【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）島葉點燃癲癇大鼠海馬Arc、BDNF、TrkB表達(dá)及其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系-癲癇的臨床與實驗研究

0 分類號： 單位代碼： 10752 密 級：公 開 學(xué) 號： 2008181 寧夏醫(yī)科大學(xué) 碩士研究生學(xué)位論文 島葉點燃癲癇大鼠海馬 達(dá)及其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系 s 學(xué) 位 申 請 人 ： 指導(dǎo)教 師 ： 教授 申請學(xué)位門類級 別 ： 醫(yī) 學(xué) 專業(yè)名 稱 ： 外 科 學(xué) 研究方 向 ： 癲癇的基礎(chǔ)和臨床研究 所在學(xué) 院 ： 臨 床 學(xué) 院 論 文 完 成 日 期 ： 二一一年三月 寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院 s s 011 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果，無抄襲及編造行為。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng) 發(fā)表或撰寫過的作品成果。 對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 論文作者簽名 論文導(dǎo)師簽名 年 月 日 年 月 日 寧夏醫(yī)科大學(xué) 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明 寧夏醫(yī)科大學(xué)有權(quán)保留使用本人學(xué)位論文，同意學(xué)校按規(guī)定向國家有關(guān)部門機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)寧夏醫(yī)科大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢 索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文?？梢怨迹ò牵┱撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容。 （保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定） 論文作者簽名 論文導(dǎo)師簽名 年 月 日 年 月 日 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 中文摘要 I 島葉點燃癲癇大鼠海馬 達(dá)及其與學(xué)習(xí)記憶 關(guān)系 的研究 摘要 目的 電刺激 立慢性電點燃癲癇模型，通過避暗試驗觀察癲癇大鼠不同時間段學(xué)習(xí)記憶功能， 檢測 活性骨架調(diào)節(jié) 蛋白（ 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (酪氨酸蛋白激酶受體 B(島葉慢性電點燃癲癇大鼠海馬組織中表達(dá)， 探討 方法 關(guān)性研究：健康雄性 16只，隨機分為島葉點燃組、假手術(shù) 對照 組及空白對照組， 假手術(shù)組大鼠只植入電極及測定后發(fā)放閾，不行電刺激點燃。 點燃組 建立 島葉慢性電點燃模型。點燃組 分 0 周 、 1 周 、 2周 、 3 周 、 4 周 幾個亞組。觀察各 組大鼠行為學(xué)改變及腦電生理變化，采用避暗試驗方法記錄 各組大鼠 潛伏期（ 穿梭次數(shù)（ 研究其學(xué)習(xí)記憶變化 。 大鼠單籠飼養(yǎng)， 避暗試驗后，無外界刺激無痛處死假手術(shù)對照組及空白對照組大鼠 ，每組取大鼠 n=12 只。點燃組每亞組避暗試驗后于 1h、 3h、 6h、 12h、 24h 等不同時間點無痛處死大鼠，每時間點取大鼠 n=12 只； 取 1h、 3h、 6h、 12 取 1h、 12h、 247每組大鼠一半用乙醚麻醉后斷頭取腦，迅速取出海馬組織，分別放于凍存管中，置于液氮后再移 至 冰箱以備用，另一半經(jīng)乙醚麻醉后用 4%多聚甲醛灌注后取全腦放于蔗糖溶液分別梯度過夜脫水，應(yīng)用 包埋，冰箱保存以備組織切片用 。 標(biāo)本應(yīng)用免疫組化、 技術(shù)方法研究島葉電點燃致癲大鼠海馬 蛋白的表達(dá)并探討與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系 。 