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結(jié)核分枝桿菌與實驗室生物安全 廣東省結(jié)核病防治研究所鐘球錢明 結(jié)核病的定義結(jié)核病的疫情結(jié)核病病原學(xué)結(jié)核病的流行結(jié)核病實驗室生物安全結(jié)核病實驗室安全防護結(jié)核病實驗室廢物處理結(jié)核病職業(yè)暴露 2020 2 9 GDTB 2 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌 偶爾可由牛型或非洲型分枝桿菌 引起的一種細菌性疾病 結(jié)核病可累及全身各個器官 但以肺結(jié)核最為常見 該病具有傳染性強 散播面廣 不分地域均可發(fā)生 結(jié)核病可由呼吸道 消化道 皮膚等途徑感染 但其主要傳播途徑是以空氣為傳播因子的呼吸道傳染 而排菌的肺結(jié)核病人傳染性更大 是傳播感染的主要傳染源 2020 2 9 GDTB 3 結(jié)核病的疫情 感染人數(shù)約為20億新發(fā)活動性肺結(jié)核病人890萬 141 10萬 新發(fā)涂陽肺結(jié)核病人390萬結(jié)核病發(fā)病率每年增加1 估計患病人數(shù)為1550萬例 患病率為246 10萬 其中包括HIV TB38萬例死于結(jié)核病為180萬例 結(jié)核病死亡率為29 10萬 其中包括HIV TB死亡27萬例 2020 2 9 GDTB 4 結(jié)核病病原學(xué) 結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原體 1882年由德國醫(yī)生Koch發(fā)現(xiàn) 在微生物分類中 結(jié)核分枝桿菌屬于厚壁門 裂殖菌綱 放線菌目 分枝桿菌科 分枝桿菌屬 分枝桿菌復(fù)合群共包括人型 牛型 非洲型和田鼠型 而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌 2020 2 9 GDTB 5 結(jié)核分枝桿菌的形態(tài) 結(jié)核分枝桿菌菌體具有多形態(tài)特征 除正常典型形態(tài)外 受不良生長條件的影響 如物理因素 化學(xué)因素 特別是藥物因素 而呈現(xiàn)異常變化 其各種形態(tài)可歸納為桿菌型 基本形態(tài) 濾過型 顆粒型和球菌型 L型 4種類型 2020 2 9 GDTB 6 2020 2 9 GDTB 7 1 桿菌型 基本形態(tài) 結(jié)核分枝桿菌正常典型的形態(tài)是直或稍彎曲 兩端鈍圓的桿菌 菌體長1 4 m 寬0 3 0 6 m 無芽胞 無莢膜 無鞭毛 生長發(fā)育期間有分枝生長傾向 2020 2 9 GDTB 8 2 濾過型早在1901年 Foutes在檢查細菌濾器濾過的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液時 在電子顯微鏡下觀察到球狀微粒體 1991年 Khomeko在豚鼠損壞性肺結(jié)核模型中證實了濾過型的存在 此球狀微粒體可通過細菌濾膜 稱為濾過型 2020 2 9 GDTB 9 3 顆粒型1907年莫赫 Much 在結(jié)核性冷性膿腫 漿液性滲出液 干酪性淋巴結(jié)等膿液中觀察到革蘭染色陽性顆粒 稱為莫赫顆粒 莫赫顆粒的重要意義在于這些顆粒型體仍有生機與活力 在適宜的營養(yǎng)條件下 可重新獲得增殖 發(fā)育生長出典型結(jié)核分枝桿菌 2020 2 9 GDTB 10 4 球菌型 L型 結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外受物理 化學(xué) 免疫等因素的影響 維持菌體固有形態(tài)的細胞壁缺損或喪失 產(chǎn)生細胞壁缺陷型 細胞壁缺陷型細菌是1935年Kilienberger在英國Lister醫(yī)學(xué)研究院研究念珠狀鏈桿菌時首先發(fā)現(xiàn)的 故以Lister醫(yī)學(xué)研究院的第一個字母 將細胞壁缺陷型細菌命名為L型菌 2020 2 9 GDTB 11 結(jié)核分枝桿菌的染色特性 結(jié)核分枝桿菌本身無顏色 觀察結(jié)核分枝桿菌必須染色后進行 結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性 但革蘭染色不易著色 經(jīng)苯胺染料著色后 能抵抗酸和酸乙醇脫色 此種特性稱為抗酸性 Z N染色法為最常用的一種抗酸染色方法 經(jīng)此法染色后 分枝桿菌 包括結(jié)核分枝桿菌呈紅色 