兩點法、終點法、速率法.doc

什么叫兩點法、終點法、速率法? 兩點法：測定酶反應開始后某一時間內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應初速度的方法。終點法：通過測定酶反應開始到反應達到平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量，以求出酶活力的方法，亦稱平衡法。速率法：是指連續(xù)測定(每15秒1分鐘監(jiān)測一次)酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應的初速度的方法，即連續(xù)監(jiān)測法。一、常用生化檢測項目分析方法舉例1終點法檢測常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。2固定時間法苦味酸法測定肌酐采用此法。（兩點法）3連續(xù)監(jiān)測法對于酶活性測定一般應選用連續(xù)監(jiān)測法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測法。4透射比濁法透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應的項目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗O、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。 二、分析參數(shù)設置分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測、數(shù)據(jù)處理等，其程序均已經(jīng)固化在存儲器里，用戶不能修改。各種測定項目的分析參數(shù)（analysisparamete）大部分也已設計好，存于磁盤中，供用戶使用；目前大多數(shù)生化分析儀為開放式，用戶可以更改這些參數(shù)。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空白通道，由用戶自己設定分析參數(shù)。因此必須理解各參數(shù)的確切意義。一、分析參數(shù)介紹（一）必選分析參數(shù)這類參數(shù)是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數(shù)無法進行檢測。1試驗名稱 試驗名稱（test code）是指測定項目的標示符，常以項目的英文縮寫來表示。2方法類型（也稱反應模式） 方法類型（assay）有終點法、兩點法、連續(xù)監(jiān)測法等，根據(jù)被檢物質(zhì)的檢測方法原理選擇其中一種反應類型。3反應溫度 一般有30、37可供選擇，通常固定為37。4主波長 主波長（primary wavelength）是指定一個與被測物質(zhì)反應產(chǎn)物的光吸收有關(guān)的波長。5次波長 次波長（secondary wavelength）是在使用雙波長時，要指定一個與主波長、干擾物質(zhì)光吸收有關(guān)的波長。6反應方向 反應方向（response direction）有正向反應和負向反應兩種，吸光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。7樣品量 樣品量（sampling volum）一般是2l35l，以0.1l步進，個別分析儀最少能達到1.6l?？稍O置常量、減量和增量。8 第一試劑量 第一試劑量（first regengt volum）一般是20300l，以1l步進。9 第二試劑量 第二試劑量（second regengt volum）一般也是20300l，以1l步進。10總反應容量 總反應容量（total reacting volum）在不同的分析儀有一個不同的規(guī)定范圍，一般是180350l，個別儀器能減少至120l?？偡磻萘刻贌o法進行吸光度測定。11孵育時間 孵育時間（incubate time）在終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。12延遲時間 延遲時間（delay time）在連續(xù)監(jiān)測法中樣品與反應試劑（第二試劑）混勻開始至連續(xù)監(jiān)測期第一個吸光度選擇點之間的時間。13連續(xù)監(jiān)測時間 連續(xù)監(jiān)測時間（continuous monitoring time）在延遲時間之后即開始，一般為60120s，不少于4個吸光度檢測點（3個吸光度變化值）。14校準液個數(shù)及濃度 校準曲線線性好并通過坐標零點的，可采用一個校準液（calibrator）；線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液；對于校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一個校準液都要有一個合適的濃度。15校準K值或理論K值 通過校準得到的K值為校準K值（calibrate coefficient）或由計算得出的K值為理論K值。16線性范圍 即方法的線性范圍（linearity range），超過此范圍應增加樣品量或減少樣品量重測。與試劑/樣品比值有關(guān)。17小數(shù)點位數(shù) 檢測結(jié)果的小數(shù)點位數(shù)（decimal point digit）。（二）備選分析參數(shù)這類分析參數(shù)與檢測結(jié)果的準確性有關(guān)，一般來說不設置這類分析參數(shù)，分析儀也能檢測出結(jié)果，但若樣品中待測物濃度太高等，檢測結(jié)果可能不準確。1樣品預稀釋 設置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個數(shù)值，便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋。2底物耗盡值 底物耗盡值（substrate exhaust limit）在負反應的酶活性測定中，可設置此參數(shù)，以規(guī)定一個吸光度下降限。若低于此限時底物已太少，不足以維持零級反應而導致檢測結(jié)果不準確。 3前區(qū)檢查 免疫比濁法中應用，以判斷是否有抗原過剩。將終點法最后兩個吸光度值的差別（A）設置一個限值，如果后一點的吸光度比前一點低，表示已有抗原過剩，應稀釋樣品后重測。4試劑空白吸光度范圍 超過此設定范圍表示試劑已變質(zhì)，應更換合格試劑。5試劑空白速率 連續(xù)監(jiān)測法中使用，是試劑本身在監(jiān)測過程中沒有化學反應時的變化速率。6方法學補償系數(shù) 用于校準不同分析方法間測定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個參數(shù)。