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微生物大小的測定和顯微鏡計(jì)數(shù)微生物大小的測定和顯微鏡計(jì)數(shù) 2010級生科一班 201000140027 洪鈞燁摘要實(shí)驗(yàn)借助特殊的測量工具顯微測微尺（包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺），在光學(xué)顯微鏡下測量釀酒酵母和枯草桿菌的大小，最終得出兩種菌大小的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對如酵母等微生物單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后得到活菌體和死菌體的總數(shù)。關(guān)鍵詞 顯微測微尺 大小 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 目的要求1 學(xué)習(xí)并掌握使用顯微鏡測微尺測定微生物大小的方法。2 了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、明確其計(jì)數(shù)原理。3 學(xué)習(xí)并掌握使用血球計(jì)數(shù)板測定微生物細(xì)胞或孢子數(shù)量的方法?；驹韑測微尺的構(gòu)造： 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成 目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份。目鏡測微尺每格實(shí)際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進(jìn)行標(biāo)定。鏡臺測微尺為一專用的載玻片，中央有精確等分線將長為 1mm 的直線等分成 100 個(gè)小格，每格長 10m，專用于校正目鏡測微尺。2.球菌用直徑表示大??；桿菌用寬和長來表示 圖1：測微尺的校正3顯微直接計(jì)數(shù)法：將小量待測樣品懸浮液置于計(jì)菌器上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。 顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板或Hawksley計(jì)數(shù)板。三種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺。中間較寬的平臺，被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)（大方格）分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成。每個(gè)大方格邊長為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常測定五個(gè)中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)= 25104B=5104AB （25個(gè)中格） = 16104B=3.2104AB（16個(gè)中格）實(shí)驗(yàn)器材菌種：酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)儀器、材料：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、擦鏡紙、香柏油、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、吸水紙、計(jì)數(shù)器、無菌滴管等。實(shí)驗(yàn)步驟1. 微生物大小的測定。（1）目鏡測微尺的安裝把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測微尺將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，利用推進(jìn)器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)（圖1）。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。 由于已知鏡臺測微尺每格長10m，根據(jù)下列公式即可分別計(jì)算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度（m）= （3）菌體大小的測定將鏡臺測微尺取下，換上細(xì)菌染色制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計(jì)算出菌體的長和寬。值得注意的是，和動植物一樣，同一種群中的不同菌體細(xì)胞之間也存在個(gè)體差異，因此在測定每一種菌種細(xì)胞大小時(shí)應(yīng)對多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測量，然后計(jì)算取平均值。2. 顯微鏡計(jì)數(shù)。（1）無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋制備酵母菌懸液。（2）鏡檢血球計(jì)數(shù)板。（3）加樣品。 血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，將酵母菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一滴，利用表面張力溝槽中流出多余的菌懸液。加樣后靜置5min，使細(xì)胞或孢子自然沉降。（4） 將加有樣品的血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)有8個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。若有菌體位于格線上，則計(jì)數(shù)原則為計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。如遇酵母出芽，計(jì)數(shù)應(yīng)統(tǒng)一，芽體應(yīng)全部作為菌體計(jì)數(shù)或全部不計(jì)。（5）清洗。使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片進(jìn)行清洗、干燥，放回盒中，以備下次使用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)I目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表長度（m）低倍鏡10高倍鏡40油鏡100表1-釀酒酵母的大?。ㄋ寄跨R測微尺原始格數(shù)，高倍鏡）菌個(gè)體項(xiàng)目123平均值長寬表2-枯草芽孢桿菌的大?。ㄋ寄跨R測微尺原始格數(shù)，油鏡）菌個(gè)體項(xiàng)目123平均值長寬根據(jù)公式即可求算出兩種菌的大小表3-兩種菌的大小菌種項(xiàng)目釀酒酵母枯草芽孢桿菌長（m）寬（m）實(shí)驗(yàn)II顯微計(jì)數(shù)結(jié)果中格12345平均值個(gè)數(shù)由公式1ml菌液中的總菌數(shù)=中格平均菌數(shù)25104稀釋倍數(shù)得1ml菌液中酵母菌個(gè)數(shù)為分析 酵母菌的菌體大小很大，長約為 m，寬約為 m，約為枯草芽孢桿菌的 倍?？莶菅挎邨U菌長與寬之比約為 ，驗(yàn)證了其“桿”菌的名字。獲得的單位體積酵母菌數(shù)較同實(shí)驗(yàn)室其他組小。可能原因本組酵母菌的培養(yǎng)時(shí)間和其他組不同；取菌懸液稀釋時(shí)，原培養(yǎng)液未搖勻，取了上層液。注意細(xì)菌在不同的生長時(shí)期細(xì)胞大小有時(shí)會有較大變化，所取的菌最好處于對數(shù)生長期。在測量時(shí)，避免將極端大小的菌體納入數(shù)據(jù)樣本。在測量枯草芽孢桿菌時(shí)，由于菌之間有連接，要選取單個(gè)的菌體進(jìn)行測量。清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板時(shí)，勿用刷子等硬物，也不應(yīng)用酒精燈火焰烘烤計(jì)數(shù)板。在計(jì)數(shù)時(shí)，每小格內(nèi)有8個(gè)菌體為宜，如果發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新進(jìn)行稀釋。思考題1 為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行校正？答：因?yàn)樵诓煌糯蟊稊?shù)的目鏡或物鏡下，目鏡測微尺每格代表的長度會發(fā)生變化。2 在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一細(xì)菌的大小時(shí)，其測定結(jié)果是否相同？為什么？答：相同。因?yàn)橛貌煌奈镧R時(shí)都重新校正目鏡測微尺，目鏡測微尺每格代表的長度可按照重新校正的數(shù)據(jù)計(jì)算。3 哪些因素會造成血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)誤差，應(yīng)如何避免？答：器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確，細(xì)胞識別錯(cuò)誤等因素所