蛋白質(zhì)和酶的分離與純化.doc

蛋白質(zhì)和酶的分離純化及鑒定蛋白質(zhì)是生命體中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向。要研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化的目的蛋白。蛋白質(zhì)在組織或細胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)。要想從成千上萬種蛋白質(zhì)混合物中純化出目的蛋白，就要根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)不同設(shè)計出合理的分離方法。目前研究為止酶除核酶外本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，因此酶的分離純化方法基本是采用蛋白質(zhì)的分離純化方法，但是酶的活性受到多種因素的影響，因此酶的分離純化比一般的蛋白質(zhì)要求更高。一、質(zhì)分離純化的一般原則1. 原料的選擇 原則：來源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：體液、組織、細胞定位2. 破碎方法： (1) 機械方法：通過機械運動產(chǎn)生的剪切力的作用，使細胞或組織破碎的方法。 如：搗碎法、研磨、勻槳法 (2) 物理方法：通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。 如：反復(fù)凍融、滲透壓、超聲破碎 (3) 化學(xué)方法：通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，使細胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非離子型的表面活性劑（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蝸牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特異、快速、精確的定性或定量方法4. 先粗后細，分級分離 粗分：將得到的蛋白溶液先利用簡單、快速、易處理的方法除去大部分雜蛋白。如: 鹽析、離心、有機溶劑沉淀等。 精制：利用蛋白質(zhì)性質(zhì)的差異，采用不同的方法，如:離子交換層析、分子篩、吸附層析、親和層析、電泳、離心、結(jié)晶等方法進一步純化。 5. 避免蛋白質(zhì)的變性（pH、適合的溫度和緩沖體系等）二、常用的蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)可以根據(jù)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)不同設(shè)計分離方法。（一）根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度不同進行分離1. 蛋白質(zhì)鹽析蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量從1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1-100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。蛋白質(zhì)的表面電荷和水化膜是其主要的穩(wěn)定性因素。 大多數(shù)蛋白質(zhì)都溶于水，在低鹽條件下，蛋白的溶解度隨著鹽濃度的升高而增加，這稱為蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象，而鹽濃度達到一定以后，蛋白質(zhì)水化膜被破壞，電荷被中和，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的升高而降低，并且析出，這就是鹽析現(xiàn)象。由于各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。常用的中性鹽：硫酸銨、醋酸鈉、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中最常用的是硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小，溶解度高（25時的飽和度為4.1mol/L，即767g/L；0時的飽和度為3.9mol/L，即676g/L）；在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白都可以鹽析出來；另外，硫酸銨不容易引起蛋白質(zhì)變性；不同濃度硫酸銨pH在4.5-5.5之間，可以結(jié)合等電點進行分離純化，沉淀效果更好。影響鹽析的因素：溫度：pH：蛋白質(zhì)濃度：鹽析的缺點是蛋白質(zhì)沉淀后要除鹽，否則會影響后續(xù)的電泳或離子交換等相關(guān)實驗。