酸內(nèi)切酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全的切割 EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI 1 2 3 4 2 3 8DNA分子的限制性圖譜 2 4特異性DNA片段的PCR擴增 聚合酶鏈式反應 polymerasechainreaction 即PCR技術 由美國科學家Mullis于1983年發(fā)明 又稱基因的體外擴增法 也有人稱無細胞分子克隆法 PCR技術的用途目的基因的擴增與分離 醫(yī)療診斷 基因突變與檢測 分子進化研究 環(huán)境檢測 法醫(yī)鑒定 1PCR的基本原理 一 基本原理 Tm 4 G C 2 A T 90 95 30 1 37 60 30 1 70 75 30 2 預變性5min 目的 1 破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結(jié)構 使DNA充分變性 減少DNA復雜結(jié)構對擴增的影響 以利于引物更好的和模板結(jié)合 特別是對于基因組來源的DNA模板 最好不要吝嗇這個步驟 2 此外 在一些使用熱啟動Taq酶的反應中 還可激活Taq酶 從而使PCR反應得以順利進行 二 長產(chǎn)物片段 和 短產(chǎn)物片段 短產(chǎn)物片段 是嚴格地限定在兩個引物鏈5 端之間的 正是需要擴增的特定片段 長產(chǎn)物片段 則帶有不需要的 尾巴 短產(chǎn)物片段 是按指數(shù)倍數(shù)增加的 而 長產(chǎn)物片段 則以算術倍數(shù)增加 幾乎可以忽略不計 三 平臺效應在PCR反應中 當引物 模板與DNA聚合酶達到一定比值時 DNA聚合酶催化的反應趨于飽和 會出現(xiàn) 平臺效應 即PCR反應產(chǎn)物不再增加 平臺效應出現(xiàn)的遲早主要取決于起始模板的拷貝數(shù) 所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的濃度等多種因素 2PCR反應條件的優(yōu)化 一 標準PCR反應流程 一 反應體系標準PCR反應體系為50 100 l 其中包含 1 PCR反應緩沖液4種dNTP 各200 M兩種引物 各0 25 MDNA模板 0 1 gTaqDNA聚合酶 2U 二 反應步驟 二 PCR反應條件的優(yōu)化特異性 有效性和忠實性是檢驗PCR擴增效率的三個指標 PCR反應的主要影響因素有 一 循環(huán)參數(shù) 反應溫度與時間 變性退火延伸循環(huán)次數(shù) 二 PCR反應成份TaqDNA聚合酶引物dNTP緩沖液模板其它因素高溫啟動添加劑 3引物的設計 一 設計原則PCR擴增引物 是指與待擴增DNA區(qū)域兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸短片段 其長度通常在15 30個核苷酸之間 它包括引物1和引物2 引物1 又稱Watson引物 是5 端與正義鏈互補的寡核苷酸 用于擴增編碼鏈或mRNA鏈 引物2 又稱Crick引物 是3 端與反義鏈互補的寡核苷酸 用于擴增DNA模板鏈或反密碼鏈 引物設計的基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性 同時盡可能抑制非特異性擴增 具體的設計原則見書P57 二 引物長度引物太短 可能同非靶序列雜交 得出非預期的擴增產(chǎn)物 引物過長 引物同模板DNA的雜交速率下降 結(jié)果在反應循環(huán)周期內(nèi)無法完成同模板DNA的完全雜交 從而減低PCR反應的效率 三 引物的5 端修飾法5 端附加核酸序列 加酶切位點等 功能基團修飾法放射性核素 修飾三磷酸 非放射性分子 修飾堿基 如用Dig Biotin等 4耐熱DNA聚合酶 一 TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性無3 5 外切酶活性反轉(zhuǎn)錄活性非模板依賴的聚合活性影響酶活性的因素 二 其它耐熱DNA聚合酶 見書P56 PwoDNA聚合酶TthDNA聚合酶C therm 聚合酶ventDNA聚合酶 PfuDNA聚合酶 2 5DNA片段的化學合成 2 5 1寡核苷酸片段的化學合成的方法磷酸二脂法磷酸三脂法固相亞磷酸三脂法 常用 見60 66頁 2 5 2化學方法合成的DNA片段化學方法可合成DNA互補鏈的引物 寡核苷酸連桿以及基因片段和元件等 合成DNA互補鏈的引物除PCR引物外 還有測序引物 見下表 DNA寡核苷酸連桿 linker linker 是指用化學方法合成的一段由10 20個核苷酸組成 具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段 linker經(jīng)限制酶切割后可產(chǎn)生一定的粘末端 可與另一有相同粘末端的DNA片段連接 附圖 化學合成的寡核苷酸中 有的含有一個反向重復序列而形成一個雙鏈發(fā)夾結(jié)構 在雙鏈部分有一種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列 切割后產(chǎn)生一定的粘末端或平末端 