磁微球在生物學中的應用.doc

磁性微球在生物學中的應用一、磁性微球在核酸純化上的應用核酸是現(xiàn)代生物學、醫(yī)學研究中的重要課題。核酸作為遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，除了在生物體正常的生長、發(fā)育、和繁殖等生命活動中具有十分重要的作用外，它與生命的異常情況，如腫瘤發(fā)生、放射損傷、遺傳疾病等也有密切關(guān)系。因此核酸是現(xiàn)代生物學、醫(yī)學研究中的重要課題。無論是進行核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，還是進行基因工程、蛋白質(zhì)工程，首先需要對核酸進行分離純化。超順磁性磁性微球是細胞分離、鑒定，基因分析，細菌和病毒的病原體診斷，核酸分離分析，蛋白質(zhì)純化的一個有效手段。通過寡聚核苷酸Oligo（dT）序列或鏈霉親和素等將DNA和RNA連接磁性微球表面已開發(fā)了許多應用。1、DNA/RNA結(jié)合蛋白分離在基因表達中，蛋白質(zhì)也是一個重要角色，然而與DNA/RNA特異性結(jié)合得蛋白質(zhì)通常壽命都很短，且含量少，鏈霉親和素修飾的磁珠可用來提取分離DNP/RNP。結(jié)合有生物素的DNA或RNA序列與鏈霉親和素修飾的磁珠相互作用，蛋白質(zhì)識別了這些序列，就可在幾分鐘內(nèi)結(jié)合到固定化DNA/RNA上，這種方法已被用來分離轉(zhuǎn)錄因子，限制性內(nèi)切酶，復制蛋白等。2、mRNA分離在研究基因表達中，結(jié)合免疫磁性細胞分離和基于磁珠分離后進行逆轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）及聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction， RT-PCR）擴增，是一種強有力的手段。典型哺乳動物一個細胞中只有大約10pg的RNA，而mRNA則僅占總RNA的15%。傳統(tǒng)的mRNA分離技術(shù)含有總RNA純化，即基于Oligo（dT）-纖維素親和色譜柱的PolyA+RNA選擇，此過程費時并費力。因此，Oligo（dT）25磁性微球被用于從復雜溶菌液中提取mRNA。Poly（A）-tail是mRNA序列上普遍存在的一段堿基，因此磁珠表面只需要有Oligo（dT）25序列，就可以有效地與mRNA上的Poly（A）-tail雜交，這種雜交非常迅速，在12分鐘內(nèi)就可完成，能有效地除去rRNA， tRNA以及其他RNA，且有70100的回收率。除去溶菌液的洗滌，整個提取只需耗時十五分鐘，且只用一個管，也不必前面的純化步驟。利用Oligo（dT）25磁性微球可在一小時內(nèi)從單核細胞和T淋巴細胞，B淋巴細胞等中提取出mRNA，磁珠也可以經(jīng)過改性后對血液、骨髓中的癌細胞進行檢測或進行單核細胞（mononuclear cell）制備。此外，磁珠還可從動、植物組織中分離Mrna，比如，曾有人從血清、血漿、骨髓液中分理出聚腺苷酸（polyadenylated viral）RNA病毒：HIV-1RNA，從肝、脾、植入石蠟組織，以及果蠅中都提出了mRNA。利用這些磁珠從動、植物細胞、組織等復雜樣品中提取的mRNA，可用于構(gòu)建cDNA文庫。Oligo（dT）25磁珠消除了總RNA純化，柱色譜處理，過濾，有機溶劑提取，醇沉淀等過程，酶的下游應用也不會因為磁珠的存在而受到抑制。Oligo（dT）25磁性微球最重要的特性還在于可定量提取mRNA，使得定量RT-PCR和環(huán)境監(jiān)測成為可行。實現(xiàn)mRNA提取高通量也已成為可能，F(xiàn)ang和Otto等已報道了96孔板和384孔板磁分離，可同時進行96或384個樣品的提取。二、磁性微球在細胞標記和細胞分離上的應用細胞分離是生物細胞學研究中一種十分重要的技術(shù)，高效的細胞分離在細胞分離是生物細胞學研究中一種十分重要的技術(shù)，高效的細胞分離在臨床中是首要的、重要的步驟。這種細胞分離技術(shù)在醫(yī)療臨床診斷上有廣范的應用，例如治療癌癥需在輻射治療前將骨髓抽出，且要將癌細胞從骨髓液中分離出來。傳統(tǒng)的細胞分離技術(shù)主要采用離心法，利用密度梯度原理進行分離，時間長、效果差。隨著合成磁性微球的發(fā)展，免疫磁性微球在分離細胞方面已經(jīng)獲得了快速的發(fā)展，經(jīng)動物臨床試驗已獲成功。其中最重要的是選擇一種生物活性劑或者其他配體活性物質(zhì)（如抗體、熒光物質(zhì)、外源凝結(jié)素等），根據(jù)細胞表面糖鏈的差異，使其僅對特定細胞有親和力，從而達到分離、分類以及對其種類、數(shù)量分布進行研究的目的。磁性微球用于細胞分離需要考慮以下幾個因素；不與非特定細胞結(jié)合、具有靈敏的磁響應性、在細胞分離介質(zhì)中不凝結(jié)。