間歇低氧對肝臟損傷機制及自噬在肝臟中作用機制的探討-碩士論文

分分 類類 號 號 R56 學校代碼 學校代碼 1 0 0 6 2 密密 級 級 學學 號 號 2012601124 學位類別 學位類別 科學學位 專業(yè)學位 學科門類 醫(yī)學學科門類 醫(yī)學 博博 士士 學學 位位 論論 文文 DOCTORAL DISSERTATION 論文題目 間歇低氧對肝臟損傷機制及自噬在肝臟中論文題目 間歇低氧對肝臟損傷機制及自噬在肝臟中 作用機制的探討作用機制的探討 T I T L E Investigation of the molecular mechanismo of IH induced hepatic injure and the effect of autophagy in Liver 一級學科 臨床醫(yī)學一級學科 臨床醫(yī)學 二級學科 內(nèi)科學二級學科 內(nèi)科學 呼吸系病呼吸系病 論文作者 邵紅霞論文作者 邵紅霞 指導教師 吳琦指導教師 吳琦 教授教授 導師組成員 孫昕導師組成員 孫昕 主任醫(yī)師主任醫(yī)師 陳懷永陳懷永 研究員研究員 天天 津津 醫(yī)醫(yī) 科科 大大 學學 研研 究究 生生 院院 二 一六年五月二 一六年五月 I 中文摘要中文摘要 目的 目的 阻塞性睡眠呼吸暫停 Obstructive sleep apnea OSA 是常見的呼吸系 統(tǒng)疾病 據(jù)統(tǒng)計有超過 10 的人群罹患此病 OSA 對于身體的嚴重危害及致死 率增加 主要是因為 OSA 常合并糖尿病 代謝綜合征 心血管系統(tǒng)疾病等 目 前很多證據(jù)顯示 由于 OSA 患者發(fā)生了氣體交換障礙 反復低血氧和高碳酸血 癥 的病生理改變 即慢性間歇低氧 chronic intermittent hypoxia CIH 導致 前炎癥因子產(chǎn)物增多 血管內(nèi)皮功能紊亂 氧化應激 代謝調(diào)節(jié)異常和胰島素 抵抗等 因為肝臟在人體是十分重要的代謝器官 肝細胞對各種內(nèi)源性和外源 性刺激如病毒感染 炎癥 營養(yǎng)等非常敏感 現(xiàn)有很多報道 OSA 與肝臟的非酒 精性脂肪性肝病 nonalcoholic fatty liver disease NAFLD 有關(guān) 本研究旨在通 過間歇低氧動物模型探討間歇低氧引起的肝臟損害 對肝臟藥物代謝酶細胞色 素酶 P450 Cytochrome P450 CYPs 的影響及作用機制 從自噬角度對間歇低 氧的作用做了進一步探討 我們的實驗證實糖皮質(zhì)激素受體 glucocorticoid receptor GR 對大鼠肝臟細胞色素酶 P450 Cyps 的表達有重要的調(diào)控作用 并且對自噬有一定影響 所以我們又通過人的正常肝細胞 LO2 細胞初步探討糖 皮質(zhì)激素在人肝臟細胞 CYPs 代謝的影響及自噬中的作用 方法 方法 1 建立間歇低氧 intermittent hypoxia IH 大鼠模型 將 30 只大鼠采用隨機數(shù) 字表法隨機分為 2 組 按照每組 15 只分組 IH 組和對照組 2 大鼠肝臟組織進行固定 包埋 病理切片 然后進行蘇木素 伊紅 HE 染色 觀察肝組織形態(tài)學改變 3 通過實時定量 PCR 方法測定炎癥因子 Cyps NF B 核受體的相對基因表達 量 4 使用實時定量 PCR 法分析肝臟自噬相關(guān)蛋白的基因表達 5 將人正常肝細胞 LO2 肝細胞進行常規(guī)培養(yǎng) 然后傳代 將傳代細胞按順序分 別接種于 6 孔板 根據(jù)加入藥物不同 分為對照組 糖皮質(zhì)激素 地塞米松 DEX 組和糖皮質(zhì)激素 糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑 DEX R 組 對照組 正常細 胞培養(yǎng) DEX 組 加入地塞米松進行培養(yǎng) DEX R 組 在 DEX 組基礎(chǔ)上加用 糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑 II 6 通過倒置顯微鏡觀察人肝細胞 LO2 細胞形態(tài)的改變及生長情況變化并進行拍 照 7 通過實時定量 PCR 方法測定肝細胞 LO2 細胞 Cyps 的相對基因表達量 8 使用實時定量 PCR 法分析測定肝細胞 LO2 細胞自噬相關(guān)蛋白的基因表達 結(jié)果 結(jié)果 1 對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變 對照組 肝小葉結(jié)構(gòu)完整 竇狀隙及匯管區(qū)未見明顯增寬及結(jié)構(gòu)紊亂 肝細胞胞膜完整 胞質(zhì)豐富 胞核 形態(tài)正常 與正常肝組織無差異 間歇低氧組 肝小葉結(jié)構(gòu)完整 竇狀隙呈輕 度增寬 肝細胞結(jié)構(gòu)完整 匯管區(qū)可見少許炎細胞浸潤 以淋巴細胞為主 少 許肝細胞胞質(zhì)稀疏 2 肝組織炎癥介質(zhì) mRNA 相對表達量的改變 IH 組 IL 1 IL 6 TNF mRNA 相對表達量較對照組升高 3 肝組織 NF B mRNA 相對表達量的改變 IH 組 NF B mRNA 相對表達量較對 照組顯著升高 4 核受體 mRNA 相對表達量的改變 IH 組 PXR GR CAR mRNA 相對表達量 較對照組下調(diào) 5 細胞色素氧化酶 P450 Cyps mRNA 相對表達量的改變 IH 組 Cyp1A2 Cyp2D4 Cyp3A2 mRNA 相對表達量較對照組下降有統(tǒng)計學差異 Cyp2C9 Cyp2C19 mRNA 相對表達量與對照組相比無明顯差異 6 細胞自噬相關(guān)基因 Atg 相對表達量的改變 IH 組與對照組相比 AMPK mTOR Beclin1 Atg5 Atg12 Atg13 ULK1 均有相應改變但無統(tǒng)計學意義 LC3 與 WIPI 的變化有統(tǒng)計學意義 7 肝 LO2 細胞生長情況 地塞米松組 LO2 細胞生長變形 呈梭形生長 而加入 糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑組 LO2 細胞生長與對照組相同 為正常細胞形態(tài) 8 肝 LO2 細胞 Cyps 表達 通過熒光實時定量 PCR 詳細闡述了各組人細胞色素 酶 P450 hCYP450 中 hCYP1A2 hCYP2C9 hCYP2C19 hCYP2D6 hCYP3A4 mRNA 在人肝臟 LO2 細胞中的相對表達量 與對照組相比 Dex 組人肝臟 LO2 細胞的 hCYP1A2 hCYP2C19 hCYP3A4 mRNA 表達量上調(diào) 相應的 Dex R 組人肝臟 LO2 細胞的上述基因表達下調(diào) 且有統(tǒng)計學差異 p 0 05 而 Dex 組 人肝臟 LO2 細胞的 hCYP2C9 基因表達量較對照組為下降趨勢 hCYP2D6 基因 表達量較對照組無顯著變化 III 9 肝 LO2 細胞自噬相關(guān)基因的表達 通過熒光實時定量 PCR 詳細闡述了各組細 胞的自噬相關(guān)基因的相對表達量 測定結(jié)果發(fā)現(xiàn) 與對照組相比 除 Dex 組人 肝臟 LO2 細胞的 Beclin1 mRNA 表達量下調(diào) p 99 99 天津六方氣體高科技有限公司 光學顯微鏡及成像系統(tǒng) 日本 Olympus BX53 A51 C51 編譯器 Visual C 語言編制程序 美國微軟公司 O2 濃度監(jiān)測器 CO2 濃度監(jiān)測器瑞士夏美頓公司 RM2135 切片機 德國 Leica 公司 HI1210 展臺 德國 Kica 公司 電熱干烤箱 重慶銀河實驗儀器有限公司 普通顯微鏡 日本 OLYMPUS 公司 倒置顯微鏡 日本 OLYMPUS 公司 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠 電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司 UV1601 紫外分光光度計 美國 BectonDickinson 公司 1 1 2 2 實驗試劑 主要試劑主要試劑 主要廠家主要廠家 10 多聚甲醛 天津市海河醫(yī)院病理科 糖原染色液 武漢金宏生物科技發(fā)展有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 美國圣克魯斯生物技術(shù)公司 3 3 二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 9 Mayer s HE 染色液 美國圣路易公司 75 酒精 95 酒精 無水乙醇 天津市化學試劑三廠 二甲苯 天津市化學試劑三廠 TritonX 100 北京索萊寶科技有限公司 碳酸氫鈉 天津市化學試劑三廠 枸櫞酸鈉 天津市化學試劑三廠 高碘酸 天津市化學試劑三廠 檸檬酸液 天津市化學試劑三廠 PBS 粉劑 北京索萊寶科技有限公司 NF B p65 引物 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 GAPDH 引物 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 美國 Fermentas 公司 1 1 3 實驗方法 1 1 3 1 實驗動物分組 30 只 Wistar 成年雄性大鼠 按照隨機表法隨機分為 2 組 每組 15 只 實驗 共進行 14 周 對照組 假間歇低氧組 每天在大鼠睡眠時段 9 00 17 00 給 予空氣 30 秒和空氣 90 秒交替暴露 IH 組 間歇低氧組 每天在大鼠睡眠時段 9 00 17 00 給予 5 O2 平衡 N2 30 秒和空氣 90 秒交替暴露 1 1 3 2 間歇低氧大鼠模型建立 將大鼠置于間歇低氧暴露裝置內(nèi) 從第 1 周起在大鼠睡眠時段 9 00 17 00 向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣 5 O2 平衡 N2 和空氣 每一循環(huán)持續(xù) 120 秒 其中 30 秒 10 充入氮氣 10 L min 90 秒充入空氣 15 L min 50 秒 5 L min 40 秒 1 小 時睡眠時間共進行 30 次循環(huán) 文獻表明 大鼠發(fā)作性間歇低氧時 其最低動脈 血氧分壓約為 55 65 mmHg 而其最高潮氣末二氧化碳為 63 6 8 6 mmHg 我 們預實驗技術(shù)參數(shù)表明 當實驗大鼠暴露于間歇低氧 5 O2 30 秒 Air 90 秒 時 其最低動脈血氧分壓約為 53 5 5 mmHg 基本可以在大鼠身上模擬出 OSA 時 IH ROX 的暴露情況 對照組大鼠置于同樣裝置內(nèi) 但給予空氣 30 秒和空氣 90 秒交替暴露 其余飼養(yǎng)方式 間歇低氧組與對照組相同 1 1 3 3 大鼠肝組織留取 實驗第 14 周時 將實驗大鼠先用戊巴比妥鈉麻醉 然后頸椎脫臼法處死 打開腹腔 暴露肝臟 每組 15 只大鼠取肝右葉相同部位組織 0 5 cm 0 5 cm 兩塊 一塊放入 10 福爾馬林固定液中固定 2 小時 固定的肝組織經(jīng)石蠟包埋 連續(xù)切片 根據(jù)載玻片的不同將切片分為兩類 一類用作常規(guī) HE 染色 一類用 于免疫組化 片子均在光鏡下觀察 另一塊肝組織放入 1ml TRIZOL 試劑中 置 于 80 冰箱保存 1 1 3 4 大鼠肝組織 HE 染色 在 10 中性緩沖福爾馬林液中固定后 將肝組織石蠟包埋后切成 5 m 厚度 然后將切片放于蘇木素染液染色后在有 DP80 相機的 Olympus IX71 顯微鏡下照 相 1 組織石蠟包埋 切片 組織塊經(jīng)過脫水 透明 浸蠟 將石蠟旋轉(zhuǎn)切片機連續(xù)切片 切片厚度為5 m 所制的組織石蠟片由載玻片撈取后 置于 37 溫箱內(nèi)過夜 后置于 4 冰箱內(nèi) 備用 2 H E 切片制作 石蠟切片脫蠟 蘇木素染液染色 5 15 分鐘 1 鹽酸酒精分色 3 秒鐘 自來水沖洗 3 5 分鐘 顯微鏡下觀察著色程度 適宜后 蒸餾水洗 1 2 次 0 5 水溶性伊紅染液染色 1 2 分鐘 