而標(biāo)本中其他細菌 細胞 雜質(zhì)等均呈藍色 2020 2 9 GDTB 12 結(jié)核分枝桿菌的生長特性 結(jié)核分枝桿菌生長緩慢 繁殖一代在人工培養(yǎng)基內(nèi)約需要15 20小時 在靜脈感染未經(jīng)免疫小鼠肺中約需要15小時 在巨噬細胞內(nèi)約需要15 20小時 在家兔角膜中約需要20 22小時 2020 2 9 GDTB 13 結(jié)核分枝桿菌的抵抗力 結(jié)核分枝桿菌因細胞壁含大量類脂質(zhì) 尤其是臘樣物質(zhì) 具有疏水性 對物理和化學(xué)因素的作用均較一般致病菌抵抗力強 2020 2 9 GDTB 14 1 物理因素影響結(jié)核分枝桿菌生存能力較強 在溫室和陰暗處干燥痰內(nèi)可以存活6 8個月 粘附在飛揚的空氣塵埃中可保持傳染性8 10天 結(jié)核分枝桿菌一般較耐低溫 在 6 8 能存活4 5年 2020 2 9 GDTB 15 干熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力弱 痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌在100 下需要4 5小時被殺滅 濕熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力強 在60 30分鐘 70 10分鐘 80 5分鐘和90 1分鐘可將其殺死 因此煮沸與高壓蒸氣消毒是最有效的方法之一 2020 2 9 GDTB 16 結(jié)核分枝桿菌對光線和射線敏感 在太陽光直射下2 7小時死亡 病人用過的物品在強陽光下直曬半日 基本可達到消毒的目的 10 1mg ml菌懸液 液層厚度3mm 用10W紫外線燈在距離確0 5m處持續(xù)照射3分鐘 在距離1m處持續(xù)照射10分鐘 經(jīng)培養(yǎng)無細菌生長 但紫外線穿透力弱 難以透入固體物質(zhì)內(nèi)部和液體深層 因此紫外線通常用于空氣和物體表面消毒 2020 2 9 GDTB 17 2 化學(xué)因素的影響化學(xué)消毒劑的種類很多 其殺菌的機制因化學(xué)藥物種類不同而異 乙醇使菌細胞蛋白質(zhì)變性 凝固而產(chǎn)生殺菌作用 結(jié)核分枝桿菌直接接觸70 75 乙醇5 30分鐘可被殺死 因此可用于皮膚消毒 但由于乙醇能凝固蛋白 使痰表面形成一層把菌體包裹起來的膜 短時間內(nèi)不能殺死細菌 故乙醇不能用于痰的消毒 2020 2 9 GDTB 18 苯酚主要通過破壞菌細胞膜而致細胞質(zhì)內(nèi)容物漏出 使菌體蛋白質(zhì)變性 凝固 抑制菌體脫氫酶和氧化酶等酶系統(tǒng)殺死結(jié)核分枝桿菌 2 苯酚5分鐘 5 苯酚1分鐘能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物 5 苯酚與痰液等量混合 24小時才能殺死結(jié)核分枝桿菌 煤酚皂溶液作用機制與苯酚相似 0 5 煤酚皂60分鐘 1 煤酚皂45分鐘 2 煤酚皂10分鐘 5 煤酚皂5分鐘 即能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物 5 10 煤酚皂等量混入痰標(biāo)本 12小時可殺滅結(jié)核分枝桿菌 2020 2 9 GDTB 19 甲醛使菌細胞蛋白質(zhì)變性凝固 喪失代謝功能致細菌死亡 1 甲醛處理結(jié)核分枝桿菌5分鐘 可使細菌死亡 5 甲醛和痰液等量混合 處理12小時以上才能達到殺菌作用 2020 2 9 GDTB 20 84 消毒液是以氯為主要成分的消毒劑 氯是一種氧化劑 能使菌體的酶失活 還能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合 使菌體蛋白氯化 代謝功能障礙 細菌死亡 0 5 84 消毒液15分鐘可殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物 但對在蛋白質(zhì)混合液中的結(jié)核分枝桿菌幾乎無消毒效果 2020 2 9 GDTB 21 結(jié)核分枝桿菌對酸 堿抵抗力強 在4 NaOH 3 HCL和6 H2SO4中30分鐘仍能存活 臨床應(yīng)用酸或堿加入病人標(biāo)本 消化蛋白質(zhì)及殺滅雜菌 以此分離出結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核分枝桿菌對染料 如1 13000孔雀綠和1 75000甲紫有抵抗力 通常在培養(yǎng)基內(nèi)加入一定量的孔雀綠或甲紫抑制其他雜菌生長 對普通細菌有較強殺菌作用的新潔爾滅 