結(jié)果 1、 島葉慢性點燃后大鼠 自行癲癇發(fā)作，檢測大鼠腦電波可收集典型的癲癇腦電波模型。模型制作點燃成功率為 空白組避暗試驗結(jié)果 中文摘要 ），假手術(shù)組避暗試驗結(jié)果 （ 、 （ ），點燃組： 點燃 0周（即點燃當(dāng)天至點燃第七天） 避暗試驗 結(jié)果 ）；點燃 1周避暗 試驗 的結(jié)果 ）；點燃 2 周 避暗試驗結(jié)果的 ( （ ）； 點燃 3 周 避暗試驗結(jié)果的 (、 （ ）；點燃 4 周避暗試驗的 結(jié)果為 （ ）。 點燃 2周、 3周組 與 對照組相比學(xué)習(xí)記憶能力增強（ P 點燃 4周 與對照組比學(xué)習(xí)記憶能力 明顯下降（ P 假手術(shù)組與空白對照組 間 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2、分子生物學(xué)檢測顯示： （ 1） 免疫組織化學(xué)結(jié)果： 疫組織化學(xué)染色陽性結(jié)果表現(xiàn)為海馬細(xì)胞胞質(zhì)成棕黃色， 胞膜呈棕黃色。陽性細(xì)胞百分率點燃組與假手術(shù)對照組及空白對照組有明顯差異（ P 點燃組明顯高于對 照組。點燃組內(nèi)比較，陽性細(xì)胞百分率點燃 2 周 、 3 周組時明顯高于0周、 1周、 4周 組， 4 周組最低（ P 各亞組各個時間點檢測中， 42周及 3周組峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P 。 （ 2） 果 ： 在 對照下目的條帶清晰可見，通過測定各條帶的光密度值，與 點燃組與假手術(shù)對照組及空白對照組有明顯差異（ P 點燃組明顯高于對照組。點燃組內(nèi)比較，光密度校對值點燃 2周 、 3周組時明顯高于 0周、 1周、 4 周 組， 4周組最低（ P 各亞組各個時間點檢測中， 增出片段為 77 6h 達(dá)到高峰， 增出片段為 533 增出片段為248為 242周及 3周組峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P。 （ 3） 跡結(jié)果 ： 各個組大鼠海馬中 白 均有表達(dá)，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子參照物 對照下，通過測定各目的條帶的光密度值，與 點燃組與假手術(shù)對照組 及空白對照組有明顯差異（ P 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 中文摘要 燃組明顯高于對照組。點燃組內(nèi)比較，光密度校對值點燃 2 周 、 3 周組時明顯高于 0周、 1周及 4周 組， 4 周組最低（ P 各亞組各個時間點檢測中， 子量為：55 6子量為： 14 子量為： 145為 242周及 3周組峰值均最高 (P 4 周 峰值均最低（ P 。 結(jié)論 1、慢性 電刺激大鼠島葉成功建立了慢性癲癇點燃模型，通過行為學(xué)觀察及大鼠腦電生理檢測， 證實了島葉是某些癲癇發(fā)作的一種獨 立致癇源 。 明慢性島葉癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能受損。且進(jìn)一步證明了島葉癲癇與海馬關(guān)系密切，海馬在島葉點燃癲癇模型中起著非常重要的作用。 能參與了島葉癲癇的學(xué)習(xí)記憶功能，是學(xué)習(xí)記憶的重要分子基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ： 島葉癲癇、海馬 、 習(xí)記憶、避暗試驗 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 英文摘要 s o of s to s o D by of to by of to in by -P to of is in s ) 、 T:s) 、 of N: is no of T： ， is of P . is in of rc in h., to h, to 2h. is to w), to to w（ P . As in 4 rc in is of is of 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 英文摘要 V 【 : 中英文縮 略語 略 語 表 英文縮寫 英文全稱 中文全稱 治性癲癇 放電閾值 密度 電圖 刻早基因 性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白 經(jīng)生長因子 氨酸激酶受體 B 