蒸餾水沖洗 1 2 次 常規(guī)脫水 透明 中性樹膠封固 1 1 3 5 總 RNA 提取及實時定量 PCR 11 1 1 3 5 1 RNA 分離純化 Qrt PCR 1 取 100mg 肝組織加入 1 mL TRIZOL 冰浴條件下在研磨器中研磨 2 4 12000 g 離心 10 min 上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf 管 加入 0 2 mL 氯仿 震蕩混勻 靜置 10 min 3 12000g 離心 10 min 小心吸取上清 加入 0 5 mL 異丙醇 靜置 10 min 4 4 12000g 離心 10 min RNA 呈膠樣沉淀 5 小心棄去上清 每管加入 1 mL 75 乙醇 旋渦洗滌 6 4 7500g 離心 10 min 棄上清 置 37 孵箱干燥 7 加入 20 L DEPC 處理過的去離子水溶解 8 用紫外分光光度計測定 A260 與 A280 的吸光值 要求 A260 A280 比值在 1 8 2 0 之間 以保證提取的 RNA 純度 采用 Superscript 反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)進行反轉(zhuǎn)錄 20 L 體系中加入 2 g 總 RNA 1 L oligodT ddH2O 至 10 L 70 溫育 5 min 冰上冷卻 5 min 加入 5 反應 緩沖液 4 L 0 1mmol L DTT 2 L 10mmol L dNTP 1 L 反轉(zhuǎn)錄酶 1 L 加 DEPC 處理水至 25 L 混勻后 42 溫育 60 min 70 15 min 終止反應 1 1 3 5 2 cDNA 合成 采用 TIANScript RT 合成 cDNA 按照試劑盒提供的實驗步驟以 oligo dT 20 為引物 將總 RNA 3 g 在 M MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下 合成 cDNA 反應體 系為 20 L 陰性對照組中不含有 M MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 以觀察標本中是否被基因 組 DNA 所污染 以試劑盒所提供的 Hela 細胞 RNA 作為陽性對照組 1 1 3 5 3 IL 1 IL 6 TNF NF B PXR CAR GR Cyps 實時定量 PCR 以 SYBR Green 染 料 作 為 PCR 定 量 基 礎(chǔ) 特 定 基 因 引 物 通 過 Primer Quest SM 軟件設(shè)計基因引物 表 1 CFX96 Real Time 系統(tǒng)完成 DNA 擴增 PCR 反應體系為 SYBR Green PCR master mix 5 l 12 Primers 10 M 0 3 l cDNA 1 l Distill water 3 7 l Total volume 10 l 表表 1 反應引物序列表反應引物序列表 Gene Forward Primer Reverse Primer Gapdh 5 ACTCCCATTCTTCCACCTTTG 3 5 AATATGGCTACAGCAACAGGG 3 IL 1 5 TCCCTGAACTCAACTGTGAAATA 3 5 GGCTTGGAAGCAATCCTTAATC 3 IL 6 5 GAAGTTAGAGTCACAGAAGGAGTG 3 5 GTTTGCCGAGTAGACCTCATAG 3 TNF 5 ACCTTATCTACTCCCAGGTTCT 3 5 GGCTGACTTTCTCCTGGTATG 3 NF B 5 AGACATCCTTCCGCAAACTC 3 5 TAGGTCCATCCTGCCCATAA 3 PXR 5 GAAGATCATGGCTGTCCTCAC 3 5 CGTCCGTGCTGCTGAATAA 3 CAR 5 AGACCATGACCAGTGAAGAAG 3 5 AGTCAGGGCATGGAAATGATAG 3 GR 5 CAGCAGTGAAATGGGCAAAG 3 5 GGGCAAATGCCATGAGAAAC 3 Cyp1A2 5 GACAAGACCCTGAGTGAGAAG 3 5 GAGGATGGCTAAGAAGAGGAAG 3 Cyp2D4 5 CCTTTCAGCCCTAACACTCTAC 3 5 ATGAAGCGTGGGTCATTGT 3 Cyp2C9 5 CCCAAGGGCACAACCATATTA 3 5 TTTCTGGATGAAGGTGGCA 3 Cyp2C19 5 CCCAAGGGCACAACCATATTA 3 5 TTTGACCCTCGTCACTTTCTG 3 Cyp3A2 5 GGAAACCCGTCTGGATTCTAAG 3 5 GAAGTGTCTCATAAAGCCCTGT 3 反應條件為 95 預變性 2 min 95 變性 25sec 60 退火 25sec 70 延伸 20sec 重復 40 個循環(huán) 以 95 15sec 58 15sec 及 95 15sec 的變化繪制 13 離解曲線 每個樣本用 Prism 7500 型實時定量 PCR 儀進行 PCR 反應 3 次 數(shù)據(jù) 采用 ABI Prism 7500 SDS 軟件包進行分析 確定每次反應的循環(huán)閾值 采用 2 Ct 法比較樣本中靶基因的相對表達量 根據(jù)得出的 Ct 值 儀器自動分析 得出代表相對表達量的 RQ 值 1 1 4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差 x s 表示 采用 SPSS15 0 軟件分析數(shù)據(jù) 兩 組間比較采用非配對 t 檢驗分析 p 0 05 認為差異具有統(tǒng)計學意義 1 2 結(jié)果結(jié)果 1 2 1 實驗大鼠肝組織病理學形態(tài)觀察 將對照組大鼠及間歇低氧組大鼠肝臟組織經(jīng)過 HE 染色后 在光鏡下分別通 過 100 倍及 400 倍觀察 可以發(fā)現(xiàn)對照組肝組織細胞等與正常肝組織相同 而 IH 組肝組織受到了不同程度破壞 