對結(jié)核分枝桿菌幾乎無消毒作用 2020 2 9 GDTB 22 結(jié)核分枝桿菌的致病性 結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi) 外毒素 也無侵襲性酶類 一般認為其致病作用可能與菌體表面結(jié)構(gòu)及某些菌體成分 如脂質(zhì) 某些菌體蛋白 多糖等多種物質(zhì)有關(guān) 主要是有毒結(jié)核分枝桿菌菌株在易感機體內(nèi)頑強增殖和與機體相互作用的結(jié)果 2020 2 9 GDTB 23 結(jié)核病流行 結(jié)核病在人群中流行的三個生物學(xué)環(huán)節(jié)是 1 傳染源 2 感染傳播途徑 3 易感人群 2020 2 9 GDTB 24 影響結(jié)核分枝桿菌傳播的主要因素 1 排菌量痰中結(jié)核分枝桿菌越多 傳播的危險性越大 病人出現(xiàn)痰涂片陽性若1ml痰液中含菌量為1000 10000 其痰涂片陽性率為40 50 痰液中含菌量低時 痰涂片陽性率亦低 表l 2020 2 9 GDTB 25 表1痰涂片與痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌數(shù) 2020 2 9 GDTB 26 痰涂片陽性 涂陽 病人的排菌量大 其密切接觸者的結(jié)核感染率明顯高于痰涂片陰性 涂陰 病人的密切接觸者 英國報告涂陰培陰病人的家庭兒童密切接觸者結(jié)核感染率為17 6 涂陰培陽病人的接觸者結(jié)核感染率為26 8 涂陽培陽病人的接觸者結(jié)核感染率高達65 0 表2 2020 2 9 GDTB 27 表2不同傳染源對15歲以下密切接觸者的感染率 2020 2 9 GDTB 28 2 排出飛沫的大小傳染源排出的飛沫受壓力和粘稠度的影響而大小不一 飛沬核直徑1 10 m者在空氣中漂浮時間長 可進入人體末梢支氣管內(nèi) 飛沫核直徑較大者 則受地心引力的影響而墜落 2020 2 9 GDTB 29 3 患者病變與癥狀病變廣泛 損害嚴重的患者 尤其是病變急劇進展 干酪溶解形成空洞患者的痰中含有大量結(jié)核分枝桿菌 是主要的傳染源 患者咳嗽 噴嚏或大聲說話時都能產(chǎn)生飛沫 有報道 當(dāng)人咳嗽時每次排出的飛沫數(shù)約為3500個 一次噴嚏則可排出飛沫達100萬個 平常說話5分鐘所排出的飛沫數(shù)相當(dāng)于一次咳嗽 咳嗽是肺結(jié)核病人產(chǎn)生飛沫的主要方式 2020 2 9 GDTB 30 表3記錄了病人每晚咳嗽次數(shù) 并觀察其0 14歲家庭接觸者的結(jié)核感染率每晚咳嗽48次以上患者的家庭接觸者感染率為43 9 而咳嗽12次以下患者的接觸者感染率為27 5 2020 2 9 GDTB 31 表3傳染源咳嗽次數(shù)與接觸者感染率 2020 2 9 GDTB 32 4 接觸的密切程度周圍人群與傳染源接觸越密切 受感染的機會越多 涂片陽性病人的密切接觸者感染率明顯高于偶爾接觸者 表4 2020 2 9 GDTB 33 表4不同接觸程度兒童感染率 2020 2 9 GDTB 34 5 環(huán)境因素與傳染源病人同處于空氣不流通的室內(nèi)的密切接觸者 受結(jié)核感染的可能性增大 第二次世界大戰(zhàn)時期曾報道潛艇內(nèi)官兵大批感染和發(fā)病 也有民航客機上結(jié)核病傳染源使同機乘客受感染的報道 2020 2 9 GDTB 35 傳播途徑 呼吸道感染 respiratortractinfection 是肺結(jié)核的主要傳染途徑 routesofinfection 飛沬傳染 dropletinfection 為最常見的方式 傳染源主要是排菌的肺結(jié)核患者 尤其是痰涂片陽性未經(jīng)治療者 飛沬核 dropletnuclei 10 m時可被吸人呼吸道 健康人可因吸入患者咳嗽 打噴嚏時噴出的帶菌飛沫而受感染 2020 2 9 GDTB 36 易感者 結(jié)核分枝桿菌進人人體 引起易感者 susceptible 機體的復(fù)雜反應(yīng) 2020 2 9 GDTB 37 1 人體的防御反應(yīng)人體的防御反應(yīng) defensereaction 有物理 化學(xué)和生物學(xué)反應(yīng) 進人呼吸道的結(jié)核分枝桿菌飛泳核可被鼻 咽 喉 氣管和支氣管的粘液吸著 被酶殺滅并隨纖毛運動經(jīng)咳嗽 噴嚏和咳痰等動作排出體外 或被吞噬細胞吞噬殺滅 當(dāng)防御功能 defensefunction 低下時 結(jié)核分枝桿菌進人下呼吸道 引起機體反應(yīng) 2020 2 9 GDTB 