已閱讀5頁(yè),還剩27頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀
版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
SNP檢測(cè)技術(shù) 內(nèi)容簡(jiǎn)介 SNP概念 SNP的概念 單核苷酸多態(tài)性 SingleNucleotidePolymorphism SNP 指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性 在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中 絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象 即SNP 它包括單堿基的轉(zhuǎn)換 顛換 插入及缺失等形式 SNP在基因組內(nèi)的形式 一是遍布于基因組的大量單堿基變異 二是分布在基因編碼區(qū) codingregion 稱(chēng)其為cSNP 屬功能性突變 SNP在單個(gè)基因或整個(gè)基因組的分布是不均勻的 1 非轉(zhuǎn)錄序列要多于轉(zhuǎn)錄序列 2 在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義突變的頻率 比其他方式突變的頻率低得多 SNP的特點(diǎn) 在遺傳學(xué)分析中 SNP作為一類(lèi)遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用 主要源于這幾個(gè)特點(diǎn) 1 密度高SNP在人類(lèi)基因組的平均密度估計(jì)為1 1000bp 在整個(gè)基因組的分布達(dá)3 106個(gè) 遺傳距離為2 3cM 密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高 可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記 2 富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平 因此 它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素 SNP的特點(diǎn) 3 遺傳穩(wěn)定性與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比 SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性 4 易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型 allele 這樣在檢測(cè)時(shí)只需一個(gè) 或 全 無(wú) 的方式 而無(wú)須象檢測(cè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 微衛(wèi)星那樣對(duì)片段的長(zhǎng)度作出測(cè)量 這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 一 SNPs經(jīng)典檢測(cè)方法 一大類(lèi)是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法 如 1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法PCR RFLP 2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR SSCP 3 變性梯度凝膠電泳 denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE 4 等位基因特異性PCR allelespecificPCR ASPCR 等等 PCR RFLP方法 原理 利用限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性 用兩種或兩種以上的限制性?xún)?nèi)切酶作用于同一DNA片斷 如果存在SNP位點(diǎn) 酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異 根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn) 特點(diǎn) 該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn) 它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一 PCR RFLP原理圖 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 SSCP 原理 單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率 這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于堿基的組成 單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象 最終會(huì)導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上 短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象 這樣在凝膠上的遷移速率不同 出現(xiàn)不同的條帶 檢測(cè)SNP 特點(diǎn) 由于該方法簡(jiǎn)單快速 因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè) 這種方法的弊端在于不能確定突變類(lèi)型和具體位置 變性梯度凝膠電泳 DGGE 原理 是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理 通過(guò)梯度變性膠將DNA片段分開(kāi)的電泳技術(shù) 電泳開(kāi)始時(shí) DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān) 而一旦DNA泳動(dòng)到某一點(diǎn)時(shí) 即到達(dá)該DNA變性濃度位置時(shí) 使得DNA雙鏈開(kāi)始分開(kāi) 從而大大降低了遷移速率 當(dāng)遷移阻力與電場(chǎng)力平衡時(shí) DNA片段在凝膠中基本停止遷移 由于不同的DNA片段的堿基組成有差異 使得其變性條件產(chǎn)生差異 從而在凝膠上形成不同的條帶 等位基因特異PCR AS PCR 原理 根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物 其中一條鏈 特異鏈 的3 末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ) 或相同 另一條鏈 普通鏈 按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì) 因此 AS PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記 因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物 在另一種基因型中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物 用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú) 從而確定基因型的SNP SNPs高通量的檢測(cè)方法 另一大類(lèi)檢測(cè)方法是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的 高通量 自動(dòng)化程度較高的檢測(cè)SNPs的方法 較為常用的有 1 DNA測(cè)序法 2 DNA芯片檢測(cè) 3 飛行質(zhì)譜儀 MALDI TOFMS 檢測(cè) 4 變性高效液相色譜 DHPLC 法等等 DNA測(cè)序法 直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法 原理 通過(guò)對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較 以確定所研究的堿基是否變異 其檢出率可達(dá)100 特點(diǎn) 可以得到SNP的類(lèi)型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù) 