結(jié)核桿菌研究進(jìn)展(綜述).doc

結(jié)核桿菌DNA疫苗研究進(jìn)展結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計，全世界約有20 億人感染過結(jié)核分枝桿菌，每年約有200300 萬人死于結(jié)核病，其人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)的總和。20世紀(jì)末，結(jié)核病仍然是全球感染和傳染病的第一“殺手”。當(dāng)前唯一可用的疫苗-卡介苗（BacilleCalmette Guerin，BCG）的免疫效果下降，對其保護(hù)效果也存在爭議，經(jīng)試驗證明其總有效率僅為50 %。而且對成年人的免疫效果也不明確，因此現(xiàn)在急需研制出新型疫苗。目前新型結(jié)核疫苗研制方向主要有：減毒結(jié)核疫苗，高表達(dá)重組疫苗，蛋白質(zhì)亞單位疫苗和DNA 疫苗（又稱核酸疫苗或基因疫苗）等四種。本文就結(jié)核DNA 疫苗的新進(jìn)展作一簡要綜述。1 DNA 疫苗的作用機(jī)理DNA疫苗的作用機(jī)理是能讓外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)出來的蛋白質(zhì)和MHC-類分子結(jié)合后被呈遞到細(xì)胞的表面，再被CD8+T淋巴細(xì)胞的受體識別而誘發(fā)CTL的細(xì)胞毒反應(yīng)，這對細(xì)胞內(nèi)寄生的結(jié)核桿菌有很強的殺傷作用。但目前對DNA 疫苗激活免疫系統(tǒng)的詳細(xì)機(jī)理還不是很清楚，不過有以下幾種機(jī)制可對此進(jìn)行解釋：DNA 疫苗直接致敏體細(xì)胞；基因疫苗轉(zhuǎn)染APC（抗原遞呈細(xì)胞-巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞）；核酸疫苗在APC 內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原作為“內(nèi)源性抗原”，結(jié)合MHC-類分子后被T 細(xì)胞受體識別，這是誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的最有效的途徑；交叉致敏；細(xì)菌質(zhì)粒具有免疫佐劑功能1。當(dāng)人或小鼠感染結(jié)核菌后，巨噬細(xì)胞（M）吞噬結(jié)核菌但卻不能將其殺滅。因此結(jié)核菌在M中生存繁殖，外來藥物與抗體也無法直接消除結(jié)核菌。只有人M被抗原特異的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞溶解后，其中寄生的毒性結(jié)核菌才能被殺死。因此可以設(shè)想，殺菌性T 細(xì)胞的功能低下導(dǎo)致了小鼠感染結(jié)核菌后免疫抵抗力的下降，造成慢性感染，在人體也可發(fā)生類似情況。在主動免疫的機(jī)制中，可溶性蛋白抗原主要刺激CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，而DNA 疫苗則可引起強烈的CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗原特異性CD8+/ CD4- / CD44 high T 細(xì)胞，分泌IFN-2，引起有效的細(xì)胞免疫。2 編碼抗原基因重組的DNA 疫苗1996年8月出版的自然醫(yī)學(xué)雜志同時刊登了Huygen和Tascon兩位博士各自分別完成的結(jié)核病DNA疫苗的論文，1998 年英國劍橋Sanger 中心完成結(jié)核桿菌基因組序列的測定，為結(jié)核DNA 疫苗的研制提供了保證，使其研制進(jìn)入飛躍發(fā)展階段。實驗證明結(jié)核桿菌在體外培養(yǎng)早期分泌的蛋白質(zhì)是主要的抗結(jié)核保護(hù)性抗原，因此主要的結(jié)核DNA疫苗都是將編碼這些抗原的基因克隆到載體中構(gòu)建而成的。目前結(jié)核DNA 疫苗的研制主要有：以Antigen85 和hsp65，以及結(jié)核桿菌培養(yǎng)過濾液中的分泌蛋白ESAT-6 和MPT-64 編碼基因重組的DNA 疫苗3。2. 1 以Antigen85 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗在結(jié)核菌和BCG 的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個主要成分是Ag85復(fù)合體（Antigen85 complex），由Ag85A，Ag85B，Ag85C組成的3032kD 蛋白家族，分別由三種不同但高度同源的基因編碼。