38 2 人體的易感性未受結(jié)核感染的人是結(jié)核病的易感人群 susceptiblepopulation 一旦受到結(jié)核分枝桿菌傳播 具有普遍的易感性 susceptibility 進入人體的結(jié)核分枝桿菌可在人體內(nèi)繁殖 結(jié)核分枝桿菌的繁殖周期約為10 20小時 一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)繁殖1周可達128條菌 繁殖20天將超過100萬條菌 表5 體內(nèi)的大量結(jié)核分枝桿菌將使人體患病 引起機體的免疫與變態(tài)反應(yīng) 2020 2 9 GDTB 39 表5一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的繁殖情況 2020 2 9 GDTB 40 3 免疫與變態(tài)反應(yīng)人體對結(jié)核分枝桿菌的自然免疫力 naturalimmunity 先天免疫力 是非特異性的 接種卡介苗 bacillicalmette gu rin BCG 或受結(jié)核分枝桿菌感染后所產(chǎn)生的獲得免疫力 acquiredimmunity 后天性免疫力 則具有特異性 能將入侵的結(jié)核分枝桿菌殺死或嚴密包圍 制止其擴散 使病灶愈合 結(jié)核病的免疫主要是細胞免疫 表現(xiàn)為淋巴細胞的致敏與吞噬細胞功能的增強 2020 2 9 GDTB 41 化療時代的結(jié)核病流行 化學(xué)療法的流行病學(xué)效果傳染性肺結(jié)核病人接受抗結(jié)核藥物化學(xué)治療 chemotherapy 后 肺部病灶中的結(jié)核分枝桿菌被殺滅 傳染性減小以至消失 傳染源的流行病學(xué)作用隨之消失 實驗報告敏感菌在未治療時相對傳染性100 在治療中只有25 耐藥病人未治療時相對傳染性為100 在治療時則只有27 3 2020 2 9 GDTB 42 結(jié)核分枝桿菌檢查 一 結(jié)核分枝桿菌檢查的意義結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的可致全身器官或組織發(fā)生病變 而以肺部病變?yōu)槌Ｒ姷膫魅拘约膊?因此 痰結(jié)核菌的檢查是結(jié)核病流行病學(xué) 結(jié)核病診斷 確定化療方案以及評價治療效果的重要手段 在現(xiàn)代結(jié)核病控制工作中起著不可或缺的重要作用 2020 2 9 GDTB 43 結(jié)核分枝桿菌檢查 直接涂片 結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)和結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性測定 2020 2 9 GDTB 44 結(jié)核病實驗室生物安全 一 生物安全的概念實驗室生物安全 是指在以微生物為對象的實驗工作中 預(yù)防生物危害 保障操作對象 操作者和環(huán)境的安全 合理的實驗室建筑結(jié)構(gòu)和布局 生物安全柜的正確使用 可以使操作對象和工作人員得到有效的保護 排出的空氣經(jīng)高效濾器濾過也可以保護鄰近人員及環(huán)境的安全 在沒有保證安全的實驗室條件下 處理傳染性強的實驗材料時 防護服 預(yù)防免疫和藥物預(yù)防是實驗室生物安全的必要保證 2020 2 9 GDTB 45 二 術(shù)語與定義 一 生物因子 biologicalagents 一切微生物和生物活性物質(zhì) 二 病原體 pathogens 可使人 動物或植物致病的生物因子 包括微生物 寄生蟲等 三 危害廢棄物 hazardouswaste 有潛在生物危險 可燃 易燃 腐蝕 有毒 放射和起破壞作用的對人 環(huán)境有害的一切廢棄物 四 危險 risk 傷害發(fā)生的概率及其嚴重性的綜合 2020 2 9 GDTB 46 五 氣溶膠 aerosols 懸浮于氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子 粒徑一般為0 001 100 m 形成的相對穩(wěn)定的分散體系 六 高效空氣過濾器 highefficiencyparticulateairfilter HEPA 通常以濾除 0 3 m微粒為目的 濾除效率符合相關(guān)要求的過濾器 七 安全罩 safetyhood 置于實驗室工作臺或儀器設(shè)備上的負壓排風(fēng)罩 以減少實驗室工作者的暴露危險 排風(fēng)經(jīng)高效過濾 2020 2 9 GDTB 47 八 緩沖間 bufferroom 