pUC18+和+pUC19質(zhì)粒圖譜.doc

pUC18 和 pUC19質(zhì)粒圖譜pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊(cè)號(hào)為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來(lái)，其中 lacZ （MSC）來(lái)自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質(zhì)粒圖譜。這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反。這些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的 rop 基因，因此其拷貝數(shù)達(dá) 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn) -互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過(guò) -互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。特征序列區(qū)位： pBR322_origin1471 - 852Ampicillin2486 - 1626lac_promoter543 - 514AmpR_promoter2556 - 2528M13_pUC_rev_primer500 - 478M13_reverse_primer479 - 461M13_forward20_primer379 - 395M13_pUC_fwd_primer364 - 386lacZ_a398 - 250pGEX_3_primer51 - 29Orf22486 - 1626NOS terminator sequence:ggatccatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagtaatcgat設(shè)計(jì)引物：Forward primer: 5 ggaGGATCCggatccatcgttcaaac 3 (含BamH I 位點(diǎn)GGATCC及三個(gè)保護(hù)堿基)Reverse primer: 5 atcGAATTCATCGATTACTAGTAACATAG 3 (含EcoR I 位點(diǎn)GAATTC及三個(gè)保護(hù)堿基)請(qǐng)查一下NOS終止子序列內(nèi)有沒(méi)有這兩個(gè)酶切點(diǎn)。如果沒(méi)有，引物合成后，以任何一種pCAMBIA為模板都能擴(kuò)增到該終止子序列。一、質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復(fù)制通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和 復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于 pMB1 質(zhì)?；?ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。圖 3-1 是其復(fù)制其始示意圖。 在復(fù)制時(shí)，首先合成前 RNA ，即前引物，并與 DNA 形成雜交體；而后 RNase H 切割前 RNA ，使之成為成熟的 RNA ，并形成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)，該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。形成的 RNA 可控制 RNA 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí) Rop 增強(qiáng) RNA 的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱 RNA 和 RNA 之間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1 或（ColE1）復(fù)制子的拷貝數(shù)。 圖 3-1 帶 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約 1 幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。表 5-1 就是不同類的質(zhì)粒與復(fù)制子及拷貝數(shù)的大致關(guān)系。表 3-1 ：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質(zhì)粒 p15A10212pSC101 及其衍生質(zhì)粒pSC101 5 ColE1ColE11520pUC 系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來(lái)自質(zhì)粒 pMB1 ，但其拷貝數(shù)較高。 pMB1 質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶（DNA 聚合酶 ，DNA 聚合酶 ），依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚 23 千個(gè)質(zhì)粒。3質(zhì)粒的不相容性兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。而不相容群指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30 多個(gè)不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)粒可以通過(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動(dòng)基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因 tra ，順式因子 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn) nic。二、標(biāo)記基因按其用途可將標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)，篩選標(biāo)記可用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)。（一） 選擇標(biāo)記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。氨芐青霉素抗性基因編碼一個(gè)酶，該酶可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化 -內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在 6-APA 中有一個(gè)飽和的噻唑環(huán)（A）和一個(gè) -內(nèi)酰胺環(huán)， 6-APA 為由 L- 半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。 2四環(huán)素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）四環(huán)素可與核糖體 30S 亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。目前使用的氯霉素抗性基因來(lái)源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9）。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基 23kDa）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因?qū)嶋H就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)?UAA），或琥珀突變（突變?yōu)?UAG），或乳白突變（突變?yōu)?UGA）。 supF 基因編碼細(xì)菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當(dāng)宿主含有 supF 基因時(shí)才會(huì)對(duì) Amp 和 Tet 具有抗性。相應(yīng)的， supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。由于目前所用的標(biāo)記基因使用方便，因此用這類標(biāo)記的載體較少。6其它還有一些正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來(lái)自淀粉水解芽胞桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基上 sacB 基因的表達(dá)對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。（二）篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記主要用來(lái)區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過(guò)該標(biāo)記來(lái)篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。1-互補(bǔ)（-complementation）-互補(bǔ)是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個(gè)氨基酸組成）陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。-互補(bǔ)是基于在兩個(gè)不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因，無(wú)酶學(xué)活性。對(duì)于只編碼 N-端 140 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ） ，其產(chǎn)物也沒(méi)有酶學(xué)活性。但這兩個(gè)無(wú)酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù) -半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。在 lacZ 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響 -半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)-互補(bǔ)能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補(bǔ)性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZM15 放在 F 質(zhì)粒上, 隨宿主傳代； lacZ 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記 （圖 3-2） 。相應(yīng)的受體菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D （lac - proAB）F proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的編碼基因，lacIq 突變使阻抑物產(chǎn)量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達(dá)。lacZ 基因是乳糖 lac 操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(dá)。 乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被 -半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。 2插入失活通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有 pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導(dǎo)致 tetr 基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴(kuò)增或保存 DNA 片段，是最簡(jiǎn)單的載體。1pBR322pBR322 質(zhì)粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊(cè)號(hào)為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個(gè)單一位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來(lái)自 pMB1 （如圖 3-3）。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來(lái)的。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的 BamH 位點(diǎn)來(lái)插入外源 DNA 片段，可通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選。2pUC18 和 pUC19pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊(cè)號(hào)為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來(lái)，其中 lacZ （MSC） 來(lái)自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質(zhì)粒圖譜。這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向相反。這些質(zhì)粒缺乏控制拷貝數(shù)的 rop 基因，因此其拷貝數(shù)達(dá) 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細(xì)胞中可表現(xiàn) -互補(bǔ)作用。因此在多克隆位點(diǎn)中插入了外源片段后，可通過(guò) -互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。圖 3-4 ： pUC18/19 質(zhì)粒圖譜3pUC118 和 pUC 119由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來(lái)，大小為 3162bp ， GenBank 注冊(cè)號(hào)為 U07649（pUC118）和 U07650（pUC119）。相當(dāng)于在 pUC18/19 中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列。4pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z/