細(xì)胞融合的方法、過程和影響因素

第四章1,細(xì)胞融合Cell Fusion,細(xì)胞融合概念,融合方法,融合過程,融合的影響因素,細(xì)胞融合,細(xì)胞融合（cell fusion）：又稱somatic hybridization or cell hybridization ，指在自然條件下或人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞通過無性方式融合形成一個(gè)雜合細(xì)胞的過程。它能重新組合兩個(gè)親本細(xì)胞的優(yōu)良遺傳信息，是研究細(xì)胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體定位、改良動(dòng)物遺傳特性及創(chuàng)造新的符合人類需要的新的細(xì)胞系極為有效的手段。自發(fā)融合：受精過程，成肌細(xì)胞融合，巨噬細(xì)胞融合，體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞融合誘發(fā)融合,一、 細(xì)胞融合的概念,1962年Okata發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞體，開創(chuàng)動(dòng)物細(xì)胞融合的暫新領(lǐng)域。,Singer and Nicolsons Model of membrane structure: The fluid-mosaic model is the “central dogma” of membrane biology.,The core lipid bilayer exists in a fluid state, capable of dynamic movement.Membrane proteins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees.,The Fluid Mosaic Model, proposed in 1972 by Singer and Nicolson, had two key features, both implied in its name.,The chemical composition of membranes,A. Membrane Lipids: The Fluid Part of the Model,Phospholipids: Phosphoglyceride磷酸甘油酯and sphingolipids Glycolipids Sterols ( is only found in animals),Membrane lipids are amphipathic.There are three major classes of lipids:,An Overview of membrane functions,1. Define the boundaries of the cell and its organelles. 2. Serve as loci for specific functions. 3. provide for and regulate transport processes. 4. contain the receptors needed to detect external signals. 5. provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion,細(xì)胞融合機(jī)理 細(xì)胞融合的關(guān)鍵：脂雙層的接觸靠近, 細(xì)胞橋形成, 胞質(zhì)滲透細(xì)胞核融合。,膽固醇,磷脂,糖脂,寡糖,疏水a(chǎn)螺旋,鰲合蛋白,極性孔,蛋白分子,Hydrophobic 疏水的Hydrophilic 親水的,二、誘發(fā)細(xì)胞融合的方法,病毒,化學(xué)PEG,電融合,1.病毒促進(jìn)細(xì)胞融合,病毒類融合劑是研究的最早的促融劑，一些致癌、致病病毒如皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合，但由于毒性大，應(yīng)用上收到很大限制。仙臺(tái)病毒（HVJ）是一類被膜病毒，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。 這一現(xiàn)象對你有何啟示？,HVJ促融機(jī)制：當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞間時(shí)，病毒表面spike上神經(jīng)氨酸酶降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部聚集在病毒周圍，在高pH和Ca2+條件下局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。,2.化學(xué)融合劑促進(jìn)細(xì)胞融合 1975年Kao和Chayluk報(bào)道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促進(jìn)細(xì)胞融合， Pontecorvo報(bào)道PEG促融效率高于仙臺(tái)病毒100-300倍。 PEG是一種多聚化合物，商品名卡波蠟Carbowax,分子量20020000，靠醚鍵的聯(lián)結(jié)使其分子末端帶弱負(fù)電荷，目前已衍生達(dá)50多種。,聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合,原理：PEG帶有大量的負(fù)電荷,和細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷在Ca2的連接下，形成靜電鍵，促使異源的細(xì)胞膜間的粘著和結(jié)合，在高pH,高Ca2溶液的作用下，將Ca2和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種細(xì)胞膜上的正負(fù)電荷連接起來，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。,注意事項(xiàng),1 PEG融合的關(guān)鍵是作用時(shí)間2 PEG規(guī)格和純度與融合效率有關(guān)3 融合與細(xì)胞密度有關(guān)4 融合液中加入少量CaCl2，即維持一定電導(dǎo)率，對細(xì)胞也有保護(hù)作用,3.電融合技術(shù)（Electroporation）,3,注意事項(xiàng),1）對介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間，以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。,融合參數(shù)：主要包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時(shí)間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。,優(yōu)點(diǎn)：,融合率高，達(dá)7080，甚至100 融合率（融合組多核細(xì)胞的核數(shù)對照組多核細(xì)胞的核數(shù)/對照組的全部細(xì)胞數(shù)）100可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞,原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。 1）親本 2）同核體homokaryon ：同源細(xì)胞融合體，它們的基因型和表現(xiàn)型完全一樣。 3）異核體heterokaryon ：異源細(xì)胞的融合體，它們含有雙親細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。 4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體 5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。 6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體,第二節(jié) 融合細(xì)胞的篩選,動(dòng)物細(xì)胞融合的篩選方式：,1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感親本B：對卡那霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長,2）營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時(shí)，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。,3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在37度范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡那霉素。雜種細(xì)胞能在高溫和含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。,4 具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選,HAT選擇系統(tǒng)基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選,HAT是含一定濃度次黃嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ Aminopterin，A ）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種:,需兩種酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧胸苷酸）次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶HGPRT酶: （催化次黃嘌呤產(chǎn)生肌苷）,主要途徑由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸是必不可少的媒介，參與嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻斷FH2到FH4合成。,雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK- 細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤A培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。,基于HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng),H（Hypoxanthine次黃嘌呤）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體A（Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體,HGPRT酶缺陷型細(xì)胞株（長期培養(yǎng)系）,不能在HAT培養(yǎng)液中生長,正常細(xì)胞,體外生存能力有限，最終也將死亡,融合細(xì)胞,最后，只有融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中存活,第三節(jié) 融合細(xì)胞克隆化,利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進(jìn)雜交瘤生長的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。,通過適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的1）取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，每孔內(nèi)將為一個(gè)細(xì)胞4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過812天后， 可觀察到有集落生長的孔。5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。,有限稀釋法,在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25的軟瓊脂。待細(xì)胞長成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。,軟瓊脂培養(yǎng)法,第四節(jié) 雜種細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用,1）基因定位 不同種屬的細(xì)胞融合時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)一個(gè)親本細(xì)胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個(gè)親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征相對應(yīng)的基因在特定染色體上。 例如 ：HGPRT人細(xì)胞與TK的小鼠細(xì)胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細(xì)胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。,2）體細(xì)胞雜種的致瘤性分析 通過正常二倍體細(xì)胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的融合來進(jìn)行致瘤性的遺傳分析。 3）遺傳缺陷的基因互補(bǔ) 基于雜種細(xì)胞的基因互補(bǔ)作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補(bǔ)作用，即雜種細(xì)胞可以具有兩