蛋白質(zhì)相互作用研究方法

蛋白質(zhì)相互作用研究方法在植物中的應(yīng)用及分析 農(nóng)學(xué)院王濤 Contents 摘要 引言 正文 總結(jié)與展望 4 1 2 3 摘要 植物中的各種生理活動(dòng)主要是通過(guò)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)的 蛋白質(zhì)相互作用的研究 是揭示生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育及其應(yīng)對(duì)各種生物或 和 非生物脅迫的分子機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要途徑 通過(guò)研究蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的相互作用 能夠更好地揭示蛋白質(zhì)功能 解碼生命現(xiàn)象 因此 探究植物中蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用研究方法 具有十分重要的意義 也是目前蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn) 本文介紹了幾種蛋白質(zhì)相互作用的體內(nèi) invivo 體外 invitro 及生物信息學(xué) insilico 研究方法 分析了各自的優(yōu)缺點(diǎn) 討論了這些研究方法在植物蛋白相互作用上的應(yīng)用 側(cè)重介紹分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究方法在植物蛋白相互作用研究中的應(yīng)用 以期為植物蛋白相互作用研究提供參考 引言 目前 越來(lái)越多的高等植物基因組序列被測(cè)定出 但很多基因的功能尚不明確 基因功能的研究必將定位的蛋白質(zhì)功能的研究中去 然而 蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮不是憑借單個(gè)蛋白質(zhì)獨(dú)立執(zhí)行 而是依靠蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 protein proteininteraction PPI 執(zhí)行其功能 忽略蛋白之間的結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系 很難全面了解蛋白質(zhì)的功能 為更好地揭示蛋白質(zhì)的功能 必然要通過(guò)蛋白相互作用研究方法來(lái)闡明植物蛋白作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng) 大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)對(duì)于準(zhǔn)確理解蛋白質(zhì)功能 揭開各種細(xì)胞活動(dòng)的奧秘具有重大的意義 勢(shì)必會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展進(jìn)入一個(gè)全盛時(shí)期 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用研究方法 1 體內(nèi)研究方法 invivo 1 酵母雙雜交系統(tǒng) Y2H 2 生物分子熒光互補(bǔ)技術(shù) BiFC 3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法 FRET 2 體外研究方法 invitro 1 免疫共沉淀法 co IP 2 GST融合蛋白pull down技術(shù) 3 串聯(lián)親和純化 TAP 技術(shù) 4 蛋白質(zhì)微陣列 Proteinmicroarrays 3 生物信息學(xué)研究方法 insilico 酵母雙雜交系統(tǒng) Y2H 基本原理 轉(zhuǎn)錄因子GAL4可以分離為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 AD 和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 BD 兩種待檢測(cè)蛋白分別和AD BD融合表達(dá) 如果兩者之間存在相互作用 則會(huì)使BD和AD結(jié)構(gòu)域靠近 形成具有完整活性的轉(zhuǎn)錄因子并激活整合到酵母基因組上的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄 通過(guò)檢測(cè)酵母的報(bào)告基因表達(dá)與否 可以反映兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有無(wú)相互作用 優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)捷 可以省略蛋白質(zhì)抽提純化或抗體制備的繁瑣步驟 高效能夠比較容易地從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中直接篩選出蛋白質(zhì)之間相互作用的陽(yáng)性克隆 敏感 高水平表達(dá)使得其能檢測(cè)到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用 真實(shí) 接近其真實(shí)的生理狀態(tài) 廣泛 可以根據(jù)靶蛋白的表達(dá)部位 條件和時(shí)相的不同有針對(duì)性地采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化期的材料構(gòu)建cDNA文庫(kù) 缺陷 非普遍適用性 假陽(yáng)性 假陰性 結(jié)果主要為定性數(shù)據(jù) 較少定量數(shù)據(jù) 