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FDA藥物相互作用研究指南 藥學(xué)部盧進(jìn)2010 7 13 介紹內(nèi)容 簡(jiǎn)介藥物相互作用研究的背景知識(shí)藥物相互作用研究的一般策略體內(nèi)藥物相互作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)藥物代謝酶的確認(rèn)CYP酶抑制 誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià)P gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究 簡(jiǎn)介 美國(guó)FDA 藥物評(píng)價(jià)和研究中心 CDER 生物制品評(píng)價(jià)和研究中心 CBER 2006年9月 共同發(fā)布 藥物相互作用研究 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 數(shù)據(jù)分析及其在劑量調(diào)整和處方標(biāo)簽中的應(yīng)用的指南 簡(jiǎn)介 指南為新藥和新生物制品的研發(fā)者提供了 藥物代謝 藥物轉(zhuǎn)運(yùn) 體內(nèi) 體外 相互作用研究規(guī)范 簡(jiǎn)介 內(nèi)容涉及藥物相互作用研究的全過程包括 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究人群或體外研究用細(xì)胞 微粒體探針底物 抑制劑 誘導(dǎo)劑的選擇觀察指標(biāo) 樣本量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 等除了代謝性藥物相互作用以外 還對(duì)P糖蛋白介導(dǎo)的藥物相互作用的研究方法給予了詳細(xì)的指導(dǎo) 與1999年版本相比的增加內(nèi)容 1 藥物相互作用研究的背景知識(shí) 包括細(xì)胞色素P450 CYP 酶在內(nèi)的多個(gè)藥物代謝酶都能被聯(lián)用的藥物所抑制 誘導(dǎo) 藥物濃度發(fā)生巨大改變 影響藥物安全性和有效性 同時(shí) 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的藥物相互作用受到越來越多的關(guān)注如 P gp 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 OAT 等 表一 人類主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和已知的底物 抑制劑 誘導(dǎo)劑 2 藥物相互研究的一般策略 根據(jù)體外代謝 已知和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定體內(nèi)相互作用研究必要性 流程圖 目前尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6酶被誘導(dǎo)的情況 而CYP2C CYP2B和P gp是可以和CYP3A一起被誘導(dǎo)的 CYP3A對(duì)所有已知的誘導(dǎo)劑都很敏感 因此 考察受試藥物能否能夠誘導(dǎo)CYP1A2 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19和CYP3A時(shí) 只需要體外考察對(duì)CYP1A2和CYP3A酶的誘導(dǎo)情況即可 若體外實(shí)驗(yàn)顯示受試藥物對(duì)CYP3A無誘導(dǎo)作用 那么就可以免做對(duì)CYP2C和CYP2B的誘導(dǎo)研究 3 體內(nèi)藥物相互作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究群體底物和作用藥物的選擇給藥途徑給藥劑量 3 1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 思路 比較底物 S 濃度在有和沒有作用藥物 I 時(shí)的變化情況 隨機(jī)交叉法 先服用S后服用S I組 先服用S I組后服用S組 單次序交叉法 總是先服用S后服用S I組 或相反 平行設(shè)計(jì) 一組服用S 一組服用S I 設(shè)計(jì)方案時(shí)應(yīng)該注意 1 如果實(shí)驗(yàn)需要達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度而底物或作用藥物和 或 其代謝物的半衰期較長(zhǎng) 此時(shí)不能采用額外給予一個(gè)負(fù)荷劑量的方法加快達(dá)到穩(wěn)態(tài) 2 如果作用藥物是一個(gè)快速可逆的抑制劑 其服用時(shí)間應(yīng)該在測(cè)定當(dāng)天服用底物前或同時(shí)服用 這樣才能增加其敏感性 對(duì)于基于作用機(jī)制的抑制劑 如紅霉素 在服用底物藥物前服用作用藥物可以放大相互作用強(qiáng)度 如果作用藥物 抑制劑或誘導(dǎo)劑 的吸收受多種因素的影響 如胃pH值 則需要采取適當(dāng)?shù)姆椒刂莆辗矫娴淖兓?3 為了排除由于食物 飲料 果汁等影響代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而引起誤差 指南建議實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制飲食 