在感染結(jié)核或麻風(fēng)菌與卡介苗免疫的小鼠及人體上，Ag85 復(fù)合體不僅可以刺激產(chǎn)生體液免疫，尚可激發(fā)較強Th1 型細(xì)胞免疫，引起CD8+ T 細(xì)胞增殖和IL-2及IFN-等細(xì)胞因子水平的上升。結(jié)核病的免疫學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下，研究結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞的保護(hù)功能可能與IFN-誘導(dǎo)有關(guān)，這些實驗揭示可利用Ag85 復(fù)合體基因構(gòu)建DNA 疫苗。其中Ag85A 和Ag85B 被認(rèn)為更有效，一些實驗已證實，由Ag85A 和Ag85B 編碼的DNA 疫苗對小鼠抵抗由呼吸道或靜脈感染的結(jié)核菌有保護(hù)作用4，目前一些研究小組正在致力于此方面的研究。2. 1. 1 Ag85A 用含結(jié)核菌38kD 蛋白基因與Ag85A 及HSP65 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗免疫的動物模型中，可產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用。以人工合成的包括Ag85A 全部20 肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2，IFN-為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)DNA 免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞反應(yīng)在強度和廣度上均比皮下注射結(jié)核菌感染的效果好，CTL 活性也上升。編碼Ag85A 的DNA 疫苗與BCG 有同樣的誘導(dǎo)保護(hù)作用。Huygen把結(jié)核桿菌的抗原85A基因克隆到美國Merk公司的VIJ載體中構(gòu)建了DNA疫苗，然后將DNA在體外轉(zhuǎn)染肌肉瘤細(xì)胞，證明了DNA疫苗能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)結(jié)核桿菌的抗原85A蛋白質(zhì)。給Balb/c和C57BL/6小鼠肌肉注射Ag85A疫苗，能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)很強的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。2. 1. 2 Ag85B 由MTB （Mycobacterium tuberculosis）H37Rv 基因組編碼，用其作為亞單位疫苗與多個蛋白疫苗比較或與其他基因疫苗比較4，均表明Ag85B 是MTB 較好的保護(hù)性靶抗原之一。研究表明Ag85B 基因免疫小鼠可以產(chǎn)生較高水平的IFN-和脾淋巴細(xì)胞顯著增殖為特征的細(xì)胞免疫反應(yīng)。將此小鼠的T 細(xì)胞過繼免疫給正常小鼠后，對MTB 毒株的感染有一定的保護(hù)性5。相繼用編碼Ag85B的DNA 疫苗和卡介苗免疫，其對抵抗結(jié)核桿菌的感染比單獨用卡介苗更為有效6。Li和Kamath各自分別將Ag85B基因克隆到pJM4303載體中，用于免疫C57BL/6小鼠，都獲得了明顯的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。在用氣霧攻擊結(jié)核桿菌H37Rv毒菌后，均獲得了接近BCG的免疫保護(hù)力。2. 1. 3 Ag85C 對于Ag85C 基因重組的DNA 疫苗，目前發(fā)現(xiàn)其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及85A 和85B 。也有研究人員對此進(jìn)行對比研究7。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)7利用tPA（ Tissue plasminogen acti 2vator 組織纖維蛋白溶酶原激活因子）信號序列為增強子可使編碼85A，85B 和ESAT-6 的重組疫苗高水平表達(dá)，而Ag85C 編碼基因重組的DNA 疫苗卻沒有明顯效果。Ag85 基因重組疫苗免疫過的小鼠中，受tPA 免疫的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2， IFN-大大增加，利用tPA 信號序列可增強Ag85 基因重組疫苗的免疫原性，這為將來的疫苗設(shè)計起到重要啟示。2. 2 以hsp65 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗hsp65（ Heat shock protein65）是由HLA 2 DR 和2 DQ復(fù)合基因編碼的65kD 蛋白。據(jù)Tascon 等人報道，表達(dá)麻風(fēng)分枝桿菌hsp65 的重組質(zhì)粒有與BCG 相似的抗結(jié)核作用。