引物設(shè)計(jì)002[1].ppt

PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用 主要內(nèi)容 背景PCR引物設(shè)計(jì)原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5 0介紹Oligo6 22介紹在線Primer3介紹 PCR 聚合酶鏈反應(yīng) PolymeraseChainReaction PCR 是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡(jiǎn)便 重復(fù)性好 易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn) 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍 使肉眼能直接觀察和判斷 可從一根毛發(fā) 一滴血 甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定 PCR引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán) 使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗 表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶 如形成引物二聚體帶 不出帶或出帶很弱 等等 現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行 可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè) 得到設(shè)計(jì)好的引物 也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件 引物設(shè)計(jì)的原則 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng) 即錯(cuò)配 如引物長(zhǎng)度 primerlength 產(chǎn)物長(zhǎng)度 productlength 序列Tm值 meltingtemperature 引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性 internalstability 用 G值反映 形成引物二聚體 primerdimer 及發(fā)夾結(jié)構(gòu) duplexformationandhairpin 的能值 在錯(cuò)配位點(diǎn) falseprimingsite 的引發(fā)效率 引物及產(chǎn)物的GC含量 composition 等等 必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾 如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 引進(jìn)突變等 具體因素 一般原則 引物的長(zhǎng)度一般為15 30bp 常用的是18 24bp 但不應(yīng)大于38 引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象 一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的 不容易引起錯(cuò)配 例如 一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn) 3x109 412 200 而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1 400個(gè) 較長(zhǎng)的引物 28 35bp 一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn) Tm值的計(jì)算一般的公式Tm 4 G C 2 A T 對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest neighbor Frieretal 1986 一般原則 2 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高 尤其是3 端相似性較高的序列 否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配 引物3 端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基 如GGG或CCC 也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加 一般原則 3 引物3 端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響 不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率 末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基 因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3 端使用堿基A 另外 引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗 5 端序列對(duì)PCR影響不太大 因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物 一般原則 4 引物序列的GC含量一般為40 60 過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng) 上下游引物的GC含量不能相差太大 不同的算法推薦45 55 或50 60 一般原則 5 G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能 該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性 應(yīng)當(dāng)選用3 端 G值較低 絕對(duì)值不超過(guò)9 而5 端和中間 G值相對(duì)較高的引物 引物的3 端的 G值過(guò)高 容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng) 能值越高越容易結(jié)合 一般原則 6 對(duì)引物的修飾一般是在5 端增加酶切位點(diǎn) 應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定 一般原則 7 引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響 盡可能少的引物二聚體 常用的引物設(shè)計(jì)軟件 Oligo6 引物評(píng)價(jià) PrimerPremier 自動(dòng)搜索 VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 在線服務(wù) PrimerPremier5 0的使用技巧簡(jiǎn)介 主要功能 1 即引物設(shè)計(jì)2 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) 根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1 纖毛蟲大核 CiliateMacronuclear 2 無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體 InvertebrateMitochondrion 3 支原體 Mycoplasma 4 植物線粒體 PlantMitochondrion 5 原生動(dòng)物線粒體 ProtozoanMitochondrion 6 一般標(biāo)準(zhǔn) Standard 7 脊椎動(dòng)物線粒體 VertebrateMitochondrion 8 酵母線粒體 YeastMitochondrion PrimerPremier5 0使用介紹 1 PreimerPremier啟動(dòng)界面 Loadsequence 基本信息 Sequencename Originalsequence UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好 Chooseafunction 引物設(shè)計(jì)界面 Firstyoucandesigntheprimermanually Sensestrandoranti sensestrand Usefulinformationoftheprimer 引物搜索選項(xiàng)設(shè)定 引物類型 搜索模式 5 引物位置范圍 3 引物位置范圍 產(chǎn)物大小范圍 引物長(zhǎng)度 搜索結(jié)果 28對(duì)引物 引物分值100分為滿分 每對(duì)引物的信息 雙擊選中一對(duì)引物 引物信息 回到主窗口 引物及產(chǎn)物信息 是否出現(xiàn)hairpin dimer falseprimingandcrossdimer 一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu) 因此最好的情況是最下面的分析欄沒(méi)有But 引物編輯 引物編輯 Editprimerhere Analysistheeditresult AccepttheeditresultReturntothemainwindow SomeotherusefulfunctionofPP5 Enzyme Meltingtemperaturegraph Per25 mer GC graph Per25 mer Stability Per5 mer Oligo6 44使用說(shuō)明 主要功能 專門的引物設(shè)計(jì)軟件 Oligo6 44啟動(dòng)界面 Opensequencefile 3個(gè)彈出窗口 Meltingtemperature GInternalStability Frq為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率 該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性 用Oligo設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn) Tm值曲線以選取5 到3 的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng) Frq曲線宜選用3 端Frq值相對(duì)較低的片段 G值在5 端和中間值比較高 而在3 端相對(duì)低 選中引物 上游引物 下游引物 只是示意圖 引物分析 首先檢查引物二聚體尤其是3 端二聚體形成的可能性 引物分析 二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu) hairpin 與二聚體相同 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好 引物分析 第三項(xiàng)檢查為GC含量 以45 55 為宜 第四Falsepriming檢查 引物分析 Keyinformationof