設(shè)置在清潔區(qū) 半污染區(qū)和污染區(qū)相臨兩區(qū)之間的緩沖密閉室 具有通風(fēng)系統(tǒng) 其兩個門具有互鎖功能 且不能同時處于開啟狀態(tài) 九 實驗室分區(qū) laboratoryarea 按照生物因子污染概率的大小 實驗室可進行合理的分區(qū) 2020 2 9 GDTB 48 十 氣鎖 airlock 氣壓可調(diào)節(jié)的氣密室 用于連接氣壓不同的兩個相鄰區(qū)域 其兩個門具有互鎖功能 不能同時處于開啟狀態(tài) 在實驗室中用作特殊通道 十一 定向氣流 directionalairflow 在氣壓低于外環(huán)境大氣壓的實驗室中 從污染概率小且相對壓力高處向污染概率高且相對壓力低處受控制流動的氣流 2020 2 9 GDTB 49 十二 一級屏障 primarybarrier 是操作者和被操作對象之間的隔離 也稱一級隔離 如生物安全柜 個體防護裝備等 十三 二級屏障 secondarybarrier 是生物安全實驗室和外部環(huán)境的隔離 也稱二級隔離 十四 生物安全實驗室 biosafetylaboratory 通過防護屏障和配套管理措施 達到生物安全要求的生物實驗室和動物實驗室 2020 2 9 GDTB 50 三 微生物危害程度分級微生物按其是否致病 致病力強弱 危害人體的嚴重性 傳染性的大小 臨近人群的抵抗力 有無免疫制劑和特效治療藥物等綜合評價 可分為四個不同的危害等級 結(jié)核分枝桿菌屬于3級危險 2020 2 9 GDTB 51 3級危險 對個體具有極大危害 對群體具有較大的危害性 指有特殊危險的致病菌 感染后癥狀較重 并可能危及生命 或者缺乏有效的預(yù)防方法 發(fā)病后不易治療的微生物 2020 2 9 GDTB 52 實驗室感染的原因及預(yù)防 一 技術(shù)操作可能導(dǎo)致的感染及其預(yù)防措施 1 接種 應(yīng)使用無彈力的鉑絲接種環(huán) 結(jié)核菌接種后接種環(huán)火焰滅菌易崩散 酒精燈燒灼時要特別注意 2 混勻 吸管吸吹菌液時不要產(chǎn)生氣泡 應(yīng)沿容器壁排出 3 研磨 最好使用組織研磨器 乳缽易產(chǎn)生氣溶膠 2020 2 9 GDTB 53 4 移液 吸管上端的棉花松緊要適度 吸液時要從管底吸取 吹出時要輕緩 不要全部吹凈 以免產(chǎn)生氣泡 形成氣溶膠 5 開封 要避免壓力和氣流的急劇變化 6 離心 離心管套底墊要完好 使用匹配的管 套 離心頭 加蓋 7 注射 做好個人防護 正確使用注射器 8 搬運 室內(nèi)移動要避免滑落 移出室外要有堅實密閉的外包裝 2020 2 9 GDTB 54 二 生物安全的制度措施1 無生物安全3級實驗室 進行病原的實驗操作 要在有緩沖間的無菌室內(nèi)操作 并使用生物安全柜 2 工作前后要用紫外燈消毒 3 操作臺面要鋪濕消毒巾 4 按操作病原的危險等級和感染途徑做好個人防護 2020 2 9 GDTB 55 5 操作臺附近要常備消毒液 污染物要放入密閉容器及時滅菌 6 實驗室內(nèi)要嚴防蟲 鼠進入 7 根據(jù)需要對實驗室工作人員進行免疫接種和藥物預(yù)防 8 有皮膚破損和疾患的人員不得操作3 4級危險性病原 2020 2 9 GDTB 56 生物安全保障 一 建筑結(jié)構(gòu)保障 生物安全3級實驗室1 結(jié)核分枝桿菌屬于生物危害3級的微生物 進行活病原 培養(yǎng)物或感染標(biāo)本 操作時 應(yīng)使用本級別實驗室 2 實驗室建筑設(shè)備要求 雙層門或有氣幕的出入口 實驗室表面可洗刷 消毒 由上至下的氣流方向 排氣經(jīng)高效濾器 窗戶密閉 工作區(qū)可防一切蚊蟲進入 3 工作制度要求 非工作人員不得進入 使用實驗室專用工作服 鞋 排水經(jīng)無害化處理 搬出物品要求要滅菌或密閉包裝 實驗室內(nèi)禁止進食飲水 2020 2 9 GDTB 57 二 裝備保障1 生物安全柜一級生物安全柜 由外向內(nèi)的單向氣流 只保護人體 不能保護實驗材料 可用于痰涂片操作 二級生物安全柜 有向內(nèi)氣流和經(jīng)高效濾器的垂直氣流 可保護人體和實驗材料不受污染 用于病原分離 培養(yǎng) 2 高壓滅菌器 運行狀態(tài)良好 3 消毒防護物品等 2020 2 9 GDTB 58 三 技術(shù)保障1 雙人原則 不允許單人操作1 2類病原 2 入口處應(yīng)有危險警示標(biāo)識 并標(biāo)明所操作的微生物的種類 3 培訓(xùn)考核上崗 掌握相關(guān)技術(shù)操作要領(lǐng) 熟悉規(guī)章制度 適應(yīng)工作環(huán)境 4 