2. 等電點沉淀法蛋白質(zhì)在等電點時，也就是靜電荷為零時，蛋白質(zhì)顆粒之間的靜電排斥力減小，蛋白的溶解度下降，容易發(fā)生沉淀，因此，可以調(diào)節(jié)溶液的pH，使其達到目的蛋白的等電點，使之沉淀而分離。但是，此方法很少單獨應(yīng)用，一般與鹽析法或后述的有機溶劑沉淀法聯(lián)合應(yīng)用效果更好。3. 有機溶劑沉淀法有機溶劑可使溶液的介電常數(shù)降低，蛋白之間的靜電引力增大，互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破壞，蛋白的溶解度降低。優(yōu)點：易于進一步的分離，不用脫鹽缺點：易引起蛋白的變性，所以沉淀后要盡快的分離常用的有機溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進行分離1. 透析與超濾透析就是利用透析膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾是利用壓力和離心力，促使大小不等的分子通過濾過膜，兩者都是根據(jù)化合物的分子量進行分離的一種方法，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2.凝膠過濾法是以各種多孔凝膠為固定相，對不同分子量的組分進行分離的一種層析方法。也叫凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。常用的凝膠材料: 葡聚糖凝膠（Sephadex)：是由葡聚糖交聯(lián)而成，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，耐高溫（120）, 型號多，可用于各種物質(zhì)的分離和純化。 瓊脂糖凝膠（Sepharose)：是一種天然多孔凝膠，孔徑大，適用于大分子量分子的分離。 聚丙烯酰胺凝膠：是人工合成的凝膠，交聯(lián)度不同，孔徑不同，可用于各種蛋白的分離。缺點是強酸會使凝膠的酰胺鍵破壞。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離1. 電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因為分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而彼此分離。2. 離子交換層析法是利用離子交換劑上可解離基團對各種離子的的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑：是含有可解離的陽離子或陰離子基團不溶性高分子化合物，這些基團能與溶液中的其它陽離子或陰離子進行可逆的交換。按活性基團性質(zhì)不同：陽離子交換劑 陰離子交換劑按母體物質(zhì)種類不同：離子交換樹脂：小分子量蛋白質(zhì)分離 離子交換凝膠：各種分子量蛋白質(zhì)分離離子交換纖維素：各種分子量蛋白質(zhì)分離 陽離子交換陽離子交換劑中含有酸性基團，能解離出氫離子，與樣品溶液中的陽離子進行交換。 強酸型陽離子交換劑：磺酸（R-SO3-H） 弱酸型陽離子交換劑：磷酸（R-HPO3-H） 羧酸（R-COO-H） 酚羥基（R-O-H） 陰離子交換陰離子交換劑中含有的堿性基團，能釋放出陰離子，與樣品溶液中的陰離子進行交換。 強堿型陰離子交換劑：季胺 R-N+(CH3)3-OH- 弱堿型陰離子交換劑：伯胺 (R-N+HH2-OH-) 仲胺 (R-N+HCH3H-OH-) 叔胺 R-N+ (CH3)2H-OH-（四）根據(jù)蛋白質(zhì)特異性進行分離-親和層析親和層析是利用生物分子與配體之間具有的專一而又可逆的親和力，是生物分子分離純化的技術(shù)。固定相：上述提到的凝膠或樹脂結(jié)合上配體。優(yōu)點：選擇性好，純化步驟簡單，一次就可達到很高的純化倍數(shù)。缺點：價格昂貴，處理量少，不適合大規(guī)模應(yīng)用，洗脫劑要求高，無通用性。總之，根據(jù)擬分離的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、防止變性以及樣品情況和實驗條件選擇最佳方法。有時往往不止用一種方法進行分離純化，而是選擇幾種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行分離，力求達到純化和高產(chǎn)的目的。實驗一 g-球蛋白的分離純化一、實驗?zāi)康恼莆盏鞍踪|(zhì)分離純化的基本方法和步驟。二、原理-球蛋白是一組結(jié)構(gòu)相似但又有差異的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobin, Ig）。 按其結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)性質(zhì)的差異分為五類。