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 目錄 目 錄 中文摘要 英文摘要 縮略語表 前 言 1 一 、 大鼠島葉慢性電點燃癲癇模型的建立及學(xué)習(xí)記憶 功能研究 3 材料和方法 3 結(jié)果 11 二 、 島葉癲癇大鼠海馬 材料和方法 13 結(jié)果 19 討 論 27 小 結(jié) 參考文獻(xiàn) 45 綜 述 53 致 謝 60 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 61 個人簡歷 62 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 前言 - 1 - 前 言 癲癇是由多種復(fù)雜病因共同引起的腦功能障礙綜合征，且癲癇對高級神經(jīng)機能損害作用較大、病情遷延時間長，常留下多種后遺癥。癲癇反復(fù)發(fā)作所產(chǎn)生自發(fā)不規(guī)則放電可導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)生理機能及多種生理因子機能傳遞的異常，從而加重大腦多種生理生化功能的損害，加劇了由于異常功能放電所引起癲癇點燃效應(yīng)、軸索功能順應(yīng)性的改變、突觸傳遞及突觸可塑性改變所致的結(jié)構(gòu)及其功能異常，從而通過持續(xù)癲癇發(fā)作所形成異常放電活動或通過改變腦內(nèi)多 種正常神經(jīng)遞質(zhì)傳遞途徑及生理機能而影響認(rèn)知功能損害。臨床上可表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力、時間記憶力、空間想象力和邏輯思維能力等認(rèn)知功能的下降。 最近有研究報道，島葉在認(rèn)知功能方面有重要作用，特別對記憶、學(xué)習(xí)和情感起著至關(guān)重要的作用。作為人類第五腦葉的島葉是一高度發(fā)達(dá)的結(jié)構(gòu)，位置深在，周圍比鄰結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對其發(fā)生、發(fā)展、詳盡的解剖學(xué)聯(lián)系、特定功能，特別是其與癲癇的關(guān)系尚不明確 1 2007 年 研究證實，島葉起源癲癇病人在認(rèn)知功能方面有明顯損害，表現(xiàn)在空間記憶、情感等多方面（ K 2008)。 海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，也是癲癇密切相關(guān)腦區(qū)之一，在人類島葉癲癇患者以及各類癲癇動物模型中，均可出現(xiàn)海馬硬化、變性萎縮等形態(tài)及細(xì)胞學(xué)改變 3。最近在對有海馬病變的大鼠的研究發(fā)現(xiàn)海馬是正常的再認(rèn)記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 7。對大鼠及靈長目動物如：猴等海馬損毀試驗表明，其學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能明顯改變，其直接證明海馬是參與學(xué)習(xí)和記憶的腦認(rèn)知功能區(qū)。所以海馬是研究癲癇即島葉癲癇學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)之一。 一種效應(yīng)子。 4神經(jīng)生物自發(fā)放電、應(yīng)激等興奮性刺激促使海馬中性 受體迅速活化，并促使 錄功能增加，并通過翻譯成白，在功能神經(jīng)元特定的部位改變其突觸可塑性、調(diào)節(jié)長時程增強起重要作用，并發(fā)揮其獨特生物學(xué)功能。 白通過影響微管系統(tǒng)相關(guān)性蛋白復(fù)合體聚合 6，并通寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 前言 - 2 - 過調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞骨架之間相互作用，影響功能神經(jīng)元突觸的結(jié)構(gòu)可塑性，調(diào)節(jié)改變神經(jīng)元對信息的獲取、儲存、處理和鞏固等重要 功能。 神經(jīng)元突觸可塑性和記憶鞏固的關(guān)鍵分子 7 ，研究證實在學(xué)習(xí)記憶過程中伴隨著該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá) 7。 神經(jīng)元產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以促進(jìn)出生前后腦的發(fā)育。 