3 2研究群體 一般是健康受試者 在特定環(huán)境下 受試藥物表現(xiàn)的治療效果或者藥效學(xué)效果不在健康者身上出現(xiàn) 此時(shí)要從患者群體中招募受試者 藥物相互作用的程度可能因受試者某個(gè)具體CYP酶的基因型不同而有所差異 3 3底物和作用藥物的選擇 表二 指南推薦的CYP酶底物 雞尾酒 模式釋義 在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中受試者同時(shí)服用多種CYP酶底物 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需考慮下列因素 1 一種特定酶的底物對(duì)該酶具有較高的選擇性 2 底物之間沒有相互作用發(fā)生 3 受試者的數(shù)量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 4 藥物濃度變化在安全范圍內(nèi) 5 入選的CYP酶都參與藥物代謝消除 6 藥物其他代謝途徑或者不被抑制的途徑的藥物清除率低 評(píng)價(jià) 這種雞尾酒實(shí)驗(yàn)的陰性結(jié)果可以免除對(duì)其中某個(gè)具體酶的進(jìn)一步評(píng)價(jià) 然而陽性結(jié)果則需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究 雞尾酒實(shí)驗(yàn)可比單個(gè)相互作用研究提供更多的信息 而結(jié)論的確定程度取決于藥物其他不被抑制的代謝途徑的清除率分?jǐn)?shù) 清除率分?jǐn)?shù)越小 確定程度越高 如果單一的相互作用實(shí)驗(yàn)顯示抑制效應(yīng)可以導(dǎo)致嚴(yán)重的安全隱患 則不能進(jìn)行雞尾酒設(shè)計(jì)法 3 4給藥途徑 受試藥物的給藥途徑應(yīng)與將來臨床應(yīng)用的方式一致 體內(nèi)相互作用研究采取的給藥方式取決于未來上市劑型 3 5給藥劑量 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)盡可能將底物和作用藥物相互作用的結(jié)果最大化 因此指南推薦作用藥物 抑制劑 誘導(dǎo)劑 使用最大安全劑量和最短給藥間隔 當(dāng)使用低于臨床常用劑量的給藥方案時(shí) 體內(nèi)藥物相互作用研究方案應(yīng)在結(jié)果報(bào)告中進(jìn)行討論 4 藥物代謝酶的確認(rèn) 如果某個(gè)酶對(duì)藥物的代謝量占整個(gè)藥物消除量 25 則可以確認(rèn)此酶是藥物的主要代謝酶 將藥物和肝細(xì)胞或肝切片一起孵育 然后通過色譜方法分析孵育介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度 這種方法可以直接獲得氧化 水解或基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成的代謝物 提供平行代謝還是先后代謝的信息 另一種方法是用HPLC來分析孵育介質(zhì) 實(shí)驗(yàn)還需要優(yōu)化介質(zhì)中受試藥物濃度和孵育時(shí)間 臨床預(yù)期的穩(wěn)態(tài)血藥濃度可以用來指導(dǎo)體外實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中藥物濃度的選擇 有三種方法可以很好地確認(rèn)不同的CYP酶對(duì)藥物代謝的貢獻(xiàn) 1 特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑表5 列出了常用的特異性化學(xué)抑制劑 在確定代謝酶種類及其在藥物代謝中的相對(duì)貢獻(xiàn)時(shí) 藥物的濃度要 Km值 而抑制劑的濃度既要保證其選擇性又要保證足夠的量 所以可以采用一系列的抑制劑濃度 當(dāng)使用基于作用機(jī)制的抑制劑時(shí) 最好將抑制劑與酶預(yù)先孵育15 30min 2 應(yīng)用不同的人重組CYP酶 這種技術(shù)對(duì)研究單個(gè)CYP酶在整個(gè)藥物代謝中的相對(duì)貢獻(xiàn)的大小具有很高的價(jià)值 但不能代表人肝微粒體酶中的絕對(duì)的代謝比率 3 根據(jù)不同供體來源的CYP酶不同活性建立人肝微粒體庫 指南建議至少采用上述兩種方法來確認(rèn)藥物代謝酶 5 CYP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià) Review Ki 抑制率常數(shù) 抑制作用越強(qiáng) 此值越小IC50 反應(yīng)被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度 越低表明抑制劑的抑制能力越強(qiáng) 5 CYP酶抑制作用的體外評(píng)價(jià) CYP酶抑制劑體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng) 1 IC50測(cè)定時(shí) 在底物代謝率允許的情況下 盡量使底物的濃度低于其Km值 使IC50與其Ki值更具相關(guān)性 2 肝微粒體蛋白濃度通常 1g L 1 3 緩沖液的性質(zhì) pH對(duì)Vmax和Km的影響顯著 盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)化的分析條件 4 