7參考值范圍 對超過此范圍的測定結(jié)果，儀器會打印出提示。（三）某些參數(shù)的特殊意義 1最小樣品量 最小樣品量是指分析儀進樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量是2l，目前也有小至1.6l的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使分析儀檢測范圍（與線性范圍不同）的上限得以擴大。2最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測項目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法測定，以往手工法操作時樣品量10l，試劑量4ml，這樣試劑量/樣品量比例（R/S）為200，線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上后，R/S卻很難達到200，致使線性上限變低。因此對這類檢測項目最大試劑量非常重要。 3彈性速率 在酶活性測定中，當酶活性太高，在連續(xù)監(jiān)測期中已不呈線性反應時，有些儀器具有彈性速率（flexrate）功能，能自動選擇反應曲線上連續(xù)監(jiān)測期中仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計算結(jié)果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大。如AST可從1000U/L擴展至4000U/L，從而減少稀釋及重測次數(shù)、降低成本。4試劑空白速率 當樣品中存在膽紅素時，膽紅素對堿性苦味酸速率法或兩點法測定肌酐有負干擾。因為膽紅素在肌酐檢測的波長505nm有較高光吸收，而且膽紅素在堿性環(huán)境中可被氧化轉(zhuǎn)變，因而在肌酐反應過程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢。若在加入第一試劑后一段時間內(nèi)設置試劑空白速率，因為此段中苦味酸尚未與肌酐反應，而膽紅素在第一試劑的堿性環(huán)境中已同樣被氧化轉(zhuǎn)變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負干擾，見圖7-8。二、單波長和雙波長方式（一）概念采用一個波長檢測物質(zhì)的光吸收強度的方式稱為單波長(mono-wavelength)方式。當反應液中含有一種組分，或在混合反應液中待測組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長無重疊時，可以選用。在吸光度檢測中，使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。當反應液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測定結(jié)果的準確性時，采用雙波長方式更好。（二）雙波長的作用雙波長(di-wavelength)測定優(yōu)點是消除噪音干擾;減少雜散光影響;減少樣品本身光吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統(tǒng)中，均存在著隨時間發(fā)生變化的不穩(wěn)定的檢測信號，即噪音，而雙波長檢測是同時進行的，兩種波長檢測產(chǎn)生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干擾。當樣品中存在非化學反應的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產(chǎn)生非特異性的光吸收，而干擾測定結(jié)果的準確性。采用雙波長方式測定可以部分消除這類干擾，提高檢測的準確性。 （三）次波長的確定方法當被測物的主波長確定之后，再選擇次波長。如根據(jù)甘油三酯等干擾物吸收光譜特征，選擇次波長，使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應有較大的差異。一般來說，次波長應大于主波長100nm。以主波長與次波長吸光度差來計算結(jié)果。（四）雙波長的具體應用對于某些反應速度快且無法設置為兩點終點法的分析項目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長的方式來部分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測定的項目應用雙波長的為血清總蛋白（雙縮脲法）主波長500nm，次波長576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波長分別為600和700nm；鈣（偶氮砷法）主、次波長分別為 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波長為340、405nm，鎂（二甲苯胺藍法）主、次波長為505和 600nm。三、單試劑和雙試劑方式反應過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優(yōu)點是：可提高試劑的穩(wěn)定性，多數(shù)雙試劑混合成單一工作試劑時，其穩(wěn)定時間縮短；能設置兩點終點法，來消除來自樣品本身的光吸收干擾；在某些項目檢測時能消除非特異性化學反應的干擾。如血清ALT測定，血清中的內(nèi)源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶（乳酸脫氫酶）起反應，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏-酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應之后再加入含有-酮戊二酸的第二試劑，啟動真正的ALT酶促反應生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應消耗的NAD能真正反映ALT的活性，從而消除以上副反應的影響。四、測定過程的自動監(jiān)測各種自動生化分析儀或多或少都具有對測定過程進行各種監(jiān)測的功能，以便在沒有人監(jiān)督化學反應的情況下提高檢測的準確性。高檔分析儀的監(jiān)測功能更強。