SDS-PAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理.doc

SDSPAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS-PAGE電泳成功的關(guān)鍵是什么？溶液中SDS單體的濃度SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。為了保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為14或13。 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度因?yàn)镾DS結(jié)合到蛋白質(zhì)上的量?jī)H僅取決于平衡時(shí)SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所以，SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，常為10-100 mM。 二硫鍵是否完全被還原只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上從而給出相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。Sample buffer中的-巰基乙醇的濃度常為4-5%，二硫蘇糖醇的濃度常為2-3%。前者有揮發(fā)性，最好使用前加入。SDS-PAGE緩沖液系統(tǒng)的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽或者其他？一般來(lái)說(shuō)，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對(duì)蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測(cè)定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對(duì)于分子質(zhì)量小于15 kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。積層膠（或稱濃縮膠）的作用原理？在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時(shí)很少解離，其有效泳動(dòng)速率很低，而氯離子卻有很高的泳動(dòng)速率，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率介于兩者之間。加上電壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開(kāi)來(lái)，并在其后面留下一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動(dòng)，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài)（我不太明白這句話），使這些帶電顆粒以相同的速度泳動(dòng)，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)甘氨酸、氯離子界面通過(guò)樣品進(jìn)入濃縮膠時(shí)，在移動(dòng)界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動(dòng)界面前的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過(guò)。移動(dòng)界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動(dòng)速率比甘氨酸快。因此，移動(dòng)的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動(dòng)界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無(wú)關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對(duì)蛋白樣品沒(méi)有分子篩作用。當(dāng)移動(dòng)的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時(shí)，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致甘氨酸大量解離。此時(shí)，甘氨酸的有效泳動(dòng)速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動(dòng)。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯度和pH環(huán)境中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離。SDS-page電泳小問(wèn)答 Q：SDSPAGE電泳的基本原理？ A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？ A：在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。 所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。 Q：樣品如何處理？ A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。 Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？ A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)； 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹； TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？ A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103。 Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？ A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。 Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？ A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 Q：什么是“鬼帶”，如何處理？ A：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。 Q：為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ A：我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 Q：為什么電泳的條帶很粗？ A：電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓； Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？ A：這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以