完備的管理措施 技術(shù)操作規(guī)范 5 良好的工作行為可降低生物危害風(fēng)險 2020 2 9 GDTB 59 六 實驗室生物安全水平分級 一 根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護措施 將實驗室生物安全防護水平 biosafetylevel BSL 分為4級 級防護水平最低 4級防護水平最高 二 以BSL 1 BSL 2 BSL 3 BSL 4表示實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平 三 以ABSL 1 ABSL 2 ABSL 3 ABSL 4表示動物實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平 2020 2 9 GDTB 60 七 實驗室管理制度 一 實驗室管理規(guī)章制度 包括培訓(xùn)制度 準(zhǔn)入制度 健康監(jiān)測報告制度 個人良好行為制度 意外事故報告制度等 二 標(biāo)準(zhǔn)操作程序 包括實驗廢棄物處置標(biāo)準(zhǔn)操作程序 進出實驗室標(biāo)準(zhǔn)程序 菌毒種使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序 實驗室消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序 意外事故處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序及各種儀器設(shè)備和實驗標(biāo)準(zhǔn)操作程序等 2020 2 9 GDTB 61 結(jié)核病實驗室安全防護 各級結(jié)核病細菌學(xué)實驗室必須對工作人員給予充分保護 同時控制對環(huán)境造成的污染 在實驗室從事試驗或工作的人員 應(yīng)當(dāng)了解可能接觸到的各類危險物品的種類和性質(zhì) 明確這些危險物對自身和他人及環(huán)境具有的潛在威脅 應(yīng)嚴格按照實驗室操作規(guī)程做好安全防護 2020 2 9 GDTB 62 一 實驗室中的分枝桿菌及分枝桿菌氣溶膠結(jié)核病實驗室工作人員 在分枝桿菌檢驗過程中 會接觸到各種潛在感染源標(biāo)本和各種危險物 特別是許多操作易產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠 含有結(jié)核分枝桿菌的微滴核 1 5微米 通過呼吸進入人體肺泡 可以黏附在肺泡內(nèi)生長繁殖 因此 首先要對實驗室中生物危險物產(chǎn)生的途徑和存在的地點有充分的認識 以便明確生物安全防護的環(huán)節(jié) 2020 2 9 GDTB 63 一 分枝桿菌存在的地點1 各種臨床標(biāo)本 通常是痰 胃或支氣管灌洗液 腦脊液 尿液等 2 被污染的操作臺 器械 儀器 試劑等 3 收集的結(jié)核分枝桿菌 非結(jié)核分枝桿菌菌株等 4 細菌學(xué)實驗室的部分區(qū)域 2020 2 9 GDTB 64 二 產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠1 實驗室內(nèi)可疑肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的采集 2 樣本的制備和涂片的火焰固定 3 分離培養(yǎng)或接種培養(yǎng)物 4 用火焰燒灼接種環(huán) 5 使用移液器混合培養(yǎng)物 2020 2 9 GDTB 65 6 培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中含有培養(yǎng)物的滴落物 7 溢出的分枝桿菌懸浮液 8 高速混合含有分枝桿菌的液體 9 轉(zhuǎn)移液態(tài)培養(yǎng)物和上清液 或培養(yǎng)液 上清液的傾倒 10 離心過程中離心管的破碎 11 用做原代培養(yǎng)所需的組織勻漿 2020 2 9 GDTB 66 二 安全防護 一 嚴格遵守實驗室安全操作規(guī)程 任何時侯都要警惕分枝桿菌氣溶膠的產(chǎn)生 實驗室的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)后方可上崗 二 實驗室應(yīng)嚴格限制非實驗人員進入 減少實驗室內(nèi)外交叉生物污染 完成實驗工作離開實驗室 要關(guān)好門窗 三 進入實驗室應(yīng)避免攜帶非必需物品 2020 2 9 GDTB 67 四 進入實驗室 