細胞因子檢測ppt課件.ppt

細胞因子的檢測方法 細胞因子 一類由細胞分泌 具有多種功能的高活性小分子蛋白 參與免疫調節(jié)和多種生理病理過程等 白細胞介素 interleukin IL 干擾素 interferon IFN 腫瘤壞死因子 tumornecrosisfactor TNF 集落刺激因子 colonystimulatingfactor CSF 生長因子 growthfactor GF 趨化因子 chemokine 細胞因子的檢測方法 待檢樣品 細胞上清 指示細胞 CTLL 2 IL 2依賴細胞系 按不同稀釋度加入 37 C 16 20小時 加入3HTdR 1 5 Ci 37 C 4 6小時 收集細胞 測定 細胞增殖實驗 細胞病變抑制實驗 待檢樣品 細胞上清 IFN 指示細胞 wish 按不同稀釋度加入 37 C 4小時 37 C 24 48小時 棄取上清 加入VSV 水泡性口炎病毒 觀察細胞病變 鏡檢或比色 UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferation SDM SDM Glivec CalculationofProliferativeIndex P I CFSE 43210 TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments CellProliferationELISAKit BrdU colorimetric Chromium 51 51Cr releaseassays 計數受趨化細胞 趨化因子 細胞 趨化實驗示意圖 微孔濾膜 用示蹤物質標記抗體或抗原 使其與相應的抗原或抗體反應 使微量的 不可見的反應成為可見的或可測定的 免疫標記技術 高通量細胞因子檢測CBA CytometricBeadArray 是一種微珠多用途檢測分析技術 它由一系列的微珠組合來捕獲并結合流式細胞儀技術檢測細胞培養(yǎng)液 EDTA血漿 血清樣本中被檢測物質的量 其采用夾心法分析策略 與傳統(tǒng)的ELISA分析技術相比 此方法可以同時檢測多項指標 用已知的標準品和對照標準曲線就可以得出被測樣本的濃度 此分析方法不受樣本量的限制 而且可以得到一個樣本的多個數據 Cytokinenetwork CBA原理示意圖 LabInvest2003 83 1131 1146 cytokinebeadarrays CBA ELISPOT 酶聯(lián)免疫斑點實驗 ELISPOT技術利用結合在固相載體上的抗細胞因子的特異性抗體 在分泌細胞周圍直接撲獲待檢細胞因子 實驗中每個斑點 spot 是激活的淋巴細胞分泌的細胞因子區(qū)域 代表一個活性淋巴細胞 它可在單細胞水平檢測淋巴細胞對特異性抗原的反應能力 優(yōu)點 靈敏度高 是目前為止最靈敏的檢測技術 可檢測到百萬分之一陽性細胞率 單細胞水平 活細胞功能檢測 操作簡便 可進行高通量篩選 1 特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部 2 封閉能結合單抗的其他部位 3 加入細胞及刺激物培養(yǎng) 陽性細胞分泌的細胞因子被單抗捕獲 4 移出細胞 洗滌 5 加入生物素標記的二抗 6 加入酶標鏈霉親和素 7 加入顯色底物 在酶的催化分解下 產生不可溶的色素 就近沉淀在局部的膜上形成斑點 8 斑點計數 可人工計數 也可用自動讀板儀計數 數據處理 結果分析 ELISPOT 應用 移植研究 allograftrejection疫苗開發(fā) 亦可評估疫苗效力 或是疫苗注射路徑影響Th0 Th1 Th2細胞轉換分析自體免疫研究 免疫調節(jié)及免疫治療研究癌癥研究 腫瘤反應T細胞作用過敏機制探討 IL 4誘導免疫球蛋白亞型轉換 其它參與過敏機制之細胞因子的研究傳染疾病研究 Lymedisease Chlamydiainfections Helicobacterpyloriinfections HIVinfections multiplesclerosis 等 Medium PHA Peptide1 Peptide21 Peptide47 GzB HIV peptiderecallpatientB IFN g HIV peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN gandGzB KleenT etal AIDS2003 18 383 392 ELISPOT和ELISA的區(qū)別 ELISPOT法源自ELISA 又突破傳統(tǒng)ELISA法 是定量ELISA技術的延伸和新的發(fā)展 它們最大的不同 1 ELISA通過顯色反應 在酶標儀上測定吸光度 與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量 整體水平 ELISPOT也是通過顯色反應 在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點 可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數 1個斑點代表1個細胞 從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率 單細胞水平 2 ELISPOT比ELISA更敏感 ELISPOT技術應用領域 自身免疫診斷和預后分析 器官移植后排斥反應的預測 過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測 疫苗和藥品的研發(fā)與檢測等 胞內細胞因子的檢測 LPS活化單核細胞內TNF 的測定R1 淋巴細胞 R2 單核細胞 TNF 的誘生和檢測 主要由單核 巨噬細胞及其他多種細胞產生 能使殺傷腫瘤細胞 THP 1 人單核細胞系 在LPS 脂多糖 刺激下可分泌TNF L929 小鼠成纖維細胞 可被THP 1分泌的TNF 殺傷 且細胞的死亡率與TNF 活性成正比 四甲基偶氮唑鹽 MTT 在活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶的作用下 被還原呈藍黑色的MTT 甲瓚 離心收集培養(yǎng)上清 加入 加入四甲基偶氮唑鹽