文獻中關(guān)于間歇低氧引起病變以脂肪變性為 主 而我們的肝組織變性以炎性細胞浸潤為主 如圖 1 2 圖 1 3 Control 組 100 IH 組 100 圖圖 1 2 對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變 對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變 HE 100 對照組 肝小葉結(jié)構(gòu)完整 竇狀隙及匯管區(qū)未見明顯增寬及結(jié)構(gòu)紊亂 間歇低氧組 肝小葉結(jié)構(gòu)完整 竇狀隙呈輕度增寬 少許肝細胞胞質(zhì)稀疏 未見肝細胞變性現(xiàn)象 肝細胞結(jié)構(gòu)完整 14 Control 組 400 IH 組 400 圖圖 1 3 對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變 對照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變 HE 400 對照組 肝細胞胞膜完整 胞質(zhì)豐富 胞核形態(tài)正常 間歇低氧組 肝細胞結(jié)構(gòu)完整 匯管區(qū)可見少 許炎細胞浸潤 以淋巴細胞為主 少許肝細胞胞質(zhì)稀疏 1 2 2 肝組織炎癥介質(zhì) mRNA 定量 PCR 結(jié)果 我們的通過實時定量PCR詳細闡述了大鼠肝組織中炎癥介質(zhì)mRNA的相對 表達量 我們實驗所測的炎癥因子 IL 1 IL 6 TNF 主要由單核 巨噬細胞 淋巴細胞 內(nèi)皮細胞等在細胞應激等情況下下分泌 從肝組織病理學改變我們 已經(jīng)知道肝臟有較多炎性細胞浸潤 并且以淋巴細胞為主 實驗數(shù)據(jù)顯示 間 歇低氧暴露的大鼠肝組織 IL 1 mRNA 表達較對照組明顯升高 與對照組相比 具有統(tǒng)計學差異 p 0 05 同時我們檢測的 IL 6 和 TNF mRNA 表達與 IL 1 變化一致 如圖 1 4 圖圖 1 4 肝組織中炎癥介質(zhì)肝組織中炎癥介質(zhì) mRNA 表達結(jié)果表達結(jié)果 注 表示與對照組比較有統(tǒng)計學差異 p 0 05 15 1 2 3 肝組織 Cyp450 mRNA 相對表達量結(jié)果 從上面的實驗中我們得知 間歇低氧可以引起大鼠肝臟組織改變及炎癥反 應 藥物代謝是肝臟在體內(nèi)重要作用之一 藥物代謝酶主要分為兩種 I 相代謝 酶主要指細胞色素 P450 cytochrome P450 CYP II 相代謝酶主要包括葡萄糖 醛轉(zhuǎn)移酶 谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶 磺基轉(zhuǎn)移酶和乙?；D(zhuǎn)移酶等 我們的實驗通 過大鼠 Cyps 的檢測來觀察間歇低氧是否影響肝臟藥物代謝 細胞色素 P450 CYPs 基因變異較大 與藥物代謝最密切的是 CYP1 CYP2 和 CYP3 三個家 族 我們通過實時定量 PCR 詳細闡述了 CYPs 中 Cyp1A2 Cyp2C9 Cyp2C19 Cyp2D4 Cyp3A2 mRNA 在肝組織中的相對表達量 與對照組相比 間歇低氧 組 Cyp1A2 Cyp2D4 Cyp3A2 mRNA 表達量下調(diào) 且有統(tǒng)計學差異 p 0 05 圖 1 5 B C 圖圖 1 5 肝組織中肝組織中 CYPs mRNA 表達結(jié)果表達結(jié)果 注 表示與對照組比較有統(tǒng)計學差異 p 0 05 16 1 2 4 肝組織中 NF B mRNA 相對表達量結(jié)果 間歇低氧引起大鼠肝臟炎癥因子表達增加 藥物代謝酶細胞色素 P450 改變 這兩者中的聯(lián)系我們猜測可能否與 NF B 信號轉(zhuǎn)導有關(guān) NF B 是核轉(zhuǎn)錄因子 的一種 可以與免疫球蛋白 B 輕鏈結(jié)合 主要在炎癥情況下由免疫細胞所分泌 NF B 相關(guān)的炎癥信號轉(zhuǎn)導途徑在炎癥的發(fā)生發(fā)展中有著極其重要的作用 前 炎癥因子 IL TNF 等可以促進 NF B 分泌 我們的實驗通過實時定量 PCR 測定肝組織中 NF B 的的相對表達量 如圖 1 6 數(shù)據(jù)顯示 IH 組 NF B 的表 達量較對照組明顯升高 且有統(tǒng)計學差異 p 0 05 而值得我們注意的是 NF B 可以正反饋調(diào)節(jié)炎癥因子 NF B 通路 促進炎癥因子釋放 NF B 另一 方面的重要作用是激活核受體 圖圖 1 6 肝組織中肝組織中 NF B mRNA 表達結(jié)果表達結(jié)果 注 表示與對照組比較有統(tǒng)計學差異 p 0 05 1 2 5 肝組織中核受體 mRNA 相對表達量結(jié)果 核受體是一個轉(zhuǎn)錄因子超家族 目前已知 CYPs 的表達主要受孕烷受體 PXR 組成型雄甾烷受體 CAR 的影響 炎癥因子 IL 及 TNF NF B 通路可以抑制核受體 我們通過實時定量 PCR 詳細闡述了肝組織中核受體 mRNA 的相對表達量 圖 1 7 A B 所示 與對照組相比 間歇低氧組 PXR CAR mRNA 表達量較對照組下調(diào) 具有統(tǒng)計學意義 p 0 05 證實了炎癥因子通過 17 核受體途徑抑制了大鼠 Cyps 的表達 我們的實驗還檢測到糖皮質(zhì)激素受體 GR mRNA 在低氧暴露下 表達量下調(diào) 圖 1 7 C 具有統(tǒng)計學意義 p 0 05 圖 1 7 肝組織中核受體 mRNA 表達結(jié)果 注 表示與對照組比較有統(tǒng)計學差異 p 0 05 1 3 討論討論 1 3 1 阻塞性睡眠呼吸暫停與器官損害 阻塞性睡眠呼吸暫停 Obstructive sleep apnea OSA 是常見的呼吸系統(tǒng)疾 病 在美國發(fā)病率約為 7 17 這意味著約 2 千萬美國人患病 5 由于夜間睡 眠質(zhì)量差 使患者白天易疲勞及嗜睡 不僅影響正常工作學習 使司機 高空 作業(yè)等職業(yè)具有較大潛在風險 19 