工作人員應(yīng)穿著工作服 操作時應(yīng)穿戴防護隔離衣 口罩 帽子和手套 長發(fā)者應(yīng)將頭發(fā)裝束在帽子內(nèi) 五 實驗過程中絕對禁止吸煙 飲食等 不要以手撫頭面部等 六 試驗前須開啟紫外線燈對實驗室和操作區(qū)域進行照射消毒1小時以上 試驗結(jié)束后 立即開啟紫外燈進行照射消毒2小時以上 七 任何試驗的開始和結(jié)束后 操作人員要用70 酒精浸泡雙手或仔細擦后 用清潔劑或清水洗凈 2020 2 9 GDTB 68 八 每次試驗結(jié)束后 必須清理好實驗臺 并用70 酒精液或3 5 石炭酸擦洗實驗臺面 九 實驗室中的生物危險品要根據(jù)檢查項目和性質(zhì)不同 局限在相應(yīng)的試驗區(qū)間 不得隨意將其帶到其它的實驗室 十 實驗室內(nèi)任何微生物的樣本 廢棄物都必須經(jīng)高溫高壓滅菌后 方可按一般垃圾處理 2020 2 9 GDTB 69 三 安全保障 一 首先各級實驗室應(yīng)按等級要求完善實驗設(shè)施 如簡易安全柜內(nèi)的抽氣排風(fēng)功能 紫外燈消毒功能 生物安全柜維護與除菌濾膜定期更換等 二 實驗室采集病人痰標(biāo)本時應(yīng)在戶外進行 避免因病人咳漱造成室內(nèi)氣溶膠污染 2020 2 9 GDTB 70 三 普通實驗室應(yīng)注意氣流方向 實驗過程中盡量避免強氣流變化而產(chǎn)生氣溶膠 如 涂片 染色過程中 四 細菌的分離培養(yǎng) 菌種開封 轉(zhuǎn)種 研磨 稀釋等操作 各級實驗室均應(yīng)在簡易安全柜或生物安全柜中進行 2020 2 9 GDTB 71 五 使用接種環(huán)進行操作時 接種環(huán)應(yīng)在工作燈的內(nèi)焰中燃燒 以避免菌液或菌塊飛濺 六 稀釋菌液時 吸管 針管要緩慢插入試管或燒瓶底部 小心操作避免產(chǎn)生氣泡或氣溶膠 2020 2 9 GDTB 72 七 使用注射器加樣時 用過的針頭切勿再重新入套或拔開注射器與針頭 應(yīng)直接放入銳器收集器 以免劃破皮膚造成接種感染 八 菌株庫要設(shè)專人管理 并按照國家微生物菌毒種管理辦法執(zhí)行 2020 2 9 GDTB 73 九 進行毒菌操作過程中 不要穿戴巳經(jīng)污染的防護性手套觸摸門柄 儀器或毒菌區(qū)以外區(qū)域 避免由于粗心擴大污染范圍 十 試驗結(jié)束后 操作過程中所有可能與生物危險物接觸或被污染的試驗器械和物品 能夠高壓消毒的必須高壓消毒 不能進行高壓消毒的設(shè)備 儀器 應(yīng)使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長時間消毒 2020 2 9 GDTB 74 十一 實驗中發(fā)生意外污染情況 應(yīng)立即通知主管人員并做好處理污染物和相應(yīng)區(qū)域的準(zhǔn)備 不得擅自采用其它禁止的方法進行消毒處理 十二 實驗室主任應(yīng)制定規(guī)章和程序 只有告知潛在風(fēng)險并符合進入實驗室特殊要求 如 經(jīng)過免疫接種 的人 才能進入實驗室 2020 2 9 GDTB 75 十三 操作致病性微生物時 實驗室入口處應(yīng)貼有生物危險標(biāo)志 并顯示以下信息 有關(guān)病原 生物安全級別 免疫接種要求 研究人員姓名 電話號碼 在實驗室中必須佩帶的個人防護設(shè)施 出實驗室所要求的程序 2020 2 9 GDTB 76 十四 實驗室主任為實驗室人員特別制定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序或生物安全手冊中 應(yīng)包括生物安全程序 對于有特殊風(fēng)險的人員 要求閱讀并在工作及程序上遵照執(zhí)行 2020 2 9 GDTB 77 十五 實驗室主任保證實驗及其輔助人員接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn) 包括和工作有關(guān)的可能存在的風(fēng)險 防止暴露的必要措施和暴露評估程序 2020 2 9 GDTB 78 十六 實驗室所用任何個人防護裝備應(yīng)符合國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求 實驗室應(yīng)確保具備足夠的有適當(dāng)防護水平的清潔防護服供使用 還應(yīng)穿戴其它的個人防護裝備 如手套 防護鏡 面具 頭部面部保護罩等 2020 2 9 GDTB 79 十七 處理樣本的過程中易產(chǎn)生高危害氣溶膠時 要求同時使用適當(dāng)?shù)膫€人防護裝備 生物安全柜和 