腦內(nèi)含量豐富 ,在 發(fā)育過程中，可以支持神經(jīng)元存活、分化、生長和突觸形成，維持神經(jīng)元正常生理功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，參與神經(jīng)的可塑性，調(diào)節(jié)長時程增強增強記憶力。 括增加突觸終末的密度，促進(jìn)樹突和軸突的的生長有明顯促進(jìn)作用。并有證明直接參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶過程 其特異性受體 過一系列酶促反應(yīng)發(fā)揮生理學(xué)作用，可加強膽堿能、多巴胺能、 5 有酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經(jīng)營養(yǎng)素家族高親和力受體 14。 合后，可以引起其磷酸化并激活胞內(nèi)的酪氨酸激酶信號通路，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子移入細(xì)胞核并與特定基因的啟動子區(qū)結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄過程，從而調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)多種神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和分化等。 有與其特異性受體 合，才能發(fā)揮其多種的生物和生理學(xué)機能。最近研究發(fā)現(xiàn)，若阻斷其信號傳導(dǎo)通路，則 本 實驗采用慢性電刺激 鼠島葉，建立慢性電點燃癲癇大鼠模型，觀察大鼠慢性期癲癇的自發(fā)反復(fù)發(fā)作特點及大腦海馬區(qū)組織學(xué)改變，探討島葉癲癇的發(fā)病機制。并利用島葉電點燃模型觀察在不同時間點 蛋白在海馬中表達(dá) ，探討它們在島葉癲癇 對學(xué)習(xí)記憶的影響 。 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 材料與方法一 - 3 - 一、 島葉慢性電點燃癲癇大鼠模型的建立及學(xué)習(xí)記憶的研究 材料與方法 1. 島葉慢性電點燃大鼠癲癇模型的制作 6 8周齡健康成年 D)大鼠 216只， 體重 275 15有大鼠單籠飼養(yǎng)，避免強光、強噪音刺激， 24h 晝夜循環(huán)。 1周后進(jìn)行篩選，篩選后大鼠行嚴(yán)格固定喂食、喂水時間，嚴(yán)格控制食物的量，自由飲水。積極培養(yǎng)本批大鼠統(tǒng)一生活習(xí)性及覓食規(guī)律。 大鼠按體重由小到大順序排列，編為 1 216 號，利用隨機數(shù)字表取得隨機數(shù)，再將所得出隨機數(shù)從小到大順序安排編序號（按先后順序排列數(shù)字相同），依次分入三組，隨機分為島葉點燃組、假手術(shù)組和 空白對照組 ，假手術(shù)組、空白對照組每組 n=6只，點燃組 n=96 只。 空白對照組：不行手術(shù)，不安置電極，在 刺激實驗組的大鼠時以相同的方法刺激抓取 1 2 次即可。 島葉點燃組： 分別在島葉安放雙極電極，本實驗雙電擊安放在大鼠左側(cè)島葉，參考文獻(xiàn)實驗研究表明，左右無明顯差別。假手術(shù)組：同島葉點燃組方法，只植入雙電擊，測定后發(fā)放，不行電刺激點燃。 驗主要使用試劑 戊巴比妥鈉： 司 批號： 20091011 規(guī)格： 5g 頭孢噻肟鈉： 司 批號： 0000014， 規(guī)格： 80萬單位 蒸餾水： 由寧夏醫(yī)科大學(xué)科技中心試驗準(zhǔn)備室提供 無水乙醇： 南京光明化工公司，批號： 0910093602， 規(guī)格： 5005%乙醇： 上海振興化工公司，批號： 0911083903， 規(guī)格： 500凝牙托粉： 天津光明醫(yī)療器械齒科材料廠， 批號： 200912 自凝牙托水： 天津光明醫(yī)療器械齒科材料廠， 批號： 200912 A& 司 氯乙酸 ) 司 批號： 20091021 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 材料與方法一 - 4 - 司 批號： 20093031 烯酰胺） 批號： 20091211 脂糖粉） 批號： 00002341 硫酸銨） 司 批號： 21991221 溴酚藍(lán)） 批號： 20191031 基水楊酸） 批號： 21091711 司 批號： 20091011 M 脫脂奶粉） 公司 甲基亞砜） 批號： 21091711 巰蘇糖醇） 