基因芯片技術(shù) Genechips 原理 是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上 待測(cè)基因經(jīng)提取 熒光標(biāo)記后 與固定好的探針進(jìn)行雜交 最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類(lèi)測(cè)出待測(cè)序列的堿基類(lèi)別 特點(diǎn) 基因芯片具有信息量大和自動(dòng)化程度高的突出優(yōu)點(diǎn) 但它也存在若干問(wèn)題 芯片造價(jià)高昂 所需設(shè)備貴重 不利于普及應(yīng)用 MALDI TOF 原理 是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后 在硅芯片上進(jìn)行引物的退火 延伸反應(yīng) 突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同 根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP 變性高效液相色譜 DHPLC 原理 目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增 部分加熱變性后 含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈 因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對(duì)的同源配對(duì)區(qū)和固定相的親和力弱 更易被從分離柱上洗脫下來(lái) 從而達(dá)到分離的目的 SNPs的有無(wú)最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異 依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基 特點(diǎn) 使用高效液相色譜檢測(cè)SNPs具有檢測(cè)效率高 便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn) 對(duì)未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95 以上 但DHPLC檢測(cè)對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高 容易產(chǎn)生誤差 不能檢測(cè)出純合突變 MassARRAY SNP分型的方法多種多樣 MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具 通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏 可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合 實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè) 基于MassARRAY 分子量陣列平臺(tái)的iPLEXGOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常靈活 分型結(jié)果準(zhǔn)確性高 特別適合于對(duì)全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證 或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況 MassARRAY技術(shù)原理 先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列 然后加入SNP序列特異延伸引物 在SNP位點(diǎn)上 延伸1個(gè)堿基 將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā) 核酸分子解吸附為單電荷離子 電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比 通過(guò)檢測(cè)核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的精確分子量 從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息 MassARRAY技術(shù)原理 MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng) 緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針 在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP 使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止 根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同 探針將結(jié)合不同的ddNTP 從而具有不同的分子量 質(zhì)譜儀即可檢測(cè)出這種分子量差異 從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的 MassARRAY技術(shù)流程 應(yīng)用 1 確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系2 解釋個(gè)體間的表型差異對(duì)疾病的易感程度3 對(duì)未來(lái)疾病做出診斷4 研究不同基因型個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)的差異 指導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)及臨床合理用藥5 個(gè)體間SNP千差萬(wàn)別 通過(guò)SNP檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定及個(gè)體識(shí)別 優(yōu)勢(shì) 1 質(zhì)譜儀檢測(cè)的是分子最本質(zhì)的特征之一 分子量 不涉及熒光標(biāo)記 凝膠電泳等 就能檢測(cè)一個(gè)堿基的差異 準(zhǔn)確性高 機(jī)器本身出錯(cuò)的概率非常低 2 質(zhì)譜儀的靈敏度非常高 檢測(cè)窗口內(nèi) 任何pmol級(jí)別的物質(zhì)都能被檢測(cè)出來(lái) 3 通量高 幾秒就能檢測(cè)完一個(gè)反應(yīng)孔 4 操作簡(jiǎn)單 儀器要求簡(jiǎn)單 除質(zhì)譜儀外 都是常規(guī)PCR儀器 5 靈活 每天可以完成幾個(gè)反應(yīng)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 產(chǎn)后護(hù)理加盟合同范例
- 乳鴿生產(chǎn)銷(xiāo)售合同范例
- 2025專(zhuān)利權(quán)轉(zhuǎn)讓合同樣書(shū)版
- 醫(yī)院手術(shù)合同范例
- 直營(yíng)餐飲加盟合同范例
- 買(mǎi)賣(mài)鍋爐合同范例
- 椅子家具采購(gòu)合同范例
- 板材包裝轉(zhuǎn)讓合同范例
- 合作辦醫(yī)院合同范例
- 銅仁學(xué)院《創(chuàng)業(yè)融資管理》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 期末沖刺動(dòng)員主題班會(huì)課件
- 基于海洋文化背景下校本化特色課程開(kāi)發(fā)深化實(shí)踐研究資料
- 胸外科食管切除、食管-胃胸內(nèi)吻合術(shù)技術(shù)操作規(guī)范
- 建筑安裝工程有限公司關(guān)于加大市場(chǎng)開(kāi)拓力度的激勵(lì)辦法
- 題庫(kù)(大氣科學(xué)基礎(chǔ)(一)-題庫(kù))
- 智能制造設(shè)備與工廠自動(dòng)化項(xiàng)目驗(yàn)收方案
- 箱變調(diào)試方案
- 部編版小學(xué)語(yǔ)文五年級(jí)下冊(cè)習(xí)作5《形形色色的人》教學(xué)反思共三篇
- 冷庫(kù)冷藏庫(kù)施工組織及售后服務(wù)投標(biāo)方案
- 統(tǒng)編版語(yǔ)文一年級(jí)上冊(cè) j q x y 和 ü 的專(zhuān)項(xiàng)練習(xí)(無(wú)答案)
- 城市軌道交通工程質(zhì)量安全控制要點(diǎn)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論