OSA 常常會合并心腦血管等并發(fā)癥 同時也 是 OSA 患者常見的死亡原因 OSA 是以反復發(fā)作呼吸暫停 循環(huán)性間歇低氧 反復的胸內(nèi)壓降低 睡眠覺醒紊亂為特點 20 雖然反復覺醒和胸內(nèi)壓改變是交 感神經(jīng)興奮的原因 但是間歇低氧是引起器官損害和死亡的重要原因 在器官損害方面 心血管系統(tǒng)損害在 OSA 患者中最常見 盡管 很多心血 18 管發(fā)病的危險因素 性別 年齡 肥胖 高血壓 糖耐量異常 在 OSA 患者中 均存在 但是 OSA 已成為心血管疾病的獨立危險因素 在 30 年前 高血壓與 OSA 的關(guān)系就被人們所關(guān)注 21 Wisconsin 睡眠隊列研究通過 4 年隨訪發(fā)現(xiàn)了 發(fā)現(xiàn)了睡眠暫停嚴重程度與高血壓發(fā)生的劑量 效應關(guān)系 22 另一個前瞻性的 隊列研究同樣證實了 OSA 與高血壓的劑量關(guān)系 同時發(fā)現(xiàn)連續(xù)的的持續(xù)氣道正 壓通氣治療 CPAP 可以改善高血壓狀況 23 心律失常尤其房顫發(fā)生顯著 其 他如室性心動過速 室顫 竇性停搏 房室傳導阻滯 復雜的室性逸搏 室上 性心動過速 心動過緩均可發(fā)生于 OSA 患者中 流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn) 心房顫動 在睡眠障礙性呼吸 sleep disordered breathing SDB 患者中發(fā)生率要比常人高 4 5 倍 23 同樣研究顯示 通過持續(xù)氣道正壓通氣治療 CPAP 可以降低心律 失常發(fā)生率 并且有報道稱 持續(xù)氣道正壓通氣治療治療可以使心律失?；颊?在不服用抗心律失常藥情況下 生存率提高 24 在 1998 年 Javaheri 發(fā)現(xiàn)充血 性心力衰竭 左室射血分數(shù) 45 的患者中有約一般患者存在睡眠性呼吸障礙 25 OSA 可以引起充血性心力衰竭 而充血性心力衰竭可以使 OSA 惡化 肺動 脈高壓是另一種與 OSA 密切相關(guān)的心血管疾病 持續(xù)氣道正壓通氣治療 CPAP 可以改善充血性心力衰竭患者預后 并且對于肺動脈高壓患者有助于降低肺動 脈壓力 26 對于 SDB 患者合并心血管系統(tǒng)損害認識及研究非常重要 不僅因為 心血管疾病引起的社會經(jīng)濟負擔 更因為有效的 OSA 治療對于降低心血管系統(tǒng) 風險非常重要 除了常見的高血壓 心律失常 充血性心力衰竭和肺動脈高壓 冠狀動脈性心臟病的發(fā)生亦可能跟 OSA 相關(guān) 27 重要的是 持續(xù)氣道正壓通氣 治療治療可以降低嚴重 OSA 患者的心血管疾病風險 28 OSA 引起神經(jīng)系統(tǒng)損害主要是中風 29 上面我們提到的與 OSA 相關(guān)的心房 顫動 心衰和高血壓均可導致中風 但是睡眠與心臟健康研究通過橫斷面調(diào)查 發(fā)現(xiàn) OSA 是引起中風的獨立因素 且對于曾發(fā)生過腦血管事件的患者 中風再 發(fā)的發(fā)生率較未發(fā)生患者更高 30 OSA 可引起不同程度的神經(jīng)認知損害 交通 事故和工作率降低在 OSA 合并神經(jīng)認知損害的患者中常常出現(xiàn) 一些研究評估 OSA 患者的神經(jīng)認知發(fā)現(xiàn) 在總結(jié)歸納 注意力 警覺性 學習和記憶方面均 有影響 31 通過治療 OSA 可以改善 OSA 患者的動脈硬化程度 降低中風的發(fā) 生率 睡眠的改善可以提高工作效率 減少交通事故發(fā)生 32 OSA 對代謝有負面調(diào)節(jié)作用 尤其中 重度 OSA 影響尤為明顯 OSA 對 代謝的影響主要是糖耐量和脂質(zhì)代謝異常 下丘腦 垂體 腎上腺素軸 異常的交 19 感神經(jīng)興奮 炎癥反應和氧化應激作用是 OSA 引起糖代謝紊亂的主要媒介 33 胰島素抵抗的發(fā)生在 OSA 患者中非常普遍 通過對 OSA 患者進行 CPAP 治療 可顯著改善胰島素抵抗情況 OSA 引起血脂異常表現(xiàn)在高密度脂蛋白異常 總 膽固醇 低密度脂蛋白和甘油三酯水平升高 具體機制目前不明 目前很多數(shù) 據(jù)顯示 OSA 可以降低脂蛋白清除 增加脂肪分解 增強肝脂輸出水平 11 OSA 所引起的器官損害已被人們所認識并重視 除了上述損害 OSA 對于 肝臟系統(tǒng)的損害也在逐漸被關(guān)注 有很多研究證實 OSA 引起的間歇低氧可以 引起慢性肝損害 2003 年 Chin 等人發(fā)現(xiàn)三分之一的 OSA 患者轉(zhuǎn)氨酶升高 34 2005 年 Tanne 等人報道嚴重的 OSA 是不依賴于肥胖引起脂肪肝的危險因素 35 2007 年 Savransky 等人證實慢性間歇低氧引起的血脂紊亂可以促使單純脂肪肝 進展為脂肪性肝炎 36 從臨床研究發(fā)現(xiàn) 通過持續(xù)氣道正壓通氣等改善通氣及低氧情況的治療 隨 著 OSA 癥狀的改善 器官損害也有所好轉(zhuǎn) 所以越來越多的人認為間歇低氧是 引起各種器官損害的元兇 而非單一合并癥對其他疾病影響 OSA 所存在的間 歇低氧引起的氧化應激損害了線粒體功能 主要通過激活低氧誘導因子 HIF 一方面 HIF 1 激活 進一步激活 NADPH 氧化酶 另一方面 HIF 2 激活降低了 抗氧化劑的水平 從而使活性氧 Reactive Oxygen Species ROS 和活性氮 Reactive Nitrogen Species RNS 的水平升高 HIF 1 的活化可以使血管內(nèi)皮 生長因子 Vascular Endothelial Growth Factor VEGF 表達和血管生成增強 促使腫瘤生長 間歇低氧還可以使頸動脈竇介導的交感神經(jīng)興奮引起血壓升高 同時血管內(nèi)皮粘附因子表達增加和 TNF IL 6 CRP 等炎癥因子水平升高 進 一步促進 NF B 的活化 引起全身和血管炎癥反應 37 間歇低氧還可以導致 I 型血管緊張素 II 受體活化 醛固酮水平升高 