以hsp 2 65 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-，使T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8+ / CD44 hi T 細(xì)胞。將其接種后至8 個月保護(hù)性T細(xì)胞數(shù)量和免疫水平持續(xù)上升， 15 月后逐漸下降8。在免疫后8 15 月，CTL 仍有作用。而與此對照，接種卡介苗，產(chǎn)生IFN-誘導(dǎo)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+ /CD44 lo T 細(xì)胞，在過繼轉(zhuǎn)移實驗中CD4+ /CD44 lo T 細(xì)胞被證實沒有免疫保護(hù)作用，而CD8+ /CD44 hi T 細(xì)胞才具有保護(hù)作用，因此接種DNA 疫苗的小鼠比接種卡介苗的小鼠更易受到保護(hù)。用全長的Mhsp65 編碼的DNA 疫苗可以誘導(dǎo)特異性MHC-和型T 細(xì)胞反應(yīng)9。因此在MHC -CTL 細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中Mhsp65（9369 ）有著廣闊研究前景，甚至可考慮用其來誘導(dǎo)免疫保護(hù)以抵抗更為廣泛的各種病原體。2. 3 以ESAT-6 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗ESAT-6 是由結(jié)核分枝桿菌（ M. t uberculosis）毒株和牛型分枝桿菌（ M. bovis）毒株分泌的低分子量T 細(xì)胞抗原。它是結(jié)核桿菌早期分泌性蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)能力最強的蛋白質(zhì)。能有效刺激病人外周血中CD4+ T 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)IFN-產(chǎn)生。在小鼠感染模型中， ESAT-6 特異性T 細(xì)胞主要是CD45RBlowCD44highLFA-IhighL 2selectinlowCD4+ T 細(xì)胞（可能是一種長效記憶性T 細(xì)胞），它較易分泌IFN-10。敲除ESAT6 基因能夠?qū)е陆Y(jié)核桿菌失去毒性，因此可從牛型結(jié)核桿菌中獲得活菌疫苗，并能應(yīng)用于鑒別小鼠是疫苗免疫還是結(jié)核感染11。因為試驗中接種敲除ESAT-6 基因的變異結(jié)核菌株和接種毒型結(jié)核菌株的小鼠都對PPD陽性，而只有后者對ESAT-6 試驗陽性。研究表明肌注單獨由編碼ESAT-6 的DNA 疫苗難以取得理想效果4，因為ESAT-6 不是很強的免疫原。Kamath 4等認(rèn)為編碼ESAT-6DNA 疫苗的保護(hù)作用比MPT64 強，但這兩種DNA 疫苗的保護(hù)作用并未超過BCG，所以需要加入其它免疫刺激源，如細(xì)胞因子，才能取得良好效果。Li等在構(gòu)建ESAT6 DNA疫苗時，對能表達(dá)信號肽和不能表達(dá)信號肽的DNA疫苗進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，這兩種ESAT6 DNA疫苗的免疫保護(hù)力都很高，而且試驗的重復(fù)性很好。2. 4 以MPT編碼基因重組的DNA 疫苗MPT-64 是結(jié)核菌生長過程中的分泌性蛋白，也是重要的T 細(xì)胞抗原，能誘發(fā)結(jié)核菌感染的豚鼠發(fā)生很強的DTH 反應(yīng)。1999 年Kamath 等首次將結(jié)核分枝桿菌的MPT-64 蛋白編碼基因經(jīng)骨骼肌注射免疫C57BL/ 6 小鼠，第一次免疫后2 周即可產(chǎn)生特異性抗體，每間隔3 周免疫一次，共3 次，免疫過程中血清中特異性抗體滴度逐漸增高。目前設(shè)想MPT-64 主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫應(yīng)答不是其主要反應(yīng)，這需進(jìn)一步研究其細(xì)胞免疫應(yīng)答加以證實。國內(nèi)有研究認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌MPT-64 DNA疫苗經(jīng)肌肉注射免疫小鼠只能誘導(dǎo)部分小鼠產(chǎn)生特異的體液免疫應(yīng)答，免疫效果存在明顯個體差異12。部分BCG 在減毒的過程中丟失了編碼MPT64 的基因，可用MPT64 代替PPD 作為皮試試劑，且其特異性較強，因此可以鑒別小鼠是用BCG免疫過還是結(jié)核感染。MPT-63蛋白質(zhì)也有很強的刺激T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。