1試劑空白監(jiān)測 每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)：如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因酚被氧化為醌而變?yōu)榧t色；堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質(zhì)分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃；有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負反應檢測項目，其試劑在放置過程中空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降等。試劑空白的測定方法有兩種：每瓶試劑在使用前通過對試劑空白校準來確定試劑空白吸光度，這種方式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每個樣品測定前均檢測試劑空白吸光度，適用于先加試劑后取樣品的分析儀。2試劑空白變化速率監(jiān)測 一些酶試劑在反應溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時間逐漸發(fā)生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關(guān)，且因試劑的組成和生產(chǎn)廠家的不同而不同。這種變化會影響測定結(jié)果的準確性，一般使結(jié)果偏高。如果設置此項監(jiān)測，分析儀在結(jié)果計算時會自動減去試劑空白變化速率。在以監(jiān)測NAD（P）H減少為指示反應的酶活性測定中，空白速率可監(jiān)測并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原為底物的酶活性測定中，空白速率可監(jiān)測并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關(guān)空白速率監(jiān)測在膽紅素對堿性苦味酸速率法測定肌酐負干擾消除中的作用，已如前述。3樣品信息監(jiān)測 由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會對測定結(jié)果產(chǎn)生非化學反應的干擾。根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質(zhì)和程度，一般是測定樣品在600nm570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小來分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結(jié)果計算時自動減去這部分干擾，這將有利于提高分析結(jié)果的可靠性。4結(jié)果可靠性監(jiān)測（1）終點監(jiān)測：終點法測定要判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。一些分析儀在所選終點后再選一個測光點，比較這兩點吸光度的差異來判斷反應是否到達終點。 （2）線性期監(jiān)測：連續(xù)監(jiān)測法選擇時間吸光度反應曲線上的線性期來計算酶活性或被測物濃度，因此儀器要確定此連續(xù)監(jiān)測期是否呈線性。其監(jiān)測方法為將連續(xù)監(jiān)測到的各吸光度值進行線性回歸，計算出各點的方差，根據(jù)方差值的大小來判斷是否呈線性；取連續(xù)監(jiān)測期開始若干點的變化速率與連續(xù)監(jiān)測期最后若干點的變化速率進行比較，來判斷是否為線性期。5底物消耗的監(jiān)測 在連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性時，如果在監(jiān)測期內(nèi)吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監(jiān)測期的吸光度將偏離線性，使測定結(jié)果不可靠。此時不打印結(jié)果或打印結(jié)果同時也打印出底物耗盡提示，該樣品應稀釋一定的倍數(shù)重新測定。此監(jiān)測對于采用負反應分析酶活性的方法甚為重要。見圖7-96方法線性范圍監(jiān)測 每種待測物分析都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結(jié)果若超過此范圍，分析儀將顯示測定結(jié)果超過線性范圍的提示，多數(shù)分析儀會自動將樣品減量或增量重新測定。一、分析方法分類 （一）終點法被測物質(zhì)在反應過程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，即達到反應終點，根據(jù)終點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法（end essay）。實際上被測物并沒有完全被轉(zhuǎn)變，而只是與產(chǎn)物達到一個動態(tài)的化學平衡，因此該法稱為平衡法更為恰當。從時間-吸光度曲線來看，到達反應終點或平衡點時，吸光度將不再變化。分析儀通常在反應終點附近連續(xù)選擇兩個吸光度值，求出其平均值計算結(jié)果，并可根據(jù)兩點的吸光度差來判斷反應是否到達反應終點。終點法參數(shù)設置簡單，反應時間一般較長，精密度較好。終點時間的確定：根據(jù)時間-吸光度曲線來確定，如Trinder反應測定尿酸，反應曲線上35min時其吸光度已趨向穩(wěn)定，因而可將5min作為反應終點。根據(jù)被測物反應終點，結(jié)合干擾物的反應情況來確定，如在血清白蛋白的溴甲酚綠法測定中，白蛋白與溴甲酚綠在10s內(nèi)很快完成反應，之后球蛋白和球蛋白與溴甲酚綠發(fā)生 慢反應，使反應曲線上吸光度在10s后仍繼續(xù)緩慢上升，持續(xù)約達10min，因此終點時間應采用1030s，而不應選擇10min。1一點終點法 ：在反應到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，這種方法稱為一點終點法（one point end essay），其反應曲線見圖7-3。其檢測結(jié)果的計算公式是：待測物濃度CU=（待測吸光度AU試劑空白吸光度AB）K。 K為校準系數(shù)，詳見第五節(jié)二操作方法。2兩點終點法 ：在被測物反應或指示反應尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，此兩點吸光度之差用于計算結(jié)果，稱為兩點終點法（two point end essay），其反應曲線見圖7-4。計算公式為CU=（待測吸光度A2待測吸光度A1）K。該法能有效地消除溶血（hemolysis）、黃疸（icterus）和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收（見圖7-5）造成的干擾。在單試劑分析加入試劑的初期、或雙試劑分析中第二試劑加入之初，若指示反應吸光度尚未明顯變化，則可在此時選擇第一個吸光度，在指示反應終點時選擇第二個吸光度，從而設置成兩點終點法。