流式細(xì)胞技術(shù)課件

第15章流式細(xì)胞技術(shù)的原理和應(yīng)用 陳鯉翔副教授Email lxchen 流式細(xì)胞技術(shù) Flowcytometry FCM 是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒 如細(xì)菌 的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù) 流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀 是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì) 如大小 內(nèi)部結(jié)構(gòu) DNA RNA 蛋白質(zhì) 抗原等 進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù) 30年代 設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化50 60年代 分層鞘流原理 分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分及結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞分類 提出細(xì)胞分選70年代 單克隆抗體技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)1973年 第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACSI發(fā)展方向 熒光染料的開(kāi)發(fā) 細(xì)胞的制備方法 提高電子信號(hào)的處理能力等 流式細(xì)胞儀的發(fā)展史 BD公司流式細(xì)胞儀 FACSCalibur LSRII FACSCanto FACSCount FACSVantage FACSAria MoFloAstriosEQ超高速流式分選系統(tǒng) Gallios流式細(xì)胞儀 Beckman公司流式細(xì)胞儀 Navios流式細(xì)胞分析系統(tǒng) 應(yīng)用 細(xì)胞生物學(xué) 腫瘤學(xué) 血液學(xué) 免疫學(xué) 藥理學(xué) 遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等 流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性 液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 一 流式細(xì)胞技術(shù)原理 1 流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu) 由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的懸液熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色受清潔氣體壓力從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液 輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液 主要作用是包裹樣本流的周圍 保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置 防止其靠近孔壁而阻塞噴孔 1 液流系統(tǒng) FluorescenceSignal FocusedLaserBeam ShealthFluid 液流系統(tǒng)示意圖 InjectorTip 樣本管 鞘液管 激光光源 氣冷式氬離子激光器分色反光鏡 反射長(zhǎng) 短波長(zhǎng) 通過(guò)短 長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器 兩十字交叉放置的透鏡透鏡組 形成平行光 除去室內(nèi)光濾片 長(zhǎng)通 短通 帶通光電倍增管 FS SS 散射光 FL1 FL2 FL3 FL4 熒光 2 光學(xué)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)示意圖 散射光的測(cè)定細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360 立體角方向散射的光線信號(hào) 它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小 形狀 胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān) 主要分為前向散射光和側(cè)向散射光 光信號(hào)的測(cè)定 前向散射光 forwardscatter FS 激光束照射細(xì)胞時(shí) 光以相對(duì)軸較小角度 0 5 10 向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性 信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比 側(cè)向散射光 sidescatter SS 激光束照射細(xì)胞時(shí) 光以90 角散射的訊號(hào) 用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性 測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理 可得到FS SS圖 由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選 此為血細(xì)胞分類的基本原理 但不能分析表面分子 淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 光散射測(cè)量最有效用途 從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生 發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同 每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色 通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片 可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi) 送入不同的光電倍增管 選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征 線性放大器和對(duì)數(shù)放大器 熒光測(cè)定 熒光補(bǔ)償 FITC APC PE PerCP Cy5 5 每一種熒光分子都發(fā)射某一特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光 然而這些熒光的發(fā)射光譜會(huì)發(fā)生重疊 有時(shí)這種重疊現(xiàn)象非常顯著 熒光補(bǔ)償是指修正熒光滲漏的過(guò)程 如從探測(cè)器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號(hào) 熒光補(bǔ)償 壓電晶體 產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng) 不充電 充電 細(xì)胞分選 分選速度 單位時(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量 與懸液中細(xì)胞的含量成正比 分選純度 分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率 分選收獲率 實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率 與純度成反比 分選得率 從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量 再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率 與分選速度成反比 分選的技術(shù)要求 3 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) FS 反映顆粒的大小SS 反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL 反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少 參數(shù) 單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖 二維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析 數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù) 散射光或熒光 與顆粒計(jì)數(shù) COUNT 構(gòu)成 反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少 單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)點(diǎn)圖 雙參數(shù)直方圖 縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù) 