Li等將MPT-63基因克隆到pJW4303載體中構(gòu)建的DNA疫苗也顯示了較好的免疫保護(hù)效果；但是還需要進(jìn)一步證明其免疫保護(hù)力的重復(fù)性。2. 5 其他編碼抗原基因構(gòu)建的DNA 疫苗目前對結(jié)核桿菌其他成分及其DNA 疫苗免疫效果的研究仍在深入進(jìn)行。DNA 疫苗編碼的蛋白還有38kD 蛋白， hsp70 和36 與6kD 蛋白。PstS-1，PstS-2，PstS-3 蛋白免疫小鼠可以刺激特異性抗體產(chǎn)生（lgG），并刺激生成Th1 型細(xì)胞因子IL 2 1 和IFN-。PstS-1 DNA 免疫不能激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，PstS-2 DNA免疫僅可引起中等水平的應(yīng)答。而PstS- DNA 免疫可產(chǎn)生高水平的應(yīng)答13。目前一個主要障礙是還沒有準(zhǔn)確分離出結(jié)核菌的保護(hù)性抗原，但在小鼠和豚鼠實驗中證實，結(jié)核菌的分泌性抗原和表面抗原比胞質(zhì)抗原更易引起保護(hù)性反應(yīng)，控制結(jié)核菌的復(fù)制13。因此將在這些抗原中進(jìn)行更深一步的研究，尋找新型DNA 疫苗。3 應(yīng)用前景的展望結(jié)核DNA疫苗的研究歷史雖然很短，但是在小動物的試驗研究結(jié)果還是十分令人鼓舞的4。目前的研究重點還是在篩選不同的結(jié)核桿菌基因，然后在初步篩選出來的候選者中，進(jìn)一步在豚鼠實驗中進(jìn)行驗證和精選。由于豚鼠是結(jié)核桿菌的敏感動物，因而攻擊后臟器中的活菌數(shù)可能在免疫組和對照組之間差異不大，但是以組織的病理改變作為指標(biāo)，則可以顯示出DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。在眾多結(jié)核DNA疫苗的動物實驗中，很少能夠在動物試驗中具有BCG同樣的，甚至超過BCG的免疫保護(hù)力。例如：Carl G. Feng 發(fā)現(xiàn)單獨用編碼Ag85B 的DNA 疫苗免疫，其減少菌落數(shù)效果不如BCG 6。但如果接著接種BCG，其免疫效果就會顯著提高，脾中菌落數(shù)下降到1/ 100，而單獨用BCG 只能下降到1/ 10 。因為對DNA 疫苗致敏的TB 特異性CD8+ T細(xì)胞，BCG能起到放大其功效作用，還能極大提高Th1 型CD4 +T 細(xì)胞反應(yīng)，而后者是抵御MTB 的關(guān)鍵。通過單獨免疫去篩選保護(hù)力強的DNA 疫苗，然后加入合適的促進(jìn)劑，將會使其免疫效果大大增強。組成聯(lián)合疫苗未來結(jié)核菌DNA 疫苗的研究方向。DNA 疫苗不僅可以預(yù)防感染，還有治療作用。給嚴(yán)重感染的小鼠接種DNA 疫苗，小鼠免疫系統(tǒng)就能從原來的抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)換到殺滅滯留結(jié)核桿菌的狀態(tài)。不僅可以防止形成持續(xù)感染，還可以使已經(jīng)形成的持續(xù)感染得到清除2?？梢哉雇麑⑦@種基因治療與傳統(tǒng)的化療結(jié)合起來可能會更好更快地治療人類的結(jié)核病。DNA 疫苗可引起細(xì)胞免疫和體液免疫，這不僅僅取決于抗原的性質(zhì)，還與DNA 疫苗的接種途徑（如肌肉注射或基因槍注射），接種量密切相關(guān)?；蛎庖咧幸鸺?xì)胞免疫應(yīng)答比引起體液免疫應(yīng)答所需要的抗原量要少，即以低劑量接種時較易引起細(xì)胞免疫應(yīng)答；高劑量接種時則體液免疫應(yīng)答占優(yōu)勢。因此可利用DNA 疫苗接種的量來影響免疫應(yīng)答的類型。為了增強結(jié)核DNA疫苗的免疫保護(hù)效果，目前有如下幾個研究方向：多價疫苗；免疫調(diào)節(jié)因子；加速抗原的降解；鼻內(nèi)接種途徑。未來的DNA 疫苗關(guān)鍵是要在誘導(dǎo)INF-的分泌和CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生，以引起有效的細(xì)胞免疫。利用編碼多肽的DNA 疫苗將可能提高抵抗各種疾病的疫苗的效果，選擇合適的結(jié)核菌蛋白編碼基因和改造載體以增加DNA 疫苗的表達(dá)水平，制定完善的免疫策略和途徑、插入免疫調(diào)控序列和開發(fā)新型佐劑增強免疫應(yīng)答、提高DNA 疫苗的安全性等是今后研究的重點。參考文獻(xiàn)1. 廖國陽.基因免疫機(jī)理及安全性研究進(jìn)展J.國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊2001,24:309-312.2. 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