不易精確判斷蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度和變化 生物分子熒光互補(bǔ)技術(shù) BiFC 基本原理 將熒光報(bào)告蛋白按照規(guī)則分成沒(méi)有熒光的兩個(gè)片段作為標(biāo)記分子 將標(biāo)記分子分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合并在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá) 只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下 兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白才會(huì)形成完整的報(bào)告蛋白 發(fā)出熒光 優(yōu)點(diǎn) 能檢測(cè)到活體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用發(fā)生的時(shí)間 位置 強(qiáng)弱 以及所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性 特別適用于在生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí) 直接 快速地對(duì)細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)的 弱的蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè) 可以在多種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 不依賴外源的熒光素或顯色劑等 能夠直接報(bào)道蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞中發(fā)生的位置 追蹤蛋白相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程 利用多彩的BiFC系統(tǒng)還可在1個(gè)細(xì)胞內(nèi)研究多種蛋白質(zhì)間的相互作用 是目前最靈敏的PPI檢測(cè)方法 缺陷 多個(gè)BiFC系統(tǒng)對(duì)溫度敏感 融合蛋白必須為可溶性表達(dá) 表達(dá)量過(guò)高會(huì)引起非特異性 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法 FRET 基本原理 分別將bait蛋白 prey蛋白與相應(yīng)的供體熒光基團(tuán) 如ECFP 和受體熒光基團(tuán) 如EYFP 融合 當(dāng)bait蛋白和prey蛋白相互結(jié)合作用時(shí) 供體基團(tuán)和受體基團(tuán)兩者之間的距離很近 約10nm 供體基團(tuán)的發(fā)射光激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)射熒光 優(yōu)點(diǎn) 比較可靠地反映蛋白質(zhì)相互作用時(shí)的距離 能檢測(cè)到瞬時(shí) 較弱的蛋白質(zhì)相互作用 能同時(shí)檢測(cè)到兩蛋白的細(xì)胞分布和作用位點(diǎn) 缺陷 供體蛋白的激發(fā)光譜和受體蛋白的光譜可能存在重疊 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 供體蛋白和受體蛋白的空間結(jié)構(gòu)較大 限制了兩者之間的距離 導(dǎo)致FRET發(fā)生效率低 約40 且易出現(xiàn)假陰性 供體蛋白和受體蛋白的熒光亮度可能差異較大 易導(dǎo)致較高的背景信號(hào) 免疫共沉淀法 co IP 基本原理 是利用抗原抗體的特異性結(jié)合特點(diǎn)來(lái)鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法 在非變性溫和條件下裂解細(xì)胞 可保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互作用 再加入誘餌蛋白抗體產(chǎn)生免疫沉淀反應(yīng) 則與誘餌蛋白穩(wěn)定結(jié)合的獵物蛋白也共同沉淀下來(lái) 再通過(guò)電泳分離 質(zhì)譜鑒定具有相互作用的獵物蛋白 優(yōu)點(diǎn) 研究的是存在于正常生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用 可以排除蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)所引起的假陽(yáng)性 是確定蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法 缺陷 一是制備抗體過(guò)程比較繁雜 二是免疫共沉淀的靈敏度不高 受到細(xì)胞內(nèi)誘餌蛋白質(zhì)濃度限制 只有較高濃度誘餌蛋白質(zhì)才能與抗體結(jié)合形成沉淀 三是在驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程中需要進(jìn)行一系列的清洗操作 因此該方法不能檢測(cè)到細(xì)胞中的低親和與瞬間的相互作用 僅適用于在細(xì)胞裂解液中保持完整生理復(fù)合體的蛋白質(zhì) 四是Co IP特異性較低 洗脫混合物中往往含有較多的非特異結(jié)合蛋白 GST融合蛋白pull down技術(shù) 基本原理 首先誘餌蛋白 Baitprotein 和GST蛋白 Glutathione S transferase 在細(xì)菌 動(dòng)物細(xì)胞等體系中融合表達(dá) 利用GST和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性 將誘餌蛋白固化在樹脂上 