內(nèi)皮素 1 水平升高 eNOS 水平降 低 這些變化使血管收縮和血壓升高 所以 OSA 可以導致氧化應激 系統(tǒng)和 血管炎癥反應 血管收縮和血壓升高從而引起多器官功能損害 38 綜上所述 OSA 所導致的直接間歇低氧是引起器官損害的主要原因 我們 的實驗是通過大鼠間歇低氧模型模擬睡眠呼吸暫停綜合癥的低氧狀態(tài) 來分析 間歇低氧對肝臟的損害 包括炎癥因子表達 藥物代謝酶 Cys 的影響和機制 20 1 3 2 間歇低氧引起肝臟的損害 我們通過間歇低氧大鼠病理發(fā)現(xiàn)肝細胞結(jié)構(gòu)完整 竇狀隙呈輕度增寬 匯管 區(qū)可見少許炎細胞浸潤 淋巴細胞為主 少許肝細胞質(zhì)稀疏 而對照組病理顯 示正常肝組織 未見上述表現(xiàn) Shu zhi Feng 等人通過對血脂紊亂的小鼠間歇低 氧模型觀察 在高脂飲食同時聯(lián)合間歇低氧 3 周 可以從小鼠肝臟觀察到脂肪 變性 在 6 周 可以觀察到脂肪性肝炎的表現(xiàn) 如肝細胞水腫 炎癥細胞浸潤 肝小葉局灶性壞死等 9 周后 肝組織損傷更為嚴重 如 彌漫性脂肪變性 明 顯的細胞水腫 炎細胞浸潤 局灶性凋亡 門靜脈和肝竇周圍纖維化 對照組 小鼠僅以單純的高脂飲食喂養(yǎng) 9 周后脂肪性肝炎程度比合并間歇低氧組要輕微 39 文獻及我們的試驗均證實 間歇低氧可以引起肝臟組織的損害 與文獻報 道相比 我們的實驗中未見脂肪性肝炎等表現(xiàn) 肝細胞結(jié)構(gòu)完整 僅表現(xiàn)出竇 間隙增寬 炎細胞浸潤及肝細胞質(zhì)稀疏 這可能與暴露時間及間歇低氧的氧濃 度有關(guān) 炎癥反應是間歇低氧引起器官損害最常見表現(xiàn) 因為在全身氧化應激的情況 下 免疫細胞被激活 然后活性氧自由基 ROS 產(chǎn)生引起炎癥反應 腫瘤壞死 因子 TNF 及白介素 如 IL 1 IL 4 IL 6 IL 8 IL 10 是 T 細胞及單 核細胞分泌的炎癥因子 這已在眾多炎癥反應中被發(fā)現(xiàn) 證據(jù)表明 OSA 的在 炎癥因子調(diào)節(jié)方面最直接作用是 TNF 產(chǎn)生 很多研究闡述了 OSA 患者 TNF 水平升高 在經(jīng)過持續(xù)氣道正壓通氣治療后 TNF 水平有所下降 40 IL 等炎 癥因子的表現(xiàn)與 TNF 相似 我們在間歇低氧大鼠模型的肝組織中檢測到了前 炎癥因子 TNF IL 1 IL 6 且水平較對照組高 有很多研究報道指出 IL 6 與非酒精性脂肪性肝炎 NASH 有重要關(guān)系 14 15 眾所周知 IL 6 很多炎癥條 件下可以產(chǎn)生 但是 IL 6 不僅因炎癥反應產(chǎn)生還有抗炎作用 另外 還有調(diào) 節(jié)代謝 再生和神經(jīng)系統(tǒng)等作用 在 NASH 中 TNF 水平成倍升高 然而在 很多炎癥反應 感染和腫瘤中也可以發(fā)現(xiàn)其升高 說明 TNF 是炎癥反應重要 的標記物 總之 我們在間歇低氧大鼠模型的肝組織中發(fā)現(xiàn)多種炎癥因子水平 升高 充分說明間歇低氧引起肝臟炎癥反應 藥物代謝作用是肝臟的主要生理作用之一 而低氧可以影響藥物代謝 給兔 子應用茶堿 予 24 小時中度低氧 PaO2 34mmHg 檢測發(fā)現(xiàn)茶堿的清除率下 降 同樣 低氧情況下 茶堿的代謝率在小鼠肝細胞和大鼠肝臟中的代謝率均 21 下降 與此觀點相反 Du Souich 等人通過臨床研究發(fā)現(xiàn)低氧不影響茶堿代謝率 Streit 等人也發(fā)現(xiàn)急性低氧對茶堿代謝無影響 因為間歇低氧與急性低氧或慢性 低氧是不同的病生理機制 對于藥物代謝可能有不同的特殊機制 41 藥物在肝臟的代謝主要依靠藥物代謝酶 drug metablic enzymes DMEs I 相藥物代謝酶細胞色素 P450 Cytochrome P450 CYPs 是肝臟藥物代謝酶的重 要組成部分 在藥物代謝方面起到了重要作用 細胞色素 P450 CYPs 基因變 異較大 與藥物代謝最密切的是 CYP1 CYP2 和 CYP3 三個家族 90 的藥物 依靠這三個家族代謝 42 肝臟受損時 營養(yǎng)缺乏 缺血 感染等 CYPs 表達 受到影響從而影響對藥物的代謝 使藥物失效或毒副作用增加 在體外 48 小時 的低氧環(huán)境暴露后 人肝癌衍生的 HepG2 細胞的 CYP2J2 表達下調(diào) 但是血管 平滑肌細胞的 CYP2C9 表達上調(diào) 43 中度低氧暴露 24 小時 兔肝細胞中 CYP1A1 和 1A2 蛋白減少 CYP3A6 蛋白增加 這些結(jié)果說明 低氧對于不同的 CYP 異 構(gòu)體在不同細胞中有不同作用 我們的實驗檢測了 CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D4 和 CYP3A2 的水平 結(jié)果顯示 CYP1A2 CYP2D4 和 CYP3A2 間歇低氧組與對照組有統(tǒng)計學差異 而 CYP2C9 和 CYP2C19 無統(tǒng)計學差異 但 是從圖中可以看出間歇低氧組的 CYP 表達呈降低趨勢 肝臟疾病影響藥物代謝 主要是引起肝臟損傷導致 CYP 活性降低 CYP 活 性的抑制可能與嚴重肝臟疾病有關(guān) 中度肝功能紊亂 Child A 分級 輕度抑制 CYP1A2 介導的藥物清楚率 嚴重肝功能紊亂 Child C 分級 顯著抑制 CYP1A2 介導的藥物清除率 急性缺氧可能引起重度肝損害 慢性持續(xù)低氧可以導致肝 損傷 這些從組織學上都可以表現(xiàn)為不同程度的中心小葉型肝細胞凋亡 我們 的實驗病理已證實 慢性間歇低氧可以引起肝損傷 炎癥因子表達增加 同時 CYP 表達水平降低 可以影響藥物代謝 有觀察顯示 間歇低氧給予對乙酰氨 基酚 200mg Kg 可以導致肝壞死和肝細胞凋亡 44 間歇低氧時聯(lián)合異煙肼和 利福平治療可以導致肝細胞超微結(jié)構(gòu)破壞 45 這些證據(jù)提示我們 OSA 下調(diào) CYP 水平 聯(lián)合應用肝毒性藥物可能加重肝損害 各種炎癥因子刺激 