或其它物理防護設(shè)備 如可產(chǎn)生含生物因子的氣溶膠 應(yīng)在適當(dāng)?shù)纳锇踩裰胁僮?2020 2 9 GDTB 80 十八 實驗用鞋應(yīng)舒適 鞋底防滑 應(yīng)用皮制或合成材料的不滲液體的鞋類 在從事可能出現(xiàn)漏出的工作時可穿一次性防水鞋套 在實驗室的特殊區(qū)域 例如有防靜電要求的區(qū)域 或BSL 3和BSL 4實驗室要求使用專用鞋 例如一次性或橡膠靴子 2020 2 9 GDTB 81 結(jié)核病實驗室廢物處理 一 實驗室廢棄物處理的目的 一 將操作 收集 運輸 處理及處置廢棄物的危險減至最小 二 將實驗室廢棄物對環(huán)境的有害作用減至最小 2020 2 9 GDTB 82 二 實驗室污物處理及消毒 一 實驗室含有生物危險物的臨床標(biāo)本及被污染的一次性用品 試驗完成后 應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)以紫外燈近距離照射消毒2小時以上 再經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒 2020 2 9 GDTB 83 二 可重復(fù)使用的實驗用品及器材 完成實驗后 應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)經(jīng)紫外燈近距離照射消毒2小時以上后 再交有關(guān)人員進行高壓消毒和煮沸洗刷 2020 2 9 GDTB 84 三 實驗用的試管 吸管 注射器 須裝在加蓋不漏的容器內(nèi) 經(jīng)高壓滅菌后取出 2020 2 9 GDTB 85 四 培養(yǎng)物或?qū)嶒炇依?在丟棄前必須經(jīng)高壓消毒和紫外燈近距離長時間照射處理 不允許積存垃圾和實驗室廢棄物 已裝滿的容器應(yīng)定期運走 在去污染或最終處置之前 應(yīng)存放在指定的安全地方 通常在實驗室區(qū)內(nèi) 2020 2 9 GDTB 86 五 實驗室廢棄物應(yīng)置于適當(dāng)?shù)拿芊馇曳缆┤萜髦邪踩\出實驗室 有害氣體 氣溶膠 污水 廢液應(yīng)經(jīng)適當(dāng)?shù)臒o害化處理后排放 應(yīng)符合國家相關(guān)的要求 2020 2 9 GDTB 87 六 實驗過程中 如標(biāo)本或含標(biāo)本的前消化處理液被打翻污染了操作臺或地面 應(yīng)以吸滿70 酒精的衛(wèi)生紙覆蓋污染區(qū) 15分鐘以后衛(wèi)生紙方可移去 2020 2 9 GDTB 88 七 實驗室內(nèi)未經(jīng)消毒的污水 禁止直接排入公共排水系統(tǒng) 更不允許混入居民生活垃圾 2020 2 9 GDTB 89 三 意外事故的處理 一 如果發(fā)生意外 必須立即通知實驗室主管人員 并在有關(guān)人員的指導(dǎo)監(jiān)督下對出事現(xiàn)場進行處理 絕對禁止未經(jīng)報告而私自對出事現(xiàn)場給予非規(guī)范的處理 2020 2 9 GDTB 90 二 實驗過程中 如污染物濺落到身體表面 或有割傷 刺傷 燒傷 燙傷等情況發(fā)生 應(yīng)立即停止實驗工作進行緊急處理 更換被污染的實驗服 皮膚表面用消毒液清洗 傷口以碘酒或酒精消毒 眼睛用無菌生理鹽水沖洗 2020 2 9 GDTB 91 三 如果發(fā)生菌液溢出 含菌種的培養(yǎng)管破碎等 造成中 小面積污染 可用比污染面積大25 以上的紗布覆蓋污染區(qū)域 邊緣用脫脂棉圍住 向紗布傾倒5 苯酚溶液或70 的酒精 浸泡2小時以上 其間適量加溶液防止干燥 再經(jīng)紫外燈近距離 1米內(nèi) 照射2小時以上 被污染的器械 容器等立即浸泡于70 酒精中2小時以上 實驗完成后再進行高壓消毒處理 2020 2 9 GDTB 92 四 如果發(fā)生氣溶膠污染或大面積污染 應(yīng)立即停止實驗并關(guān)閉實驗室 對污染區(qū)域進行紫外燈照射消毒過夜 第二天對污染區(qū)進行24小時封閉空氣熏蒸消毒 乙醛消毒法 5ml乙醛 2g高錳酸鉀 m3空間 2020 2 9 GDTB 93 五 絕對禁止使用的事故處理方法 1 任何有可能造成污染面積擴大的去污方法 如使用70 乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的區(qū)域 2 直接用火焰對未經(jīng)任何處理的污染地面 操作臺 器械等進行燒灼處理 3 使用消毒效果未經(jīng)證實的消毒劑進行消毒 4 使用低濃度的消毒劑和紫外燈進行短時間 長距離的照射 2020 2 9 G