Jhunu等人用外源凝結(jié)素分別修飾聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球，通過實驗發(fā)現(xiàn)兩者都有分離紅細胞的能力，白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的效率高得多，但是成本高。Wedemeyer N等人則將高分子磁性微球結(jié)合不同的DNA而可以達到經(jīng)濟快速分離各種不同的細胞的目的。利用磁流體或超順磁性物質(zhì)標記細胞已是體內(nèi)細胞分離中日趨普遍的方法。多流體或超順磁性物質(zhì)標記細胞已是體內(nèi)細胞分離中日趨普遍的方法。多數(shù)當前用的標記技術(shù)主要包括以下兩種方法：將磁性微球連接到細胞表面；通過液相內(nèi)吞、受體調(diào)解內(nèi)吞或噬菌作用使生物相容性磁性微球內(nèi)在化。有效而特異性的磁性微球細胞標記策略就是用能經(jīng)過受體中介吞噬而被靶細胞吸收的配基，如單克隆抗體，對磁性納米微球進行改性。靶向配基如：轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、胰島素、生長因子等已被用于修飾細胞表面，且這些配基穩(wěn)定性好，并無免疫原性。而目前發(fā)展迅速的細胞磁分離技術(shù)，設(shè)備簡單，費用低廉，儀器操作簡便，不影響細胞活性，且可實現(xiàn)連續(xù)分離，可克服熒光激活細胞分離法（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和免疫親和柱分離法中，儀器昂貴，設(shè)備復雜，處理量小，且收集的細胞活性低的缺點。免疫磁性細胞分離法（Immunomagnetic cell separation methods）在細胞生物學中越來越成為專家學者關(guān)注的焦點。免疫磁性細胞分離依靠兩種機制實現(xiàn)靶細胞分離。直接方法就是通過將親和配基（即抗體）連接到磁性微球上，形成表面結(jié)合單克隆抗體的免疫磁性微球（immunomagnetic microspheres， IMMS），此抗體能特異性地與靶細胞結(jié)合并使之具有磁響應性，當此結(jié)合物受到外磁場作用時，可以使靶細胞與其它雜質(zhì)分離。間接法就是先將自由親和配基（抗體）加到細胞懸液中，孵化后沒有結(jié)合配基的細胞被洗掉，而抗體靶細胞復合物則通過標記有另一配基（即二抗）的免疫磁性微球捕獲。三、磁性微球作為藥物載體的應用 磁性高分子微球作為藥物載體，被注射到動物體內(nèi)，在外加磁場下，通過納米粒子的導航，移向病變區(qū)，這就是磁性納米粒子在藥物中應用的基本原理。用磁性高分子微球作為藥物載體可以提高藥效，降低藥物對正常細胞的傷害，成為磁控導彈，這也是當今的熱門課題之一。Widder、Senyei、Monrimoto等人廣泛研究磁性微球，但是制得的粒徑多為13m，靶向定位效果不好。日本的Sako等制成海綿鐵顆粒（30m），治療肝癌、腎癌等后來人們發(fā)現(xiàn)將化療藥物和磁性材料一起包封于載體材料中，進人體內(nèi)后在外磁場作用下使微球聚集于病變部位，可提高靶區(qū)內(nèi)的藥物濃度，從而提高療效，減少用藥劑量，降低全身毒副作用Morimoto Y等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，在沒有磁場的作用下，藥物主要集中在肝臟，而在磁場作用下，靜脈注射磁性微球達到外界放有磁場的肺部，動脈注射磁性微球到達部Guph P K等實驗發(fā)現(xiàn)磁性微球載有13的劑量的藥物，在靶區(qū)的濃度是自由藥物的8倍，而且在非靶向區(qū)域（肝、心臟）的藥物濃度明顯降低Iannotti J P等人報導在外界磁場的作用下，5080的微球定向到病變區(qū)，而無外界磁場時只有20的微球可到達病變區(qū)磁性高分子微球一般通過下面3種方式結(jié)合：1、藥物與高分子先結(jié)合成微球，磁粉再吸附其表面；2、磁粉和高分子先結(jié)合成微球再吸附藥物；3、磁粉、藥物、高分子一起混合經(jīng)均勻化后再微球化。Devineni等人合成magnetic microsphers methotrexate （MM-MTX） 藥物載體用以治療腫瘤，MTA通過2二甲胺甲基1乙基鏈接在磁性粒子的表面，通過水解可以釋放藥物但是實驗發(fā)現(xiàn)在45min內(nèi)藥物又重新分配，導致小鼠的死亡此類問題有待進一步研究解決。四、磁性微球在蛋白質(zhì)和多肽的分離與純化上的應用傳統(tǒng)方法難以對蛋白質(zhì)進行分離且保持其活性，但采用連在磁珠上的單克隆抗體進行免疫沉淀富集，SDS-PAGE電泳法檢測則可達想要結(jié)果。用磁珠分離細胞溶菌液中的蛋白質(zhì)，幾乎不需要預先處理，與其他方法相比，非特異性結(jié)合也較少。要從全血，培養(yǎng)上清液，血清，腹水中分離蛋白質(zhì)，用于制備、分析，運用磁珠作為固相載體進行免疫測定的優(yōu)點在于快速的結(jié)合動力學和簡單的分離，洗滌過程。在蛋白質(zhì)純化中，為了得到高結(jié)合容量需使用大孔如粒徑為3.5um，并用鏈霉親和素修飾