反應(yīng)系統(tǒng)中最好控制底物或抑制劑的消耗不超過10 30 但是對(duì)于Km值很低的藥物來說 控制反應(yīng)體系底物消耗 10 很困難 5 建議建立時(shí)間 產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系 6 建議建立酶量 產(chǎn)物形成量的線性關(guān)系 7 因?yàn)槟承┯袡C(jī)溶劑具有酶誘導(dǎo)或抑制作用 溶劑的濃度都要 1 v v 最好 0 1 實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括無溶劑對(duì)照和溶劑對(duì)照 8 實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有一個(gè)已知抑制劑的陽性對(duì)照 相互作用程度的模擬 R 1 I Ki I 代表作用部位抑制劑的濃度 Ki是抑制常數(shù) 指南推薦體內(nèi)相互作用的可能性通過 I Ki來推斷 I 代表服用臨床最大用藥量后平均穩(wěn)態(tài)的藥物濃度 游離或結(jié)合的全部藥物 比值升高 產(chǎn)生相互作用的可能性增大 盡管通過體外數(shù)據(jù)定量預(yù)測(cè)體內(nèi)相互作用發(fā)生的可能性存在困難 但可以通過同一個(gè)藥物對(duì)不同CYP酶 CYP1A2 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6和CYP3A 的Ki值進(jìn)行篩選排序 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從 I Ki最大者 或者Ki最小者 的CYP酶開始 如果實(shí)驗(yàn)顯示體內(nèi)不存在藥物相互作用 其他的 I Ki相對(duì)較小的CYP酶的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)就可以不做 6 CYP酶誘導(dǎo)作用的體外評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)包括一個(gè)公認(rèn)的酶誘導(dǎo)劑作為陽性對(duì)照 來減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差 表7 誘導(dǎo)劑選擇列表 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意 1 受試藥物的濃度應(yīng)該參考臨床治療劑量的血藥濃度 至少包括3個(gè)涵蓋治療窗的篩選濃度 其中至少1個(gè)濃度要超過平均預(yù)期治療濃度1個(gè)數(shù)量級(jí) 2 與肝細(xì)胞共孵育2 3d后 通過CYP特異的探針?biāo)幬?參考指南推薦 測(cè)定酶活性 3 使用新鮮分離的或者凍存的肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí) 應(yīng)該至少選擇3份不同的供體以減少誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中存在的個(gè)體差異 評(píng)價(jià)藥物酶誘導(dǎo)作用時(shí) 指南建議 1 藥物體外實(shí)驗(yàn)引起的酶活性的改變 40 陽性對(duì)照結(jié)果時(shí) 可以認(rèn)為藥物具有酶誘導(dǎo)作用 需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究 2 EC50可以用來比較不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱 3 指南認(rèn)為 根據(jù)目前了解的CYP酶誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制 如果一個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)CYP3A4酶沒有誘導(dǎo)作用 可以推斷此藥物對(duì)CYP2C8 CYP2C9和CYP2C19也沒有誘導(dǎo)作用 7 P gp底物和抑制劑的體外實(shí)驗(yàn)研究 考察藥物是否是P gp的底物或抑制劑 最常見的方法有哪些 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定法由于更直接 因此被作為標(biāo)準(zhǔn)的方法 ATP酶活性測(cè)定法和攝取 外排法可以用于快速篩選 但是不能區(qū)分是底物還是抑制劑 如果藥物透過性 膜擴(kuò)散能力 低 ATP酶法和熒光定量法常常無法識(shí)別是否是P gp的底物 對(duì)高通透性化合物 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定法也不適用 這些底物作為陽性對(duì)照 保證實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞能夠表達(dá)功能性的P gp 7 1雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)確定藥物是否是P gp的底物 選擇好細(xì)胞系和P gp底物陽性對(duì)照后 遵循下列步驟完成實(shí)驗(yàn) 1 設(shè)計(jì)幾個(gè)不同的藥物濃度 如1 10 100 mol L 1 考察P