分別為IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，其中IgG占70%。血清中有70余種蛋白質(zhì)，本實驗的目的是要從70余種血清蛋白中分離出-球蛋白。1. 粗分，采用飽和硫酸銨鹽析法，如果蛋白質(zhì)溶液體積大，要求達到的硫酸銨飽和度在50%以上時，可在蛋白質(zhì)混合溶液中直接加入硫酸銨試劑如果蛋白質(zhì)溶液體積小，要求達到的硫酸銨飽和度在50%以下時，可采用飽和硫酸銨溶液法，飽和硫酸銨溶液的加入量按下式計算： V=V0（C2-C1）/(100-C2) 或者是V=V0（C2-C1）/(1-C2)V: 應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積；V0：蛋白質(zhì)溶液的原始體積；C1：原溶液的硫酸銨飽和度；C2：要達到的硫酸銨飽和度。硫酸銨鹽析法可使蛋白質(zhì)純度提高5倍，而且可以除去核酸等雜質(zhì)。2. 除鹽：采用透析法使硫酸銨除去。3. 精制：采用陰離子交換層析法利用陰離子交換纖維素層析其優(yōu)點是：具有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，吸附量大；具有親水性，用溫和的條件可以洗脫，不易引起蛋白質(zhì)的變性或酶的失活；具有多孔性，表面積大，交換容量大，回收率高，可用于分離和制備。4. 純度鑒定：采用醋酸纖維素薄膜電泳。三、試劑和器材1.試劑 正常血清（人、兔、狗） 飽和硫酸銨溶液 0.0175mol/L磷酸緩沖液1.0ml（pH6.3） DEAE-纖維素 納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液，與氨氮反應(yīng)生成淡紅棕色的化合物（410-425nm)。 20%磺柳酸試劑2. 器材 層析柱及支架 白色和黑色比色板 透析袋及細線 燒杯2個、試管20支 吸管1個四、操作步驟1. 取少許血清作為A樣。2. 鹽析：取2ml血清加2ml生理鹽水于離心管中，混勻后緩慢滴加飽和硫酸銨溶液4ml，邊加邊混，室溫放置10min，3000 rpm，離心10min，小心除去上清，沉淀加0.0175mol/L磷酸緩沖液1.0ml（pH6.3）復(fù)溶。3. 透析除鹽：用細線扎住透析袋一端，將溶解的g-球蛋白溶液倒入透析袋內(nèi)，用線扎緊透析袋另一端，放入一大燒杯中，加入蒸餾水進行透析，每隔10min用納氏試劑在白板上檢測燒杯中的NH4+，并更換蒸餾水直至檢測不到NH4+為止，留取透析袋內(nèi)液體2滴，作為B樣。4. DEAE-纖維素離子交換層析： 裝柱：取層析柱加入蒸餾水，觀察水流是否通暢，然后將層析柱垂直固定到支架上，關(guān)閉下端出口，將處理再生后的DEAE-纖維素懸液攪拌均勻后緩慢倒入層析柱，使柱床高度達到10-15cm。 平衡：打開柱的下端出口，用3個柱床體積的0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH6.3）平衡后關(guān)閉柱的下端出口。 上樣：將透析脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液緩慢加到DEAE-纖維素柱床上，開下端出口，使樣品進入柱床。 洗脫：用0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH6.3）洗脫蛋白，并且立即收集洗脫液，流速為10滴/min，每2min收集1管，按順序排列。 洗脫液中蛋白質(zhì)的檢測：取黑色比色板或干凈的試管一個，按洗脫管順序分別取1滴于其中，然后加入20%磺柳酸試劑1滴，出現(xiàn)白色渾濁或沉淀即為蛋白質(zhì)析出，記錄并估計各管的蛋白質(zhì)濃度，取濃度最高的一管作為C樣。五、實驗注意事項1. 硫酸銨緩慢滴加，避免形成瞬間高濃度，導(dǎo)致雜蛋白共沉。2. 離心前試管要平衡，對稱放入離心機內(nèi)，開機和關(guān)機要緩慢加速和減速。3. 透析時兩端要扎緊，不要扎段，10min左右換水一次，否則容易導(dǎo)致透析袋內(nèi)樣品稀釋。4. 裝柱時不能分層，不能進入氣泡，轉(zhuǎn)好后用上樣緩沖液平衡。5. 樣品進入柱床后再加洗脫緩沖液，否則會導(dǎo)致樣品稀釋。6. 洗脫時流速不要太快，否則也會導(dǎo)致洗脫液中的蛋白質(zhì)稀釋而檢測不出。實驗二 g-球蛋白的鑒定一、實驗?zāi)康恼莆盏鞍踪|(zhì)的電泳鑒定方法和步驟。二、原理電泳是在外界電場的作用下，帶電物質(zhì)向所帶電荷相反電極方向的移動，由于蛋白質(zhì)所帶電荷不同，遷移速度不同而彼此分離。影響電泳的主要因素有溶液的pH、電場強度、電泳液的離子強度、電滲的影響，下表是血清5種蛋白質(zhì)的理化參數(shù)。5種蛋白質(zhì)的理化參數(shù)分類PIMWAlb4.886.915.0620.025.0630.05.129.0- 15.06.85-7.515.6-30.0三、試劑和器材1. 試劑 巴比妥緩沖液（pH8.6）。 氨基黑10B染色液。 漂洗液2. 器材 電泳儀及電泳槽 燒杯