如細菌感染或肺感染引起的炎癥反應可以下調(diào)細胞色素 P450 基因的表達 這被很多實驗所描述 46 我們通過間歇低氧模型引起的肝臟 損害 在發(fā)現(xiàn)炎癥因子表達增加的同時 發(fā)現(xiàn)多種 CYP 表達降低 從我們的實 驗中 間歇低氧對于肝臟損害已經(jīng)明確 雖然 CYP 表達趨勢均表現(xiàn)為下調(diào) 卻 不是均有臨床意義 這可能與眾多 CYP 類型所受調(diào)控路徑不同有關(guān) 所以對炎 22 癥因子與 CYP 表達之間的通路 我們在本實驗中也做了初步研究 1 3 3 NF B 核受體通路在肝臟中的作用 真核細胞轉(zhuǎn)錄因子核因子 nuclear factor NF B 是炎癥反應重要的調(diào)節(jié) 因子 可以在所有類型細胞表達 NF B 激活有經(jīng)典的 Toll 樣受體途徑和非經(jīng) 典 旁路 途徑兩種方式 非經(jīng)典途徑在 B 細胞的激活中有非常重要的作用 NF B 是 Rel 蛋白家族成員 以同二聚體和異二聚體多種形式存在 包括 RelA P65 P50 和前體 P105 NF B1 和 RelB cRel P52 和前體 p100 NF B2 非活化的 NF B 二聚體貯存于胞質(zhì)中 NF B 的抑制子 IkB 家族成員可以與 NF B 結(jié)合并掩蓋核定位信號 當 IkB 激酶 IKK 和 IKK 磷酸化以后 IkB 蛋 白體發(fā)生降解 47 在經(jīng)典途徑中 前炎癥因子如 TNF 或致癌基因促進激酶信 號級聯(lián)反應 導致 IkB 磷酸化和泛素化街道的蛋白體降解 最終 NF B 釋放 進入細胞核 在旁路途徑 活化的 IKK 使 NF B 前體 p100 RelB 磷酸化 前蛋白體使這些前體變成激活的 p52 RelB 異質(zhì)二聚體 然后 活化的 NF B 二 聚體作用于免疫應答相關(guān)的基因表達 增殖 凋亡和通過與目標 DNA 序列結(jié)合 使某個病毒基因表達 NF B 參與炎癥初始及進程反應中 尤其 OSA 引起的心 血管和脂肪組織的炎癥與內(nèi)皮細胞 脂肪組織巨噬細胞 脂肪細胞中 NF B 活 性增強有關(guān) 更進一步 NF B 在人和動物肝細胞和肝星形細胞的活化與肝胰 島素抵抗 肝細胞凋亡 非酒精性肝病和肝細胞癌發(fā)展有關(guān) 48 目前 已經(jīng)發(fā) 現(xiàn) OSA 在低氧條件下 不依靠 HIF 系統(tǒng)性激活 NF B 的病生理新機制 13 在 低氧條件下 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子 激活鈣依賴的 IKK 激酶轉(zhuǎn)化生長因子 活化 激酶 transforming growth factor activated kinase TAK 1 TAK 1 磷酸化 1kBa 然后促使 RelA 亞單位釋放 NF B 激活 轉(zhuǎn)運至細胞核 低氧可以抑制特殊的 相撲蛋白酶 specific sumo proteases Senps 導致 IKB 的 sumo 2 3 鏈增加 這樣可以使 IKBa 和活化的 NF B 釋放 RelA 另外 NF B 途徑與可誘導 NO 合成酶 iNOS 環(huán)氧化酶 COX 2 和金屬蛋白 9 產(chǎn)生引起的氧化應激和 活性氧 ROS 有關(guān) 通過細胞培養(yǎng)觀察 ROS 從低氧的肝細胞中釋放 通過 IkB 磷酸化和 NF B 信號激活可以直接激活肝星形細胞 間歇低氧誘導產(chǎn)生的 NF B 可以上調(diào)多種炎癥因子和趨化因子 包括 IL 1 IL 1 IL 2 IL 4 IL 6 IL 8 I 10 IL 13 IL 15 IL 18 TNF TNF IFN IFN 和巨噬細胞抑制蛋白 23 1b 49 TNF 的濃度與 OSA 的嚴重程度有關(guān) 8 TNF 對于睡眠有調(diào)節(jié)作用 除 外了肥胖因素 OSA 患者的 TNF 水平比正常人群要高 經(jīng)過 CPAP 治療后 TNF 水平降低 進一步說 OSA 患者的 TNF 分泌戒律改變 夜間的峰分泌 被異常的日間峰分泌所替代 在夜間低氧時 脂肪細胞和單核細胞通過 NF B 途徑分泌 IL 6 50 IL 6 在肝臟刺激 CRP 產(chǎn)生 并且參與了睡眠紊亂的炎癥過程 OSA 患者的 IL 6 水平與健康對照組相比升高 但是 IL 6 的生理節(jié)律與 TNF 的節(jié)律改變不一致 TNF 和 IL 1 水平不僅在 OSA 患者中升高 還與胰島素抵 抗 代謝綜合征和肥胖有關(guān) CYP 在外源性和內(nèi)生性復合物引起的代謝中有重要作用 在小鼠中 有 102 個功能性 CYP 基因和 88 個假性基因 在人類有 57 個功能性基因和 58 個假性基 因 有 3 個 P450 基因家族 分別是 CYP1 3 用來在肝臟編碼并表達 P450 酶來 代謝外源性復合物如藥物 化學物 其他外源性和內(nèi)源性脂質(zhì)底物結(jié)合 51 P450 基因有多種路徑和多水平調(diào)控 有特異性組織表達 通過內(nèi)源性激素和細胞因 子表達 對不同外源性化學結(jié)構(gòu)的應答 大多數(shù) CYP 激活通過相似途徑 即受 體轉(zhuǎn)錄因子配體激活途徑 受體轉(zhuǎn)錄因子包括 孕烷 X 受體 Pregnane X Receptor PXR 雄甾烷受體 constitutive androstane receptor CAR 等 可以增加 CYP 轉(zhuǎn)錄 在炎癥和感染時 肝臟對于藥物和外源性物質(zhì)代謝能力下降已經(jīng)被很多體外 實驗 動物和臨床實驗所證實 其分子學機制尚未完全明確 但是人們已經(jīng)認 識到細胞因子在這一過程中起到了重要作用 具體來說 不同的細胞因子通過 不同機制來下調(diào)肝臟CYPs TNF 通過氧化還原調(diào)節(jié)NF 1來降低CYP1A1 IL 2 可能通過誘導前癌癥基因 c myc 來下調(diào) CYP2C11 和 CYP3A2 表達 IL 1 通過與 NF B 