而固化的誘餌蛋白可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作靶蛋白 優(yōu)點(diǎn) 外源表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單易用 蛋白表達(dá)周期短 且GST融合蛋白和谷胱甘肽有很高的親和性 易分離出大量融合蛋白進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn) 缺陷 GSTPull down的融合誘餌蛋白往往是在外源系統(tǒng)中表達(dá) 可能會(huì)缺少某些翻譯后修飾 并且和靶蛋白的結(jié)合發(fā)生在體外環(huán)境 不能精確反映內(nèi)體的相互作用 串聯(lián)親和純化 TAP 技術(shù) 基本原理 將TAP標(biāo)簽融合到目標(biāo)蛋白上 然后經(jīng)過(guò)兩步親和純化 獲得融合蛋白及其結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)蛋白 通過(guò)凝膠電泳 質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)一步分析鑒定 優(yōu)點(diǎn) 操作方便 結(jié)果真實(shí) 兼具融合蛋白親和色譜法和免疫共沉淀兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 避免了非自然條件下的蛋白質(zhì)相互作用和雜蛋白的干擾 TAP能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài) 缺陷 外源標(biāo)簽蛋白與內(nèi)源目標(biāo)蛋白在形成蛋白質(zhì)復(fù)合物時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng) 使得可純化的融合蛋白減少 蛋白質(zhì)微陣列 Proteinmicroarrays 基本原理 在固相支持物表面高密度排列探針蛋白或抗體點(diǎn)陣 可特異的捕捉樣品中的靶蛋白 若發(fā)生相互作用 可在芯片表面形成蛋白質(zhì)復(fù)合物 然后用激光共聚焦掃描儀 電荷耦合裝置 CCD 或放射顯像儀獲取數(shù)組圖像 最后用專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 優(yōu)點(diǎn) 可以用微量樣品多種參數(shù)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定缺陷 受到蛋白質(zhì)固定化技術(shù)以及載體材料選擇的限制 同時(shí)也需要復(fù)雜昂貴的儀器來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和檢測(cè) 生物信息學(xué)方法 insilicon 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件要求較高 其所檢測(cè)出的相互作用數(shù)據(jù)間的重合度又非常低 得到的蛋白質(zhì)相互作用存在大量的假陽(yáng)性和假陰性數(shù)據(jù) 并且并不是所有的PPIs都能被實(shí)驗(yàn)方法所鑒定 生物信息學(xué)方法綜合數(shù)學(xué) 化學(xué) 物理和信息科學(xué)知識(shí) 在基因組規(guī)模上研究蛋白質(zhì)相互作用 有基于基因組信息的方法 基于進(jìn)化信息的方法 基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法 基于氨基酸序列的方法等 以上述方法為依據(jù)采用適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫(kù)就可對(duì)蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行分析 生物信息學(xué)方法 insilicon 生物信息學(xué)方法在蛋白質(zhì)相互作用研究中得到廣泛運(yùn)用 建立了大量的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù) 生物信息學(xué)方法 insilicon 優(yōu)點(diǎn) 可以獲得大量信息 縮短周期 降低成本 細(xì)胞中有些蛋白質(zhì)相互作用是瞬時(shí) 不穩(wěn)定的 以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的研究方法較難檢測(cè)到這些相互作用 而運(yùn)用生物信息學(xué)則彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究方法的缺陷 局限性 方法標(biāo)準(zhǔn)多樣 蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有飽和 以及相互作用的結(jié)構(gòu) 親和力 特異性信息缺乏等 總結(jié)與展望 每種技術(shù)都有自身的優(yōu)缺點(diǎn) 研究者需要根據(jù)自己的試驗(yàn)?zāi)康暮托枰x擇合適的技術(shù)方法 蛋白質(zhì)相互作用研究方法和技術(shù)在植物中應(yīng)用 盡管在數(shù)據(jù)獲得與數(shù)據(jù)質(zhì)量方面已經(jīng)有很多研究技術(shù) 但植物蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜的覆蓋率還比較低 因此 完善現(xiàn)有技術(shù)并發(fā)展新技術(shù) 提高對(duì)植物整體研究的高通量和靈敏性非常重要 且植物體內(nèi)蛋白質(zhì)組成 結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性 目前的研究技術(shù)還有很多缺陷 現(xiàn)有的蛋白