但指示反應初期吸光度無明顯變化的化學反應較少，如單試劑方式測定總蛋白、白蛋白、鈣、磷、鎂等的終點法分析項目，及雙試劑方式測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等的終點法分析項目，因反應初期吸光度已有明顯變化，因而均難以用上述方式設置兩點終點法。但在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時指示反應一般尚未開始，則能容易設置兩點終點法。在此要注意必須將兩次讀吸光度時不同比色液體積進行校正。目前全自動分析儀均具有此自動校正功能，不必手工進行校正。（二）固定時間法指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應初始吸光度亦非終點吸光度，這兩點的吸光度差值用于結(jié)果計算，稱為固定時間法（fixed-time essay），反應曲線見圖7-6。其計算公式與兩點終點法相同，為CU=(A2-A1)K。有時也稱此法為兩點法。該分析方法有助于解決某些反應的非特異性問題。例如：苦味酸法測定肌酐，反應的最初30s內(nèi)，血清中快反應干擾物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能與堿性苦味酸反應；在第二個30s時堿性苦味酸主要與肌酐反應，且此段時間吸光度曲線的線性較好（故也可用連續(xù)監(jiān)測法測定肌酐）；在80120s及其以后，堿性苦味可與蛋白質(zhì)以及其它慢反應干擾物反應。這樣選用反應的第二個30s為測定時間，既避免了快反應物質(zhì)的干擾，也避免了慢反應物質(zhì)的影響，使肌酐濃度與吸光度變化呈良好的線性關(guān)系，有利于提高分析的特異性和準確度。（三）連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法（continuous monitoring essay）又稱速率法（rate essay），是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時，連續(xù)選取時間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（A/min）計算結(jié)果，見圖7-7A和B。所謂線性期就是各點吸光度差值相等，如圖7-7C所示，圖中1及5值偏小，而234，故A1點至A4點屬線性段。此線性期對底物來說屬零級反應，期間的A/min即為酶促反應的初速度，其大小與被測酶活性成正比。連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點即是可以確定線性期并計算A/min，根據(jù)此值再準確地計算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。酶活性（U/L）A/min理論（或校準）K值，代謝物濃度CU=A/min校準K值。關(guān)于理論K值和校準K值敘述如下：1理論K值：多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準品可用，因而根據(jù)酶活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性 (U/L)=A/min ，將此式中 以K來表示，此K值可通過對已知值即指示物質(zhì)的毫摩爾消光系數(shù)（）、反應液總?cè)萘浚═V）、樣品容量（SV）和比色杯光徑（d）計算后得出，即為理論K值，可作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。采用理論K值的前提應當是樣品和試劑的加量準確、比色杯光徑準確、溫度控制精確以及波長準確等。但事實上由于各型分析儀在注射器容積步進電機精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差。溫度的影響有時也非常大，由于反應盤是半暴露的，因此隨著較冷試劑的加入，反應盤中的溫度會逐漸降低，盡管開始測定時反應盤溫度已升到37C，但在某一項目測定過程的開始階段，溫度可能達不到37C ，甚至僅35C左右，且反應過程中仍有可能上下波動，這對于酶學反應來說影響是很大的。如采用37C時的理論K值，將會使測定結(jié)果降低，溫度的波動還會使得結(jié)果的重復性降低。當然，若試劑在加入反應杯前經(jīng)試劑臂內(nèi)加熱裝置預溫，則基本不影響反應盤溫度。由于摩爾吸光系數(shù)受比色杯光徑、波長、帶寬以及加樣系統(tǒng)的準確性等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實際的摩爾吸光系數(shù)，然后用來計算的K值稱為實測K值。（1）NADH（NADPH）摩爾吸光系數(shù)的測定：NADH（NADPH）沒有標準純制品，而且配成溶液后穩(wěn)定性又較差，不能直接用NADH 或NADPH標準液來校正儀器，須通過有NAD+(NADP+)參與的反應途徑。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等摩爾關(guān)系。葡萄糖有標準純制品，又有國家批準文號的葡葡糖標準液。因此，根據(jù)公式A=bC，已知比色杯光徑b和葡萄糖標準液濃度，測得葡萄糖標準管的吸光度A后便可計算出NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)為 A/bC。假設，葡萄糖標準液濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L)，標準液加入量為3.5L，酶試劑加入量為335L，比色杯光徑為0.7cm，在340nm測得吸光度為0.465，則實測NADH摩爾吸光系數(shù)= 6424，即在此臺分析儀上340nm波長處測得NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)為6424，而理論上NADH（NADPH）的為6220。（2）色素原酶促產(chǎn)物在405nm波長摩爾吸光系數(shù)的測定：有許多酶底物為人工合成的色素原底物，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應產(chǎn)物，在405nm波長具有吸收峰。最常用色素原底物及其產(chǎn)物為: ALP測定以磷酸對硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT測定以-L-谷氨酰對硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或-L-谷氨酰-3-羥基-對硝基苯胺(-L-Glut