結(jié)合來降低啟動子結(jié)合位點的親和性抑制 CYP2C11 轉(zhuǎn)錄 IL 6 通過誘導 C EBP LIP 表達 競爭性結(jié)合 C EBP 活化因子如 C EBPa 來抑制 CYP3A4 表達 52 另一方面 核受體也可以參與 CYP 抑制性表達 因為研究發(fā)現(xiàn) IL 6 可以抑 制 PXR 和 CAR 的表達 炎癥因子和藥物代謝之間存在負相關(guān) 這已被大家所認同 關(guān)于其分子機制 Teng 和 Piquette Miller 研究顯示用 IL 6 刺激野生型小鼠導致 PXR 蛋白和 mRNA 顯著降低 它的靶基因 Mrp2 Bsep 和 Cyp3a11 mRNA 表達下降 這一 現(xiàn)象在 PXR 的小鼠接受同樣處理時沒有出現(xiàn) 說明 Cyp 的降低由 PXR 介導 24 最近的研究發(fā)現(xiàn) 肝細胞炎癥反應激活調(diào)整了與配體結(jié)合的 PXR 泛素化結(jié)構(gòu) 53 研究顯示 泛素化的 PXR 含有 SUMO3 鏈 可以反饋抑制肝細胞的免疫反應 相反的 人應用利福平治療疾病時激活 PXR 導致 PXR 靶基因表達增加 Zhou 等人在體內(nèi)和體外試驗通過利福平激活 PXR 可以減弱 NF B 蛋白 NF B 蛋白 對于促進免疫和炎癥反應十分重要 54 這充分說明 NF B 與 PXR 之間的相互抑 制作用 NF B 的激活可以抑制 PXR 抑制 NF B 可以增強 PXR 活性 PXR 小鼠的小腸炎癥反應增強和 NF B 靶基因表達增加 所以 炎癥反應通過 NF B 通路抑制 PXR 活性從而降低藥物代謝率 55 糖皮質(zhì)激素受體 glucocorticoid receptor GR 作為一個重要的抗炎癥因子 與前炎癥因子 NF B 之間有相互干擾作用 可以相互抵消在免疫和炎癥反應中 的作用 糖皮質(zhì)激素 通過 GR 可以通過抑制炎癥因子轉(zhuǎn)錄 抑制趨化因子和 細胞因子受體來抑制免疫反應 56 另一方面 活化的 NF B 可以通過抑制 GR 來抑制很多炎癥因子和趨化因子 有人通過膿毒癥模型來研究 IL 1 與 CYP 激 活和表達關(guān)系 IL 1 可以降低 CAR 表達 降低膽紅素在肝細胞的清除率 57 通過瞬時轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn) CAR 啟動子結(jié)構(gòu)與熒光素酶報告基因結(jié)合 說明 CAR 的抑 制是在基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生的 更進一步研究發(fā)現(xiàn) IL 1 通過抑制 GR 的活性來 降低 CAR 表達 其中 NF B 起到了重要作用 NF B p65 干擾 CAR 啟動基因 遠端的糖皮質(zhì)激素效應元件的增強子功能 48 有研究顯示 IL 1 p65RelA 的 過表達可以下調(diào) GR 誘導的 CAR 表達 而這些抑制作用可以被能抑制 NF B 活 性的藥物 Pyrrolidine Dithiocarbamate 阻斷 或在 NF B 抑制子 SRIkB 過表 達時降低 58 我們的研究發(fā)現(xiàn)間歇低氧小鼠 肝細胞的 IL 1 IL 6 和 TNF 表達升高 NF B 表達也同樣增加 這說明炎癥因子誘導了 NF B 表達的升高 同時在對 核受體 mRNA 表達結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)間歇低氧組 PXR CAR 和 GR 的表達均下降 從而驗證了 IL 1 IL 6 和 TNF 和 NF B 上調(diào)可以抑制核受體因子表達 而核受體因子是影響 CYP 轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子 所以會出現(xiàn) CYP1A2 CYP2D4 CYP3A2 表達顯著下降 但是我們實驗中 發(fā)現(xiàn)間歇低氧組 CYP2C9 和 CYP2C19 表達有下降趨勢 卻沒有統(tǒng)計學意義 這可能是因為 CYPs 本身基因表達種類 繁多 其調(diào)節(jié)除了受核因子調(diào)控外 還有很多調(diào)控通路 CYP2C9 和 CYP2C19 可能炎癥因子 NF B 核受體通路存在一定關(guān)系 但不是完全靠此通路調(diào)節(jié) 具 體機制有待進一步研究 25 我們通過本實驗發(fā)現(xiàn)了間歇低氧對于大鼠肝臟的損害 炎癥因子表達增加 CYPs 表達下降 并初步探討間歇低氧引起 CYP 表達下降的機制 眾所周知 間歇低氧與自噬之間有密不可分的關(guān)系 在間歇低氧引起的肝臟損害中 自噬 是否起到了相關(guān)作用 我們在下一部分的研究中進一步探討 26 1 4 小結(jié)小結(jié) 1 模擬 OSA 的間歇低氧大鼠模型發(fā)現(xiàn)肝組織竇狀間隙增寬 匯管區(qū)可見少許炎 細胞浸潤 以淋巴細胞為主 少許肝細胞胞質(zhì)稀疏 2 肝組織炎癥介質(zhì) mRNA 定量 PCR 結(jié)果顯示炎癥因子在 IH 組表達升高 并且 發(fā)現(xiàn) 間歇低氧可以引起 Cyps 表達下降 3 NF B 核受體通路在間歇低氧引起的肝臟 Cyps 表達下降過程中有重要意義 間歇低氧引起的炎癥反應通過 NF B 核受體通路下調(diào) Cyps 表達 27 二 間歇低氧對大鼠肝臟自噬的影響二 間歇低氧對大鼠肝臟自噬的影響 自噬是真核生物細胞中存在的一個高度保守有序的細胞活動過程 包括 起始 延伸 自噬體形成和自噬體融合降解四個階段 自噬在細胞生長發(fā)育的 過程中有重要地位 尤其在饑餓或應激情況下 自噬對于細胞的保護作用尤為 重要 自噬涉及 30 多種自噬相關(guān)基因 蛋白 調(diào)控機制復雜 目前很多關(guān)于 自噬的研究 尤其在腫瘤學方面 腫瘤的低氧環(huán)境也可以引起自噬發(fā)生 我們 在前文第一部分對間歇低氧引起的肝損害進行了探討 此部分我們初步探討間 歇低氧在肝臟自噬方面的影響 2