根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置 雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào) 最常用的是點(diǎn)密圖 在圖中 每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞 點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少 用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù) 在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同 不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同 二維等高圖 三參數(shù)直方圖 三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù) 散射光或熒光 而非細(xì)胞數(shù) 多參數(shù)分析 當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光 被激發(fā)光激發(fā)后 得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門(mén) Gate 技術(shù) 來(lái)分析參數(shù)之間的相互關(guān)系 多參數(shù)分析 Gate設(shè)置 指在某一張選定參數(shù)的直方圖上 根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群 并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況 根據(jù)門(mén)的形狀又分為了線性門(mén) 矩形門(mén) 圓形門(mén) 多邊形門(mén) 任意形狀門(mén)和十字門(mén) 門(mén) Gate 設(shè)置 A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞 A B C均為任意門(mén) 區(qū)閾 region R 與門(mén) gate G 是兩個(gè)相關(guān)的概念 區(qū)閾可與門(mén)對(duì)應(yīng) 但是也可以包含于門(mén) Region設(shè)置 D1CD4 CD3 D2CD4 CD3 D3CD4 CD3 D4CD4 CD3 如十字門(mén)分析時(shí) 就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成 即G D1 D2 D3 D4 樣本制備 單細(xì)胞懸液標(biāo)記染色 光譜不重疊陰性對(duì)照的設(shè)置 檢測(cè)標(biāo)本的重復(fù)性質(zhì)量控制 二 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞 Ficoll 40kd 高密度 低滲透壓 無(wú)毒性 比重為1 0177 0 001的分層液 樣本制備 利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后 得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點(diǎn)圖 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái) 然后離心漂洗 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 可不用酶消化 直接吹打制備成單細(xì)胞懸液 新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法 剪碎法 網(wǎng)搓法 研磨法 酶處理法 胃蛋白酶 胰蛋白酶 膠原酶等 化學(xué)試劑處理法 EDTA EGTA等 表面活性劑處理法 Triton x100 皂素等 防止細(xì)胞自溶 保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法 1 深低溫保存法 深低溫冰箱 保存一年 2 乙醇與甲醇保存法 70 冷乙醇 75 的甲醇 3 甲醛或多聚甲醛固定法 細(xì)胞不具有生物活性 但細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響 單細(xì)胞懸液的保存 適用條件 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性 常用的熒光染料與標(biāo)記染色 激光 細(xì)胞懸液 異硫氰酸熒光素 得州紅 能量傳遞復(fù)合染料 藻膽蛋白類 幾種常見(jiàn)的熒光染料 常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起 在488nm激發(fā)光照射下 通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào) 從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào) 能量傳遞復(fù)合染料 Laser 488nm 488nm 575nm 670nm紅色熒光 花青苷5 藻紅蛋白 能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制 熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo) 干擾少 但需購(gòu)買(mǎi)多種單抗間標(biāo) 步驟多 干擾多 不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記 免疫熒光標(biāo)記 FITC PE488525 575綠色 橙色FITC Tred488525綠色568615紅色FITC PeCy5488525 675綠色 紅色FITC ECD488525 625綠色 橙紅色F P PeCy5488525 575 675綠 橙 紅色F ECD PeCy5488525 575 675綠 橙紅色 紅色F P APC488525 575綠色 橙色633670紅色 熒光染料激發(fā)波長(zhǎng) nm 發(fā)射波長(zhǎng) nm 顏色 雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞教幚砑t細(xì)胞實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法溫度25 37 PH7 0 7 2 質(zhì)量控制 單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控 免疫熒光染色的質(zhì)控 溫度PH染料濃度固定劑 光路與流路校正 確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài) 減少變異 CV PMT 光電倍增管 校準(zhǔn) 保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài) 絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn) 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性 Flow check Flow set Flow count 儀器操作的質(zhì)控 同型對(duì)照 即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照 選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓 以保證特異性 全程質(zhì)量控制 在流式檢測(cè)中 樣品標(biāo)記 溶血 洗滌 儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果 采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)行全程質(zhì)控 使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì) 數(shù)據(jù)可以互用 免疫檢測(cè)的質(zhì)控 三 流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用 以細(xì)胞免疫功能測(cè)定為例 淋巴細(xì)胞亞群活化的T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞 淋巴細(xì)胞亞群 淋巴細(xì)胞亞群 Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測(cè)定 根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)功能 人的 4 細(xì)胞可以分為 1 2 1細(xì)胞產(chǎn)生 2 12 等細(xì)胞因子 主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng) 遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng) 并在清除病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用 2細(xì)胞分泌 4 5 6 10 13等細(xì)胞因子 主要促進(jìn)體液免疫反應(yīng) 中和胞外病原體相應(yīng)地 CD8 T細(xì)