這種寡核苷酸可兼作連桿和引物 即測序引物連桿 由幾十至上百個核苷酸組成 有多種限制酶的識別序列 可作為連桿且被組裝在克隆載體上成為多克隆位點 MCS 這種連桿即多克隆位點寡核苷酸連桿或簡稱MCS連桿 附圖 銜接頭 adaptor adaptor 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段 附圖 DNA芯片DNA芯片 是DNA片段以預先設計的排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成的密集分子排列 2 6DNA片段大小的凝膠電泳檢測 方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 瓊脂糖 聚丙烯酰胺凝膠電泳和脈沖場凝膠電泳等方法 條件 中性或偏堿性的緩沖系統(tǒng) DNA帶負電 運動方向 DNA經(jīng)過凝膠分子篩移向正極 遷移率影響因素 DNA分子的大小和構型 與DNA堿基組成和順序無關 檢測 溴化乙錠染色 紫外光下發(fā)紅色熒光 2 6 1瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)凝膠緩沖液和電泳緩沖液常用 TAE 使用廣泛 緩沖容量小 TBE 緩沖能力強 長時間電泳 TPE 緩沖能力也較強 但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出 所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用 凝膠中瓊脂糖含量檢測大片段DNA的含量小 反之則大 加DNA樣品一般1 g以下 多了會使大小接近的DNA帶不易分開 少了會影響小片段DNA帶的檢測 電泳條件注意 靠加樣孔一側(cè)為負極 電壓 1 10V cm 依據(jù)分辨力要求 DNA片段大小和電泳時間決定 溴化乙錠 EB 染色和紫外觀察注意 溴化乙錠是很強的誘變劑 操作時應帶手套 溴化乙錠溶液必須經(jīng)處理后才能廢棄 2 6 2DNA片段 分子 大小的估算將待測DNA片段直接與Marker比較 通過Marker的相對遷移距離 推測出待測DNA片段的大小 MCK123456 bp20001000750500250100 2 6 3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)制膠的電泳緩沖液 90nMTris 硼酸緩沖液凝膠丙烯酰胺含量 按表2 24進行加DNA樣品 加樣孔一端為上方 上下電泳槽加入電泳緩沖液 凝膠要完全接觸電泳緩沖液 接觸處不得有氣泡 電泳條件 緩沖液槽在上方為負極 下方為正極 電壓5V cm 室溫 EB染色和DNA片段大小估算 同瓊脂糖凝膠電泳 2 6 4脈沖場凝膠電泳 CHFE 參數(shù)緩沖液 TBE或0 5 TBE 蠕動泵驅(qū)動循環(huán) 凝膠 用0 5 TBE制備的瓊脂糖凝膠按圖2 16裝入電泳槽 加入電極緩沖液 超過凝膠2 3 加入DNA樣品電泳條件 交替改變的電場力 由編程轉(zhuǎn)換裝置控制脈沖參數(shù) DNA的EB染色DNA片段大小 分子 的估算 可檢測幾百萬bp的DNA片段 脈沖場凝膠電泳分離片段大小及遷移速度的經(jīng)驗公式見表2 25 2 7DNA片段的連接重組 2 7 1DNA連接酶 DNALigase DNA連接酶 是在1967年發(fā)現(xiàn)的一種能夠催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3 羥基端與5 磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵 使兩末端連接起來的酶 如果是兩個或兩個以上不同的雙鏈DNA片段末端連接 則產(chǎn)生重組DNA分子 連接酶的主要類型 E coliDNA連接酶T4DNA連接酶 DNA連接酶連接作用的特點 DNA連接酶需要一條DNA鏈的3 末端有一個游離的羥基 OH 另一條DNA鏈的5 末端有一個磷酸基 P 的情況下 才能發(fā)揮連接DNA分子的作用 只有當3 OH和5 P彼此相鄰 并且各自位于與互補鏈上的互補堿基配對的兩個脫氧核苷酸末端時 DNA連接酶才能將它們連接成磷酸二酯鍵 DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子 被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分 DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA上失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口 nick 而不能封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的單鏈裂口 gap 由于在羥基和磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵是一種吸能反應 因此 DNA連接酶在進行連接反應時 還需要提供一種能源分子 NAD 或ATP 2 7 1 1E coliDNA連