gp對(duì)藥物的外排作用 2 實(shí)驗(yàn)開始前 將極性細(xì)胞組成的膜兩側(cè)的介質(zhì)去掉 加入新的介質(zhì)并孵育30min 3 進(jìn)行雙向膜轉(zhuǎn)運(yùn)通透性研究 在極性膜的A側(cè) apical側(cè) 腔側(cè) 頂區(qū)側(cè) 轉(zhuǎn)運(yùn)方向是A B 或B側(cè) basolateral側(cè) 基底側(cè) 轉(zhuǎn)運(yùn)方向是B A 加入適量體積的含有已知P gp底物或受試藥物的緩沖液 4 在37 C孵育 在預(yù)定的時(shí)間 通常是1 2 3 4h 收集受側(cè)的介質(zhì)測(cè)定藥物濃度 同時(shí)迅速補(bǔ)充緩沖液 5 已知P gp底物作為陽性對(duì)照進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn) 6 當(dāng)采用LLC2PK1 MDR1MDCK MDR1作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系時(shí) 相應(yīng)的野生型細(xì)胞系LLC PK1和MDCK作為陰性對(duì)照 7 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在不同日期重復(fù)3次 考察日間和日內(nèi)變異情況 8 理想的實(shí)驗(yàn)還應(yīng)該測(cè)定底物的回收率 來消藥物代謝和非特異性結(jié)合帶來的誤差 由于Caco 2 野生型的LLC PK1和MDCK也能表達(dá)其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 因此在評(píng)價(jià)藥物是否是P gp底物時(shí)要謹(jǐn)慎 為增加實(shí)驗(yàn)的可信性 建議增加P gp抑制劑 表10 存在下的底物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 如果藥物的外排可被P gp抑制劑明顯抑制 則說明藥物的外排與P gp有關(guān) 指南還建議 可以通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比MDR1過度表達(dá)細(xì)胞 轉(zhuǎn)染型細(xì)胞 和它們的野生型細(xì)胞對(duì)藥物外排活性的差異 確定P gp在藥物外排中的貢獻(xiàn)大小 利用下列公式描述藥物跨膜表觀通透性 Papp Vr c0 1 S dc dt 其中 Vr是極性膜受側(cè)介質(zhì)體積 c0是指膜供側(cè)實(shí)驗(yàn)藥物的濃度 S是指極性細(xì)胞形成的膜的面積 dc dt是受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時(shí)間曲線的斜率 準(zhǔn)確計(jì)算Papp必須要求受側(cè)藥物濃度與時(shí)間是直線關(guān)系 藥物經(jīng)P gp外排速率RE可以通過下列公式計(jì)算 RE PB A PA BPB A和PA B分別代表受試藥物B A和A B的跨膜表觀通透性 7 2雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)確定藥物是否是P gp抑制劑 1 使用Caco 2細(xì)胞系時(shí) 要使用無藥介質(zhì)作為空白對(duì)照 測(cè)試藥物的濃度要適宜 2 當(dāng)采用LLC PK1 MDR1和MDCK MDR1作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系時(shí) 相應(yīng)的野生型細(xì)胞系LLC PK1和MDCK作為陰性對(duì)照 3 37 孵育細(xì)胞系0 5 1h后 去除孵育介質(zhì) 換成濃度合適的P gp探針底物 表9 4 孵育細(xì)胞系1 3h后 測(cè)定受側(cè)介質(zhì)中P gp探針底物的濃度 5 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在不同日期重復(fù)3次 每個(gè)實(shí)驗(yàn)也要用至少3個(gè)極性細(xì)胞膜進(jìn)行測(cè)定 7 3受試藥是否是P gp底物或抑制劑 以及是否需要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的判定流程 7 4潛在P gp誘導(dǎo)藥物的確定 P gp的表達(dá)可被誘導(dǎo) 已知的誘導(dǎo)劑包括利福平和圣約翰草 P gp對(duì)其誘導(dǎo)劑的反應(yīng)存在明顯的物種差異 因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能用來評(píng)價(jià)受試藥對(duì)人P gp的誘導(dǎo)效應(yīng) P gp的表達(dá)也受PXR的調(diào)控 因此和CYP3A酶具有共誘導(dǎo)現(xiàn)象 Caco 2缺乏PXR 不是研究P gp誘導(dǎo)作用的合適細(xì)胞系 文獻(xiàn)報(bào)道人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS180 WT和其多柔比星抵抗亞系 LS180 AD50 長(zhǎng)春堿抵抗亞系 LS180 V 被用來研究P gp和CYP3A酶的誘導(dǎo)效應(yīng) 指南指出 目前