批號： 201191011 二胺四乙酸） 批號： 20891017 油） 批號： 20621011 甘氨酸） 批號： 21293011 阿拉伯樹膠粉） 批號： 22709111 基乙醇） 批號： 22309101 聚賴氨酸） 批號： 200912011 s（麗春紅） 批號： 20081011 二烷基磺酸鈉） 公司 溫） 批號： 20891011 司 批號： 200910123 甲醇（ 上海振興化工生物化學(xué)有限公司，批號： 0910493602， 規(guī)格： 500鹽酸 (37% 上海振興化工公司，批號： 0910093121， 規(guī)格： 500乙酸 (上海振興化工公司，批號： 0110092602， 規(guī)格： 500化鈉 ( 上海振興化工公司，批號 0912093602， 規(guī)格： 500化鉀 ( 上海振興化工公司，批號： 0810093622， 規(guī)格： 500g 磷酸氫二鈉 (上海振興化工公司，批號： 091003235， 規(guī)格： 500g 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 材料與方法一 - 5 - 磷酸二氫鉀 ( 上海振興化工公司，批號： 0911093602， 規(guī)格： 500g 氫氧化鈉 ( 上海振興化工公司，批號： 0710093602， 規(guī)格： 500g 驗儀器 鼠腦立體定位儀： 功能生物電子刺激器： 性顱骨鉆： Y O 冷光四孔手術(shù)無影燈： 廣東汕頭醫(yī)療器械廠 動物生命體征監(jiān)護儀 上海移數(shù)科技公司 驗方法 葉電極植入及其固定方法 圖 1 島葉電極植入示意圖 用鎳鉻漆包線（直徑： 150 m）及其微電子元件自制雙極大鼠島葉刺激用電極，電極兩尖端間距 100 m 200 m。電極制作完后置入戊二醛溶液中浸泡過夜，使用時用碘酒檫試。 巴比妥鈉 (50mg/腔注射麻醉大鼠，小心用動物脫毛專用 剪刀將大鼠頭頂部部毛盡量剪去，將大鼠頭部固定于腦立體定向儀上，門齒低于耳桿平面 5%酒精局部消毒皮膚，正中切口，呈橢圓形（長短軸比為： 23次剪除皮膚、皮下結(jié)締組織和鈍性分離骨膜，用無水乙醇露骨表面脫脂，顯露顱骨及前后囟點位置，用動物實驗蚊式鉗創(chuàng)面夾閉止血，露骨表面滲血可使用骨蠟涂抹。枕頂骨區(qū)及額骨區(qū)可安放 3個加固螺釘，枕骨區(qū)加固稍長螺釘（長約 兼做接地電極，見上示意圖所示。 立體定位：左側(cè)島葉（前囟點前 開 膜下 14。寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 材料與方法一 - 6 - 雙極電極安放于島葉，作為刺激電極；單級電極安放于右額硬膜外和左側(cè)小腦硬膜外，分別作為皮層記錄電極和參考電極，安放固定螺釘，生物膠固定于顱骨。所有電極均由雙孔接插件引出 ,并用牙托水泥將接插件固定在顱骨表面。大鼠電極及螺釘安放位置見圖 1，封閉創(chuàng)傷口。術(shù)后嚴(yán)密觀察大鼠呼吸頻率、心率快慢、皮膚溫度、血壓及其膚色等變化，使用大鼠生理體征監(jiān)護儀檢測 1 項指標(biāo)均達(dá)到正常，將鼠放回飼養(yǎng)籠，保證各鼠的單籠飼養(yǎng)，因大鼠有嗜血性，可能會相互咬噬；術(shù)后連續(xù)臀部肌注3d 頭孢噻肟鈉 /只以預(yù)防創(chuàng)面感染。 鼠島葉慢性電點燃的建立 后放閾值（ 測定 16：在電極植入手術(shù)后恢復(fù)5 7d，將大鼠置于屏蔽箱籠內(nèi)，雙孔插件外接延長線，讓大鼠自由活動，無強光及強聲等外界刺激影響。測定大鼠島葉的 100多功能生物電刺激器通過電極給大鼠島葉持續(xù)電流刺激，脈沖為雙向方波電流，設(shè)定波寬為 率 60赫茲，持續(xù)刺激時間 1秒。島葉刺激強度開始為 100 A，以后每間隔 2400 A，直到視屏腦電圖（ 錄到大 于或等于 3 秒時間的后發(fā)放電高而尖的棘波，即為該大鼠的后放閾值（ 從測定 激強度為 ，每日兩次，間隔時間為 8 小時，定時刺激大鼠島葉，記錄刺激時間及發(fā)作等級級別，直到大鼠出現(xiàn)癲癇 5級發(fā)作。 2 大鼠行為學(xué)實驗觀察 大鼠點燃過程中行為學(xué)觀察， 24 小時監(jiān)控大鼠活動情況，根據(jù)參考 評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行癲癇發(fā)作級別評分。 18： 0級：無任何明顯反應(yīng)； 級：面部陣攣抽搐，包括不自主眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼、頭部或全身濕狗樣抖動等； 級： 級行為學(xué)表現(xiàn)加節(jié)律性點頭動作； 級：級行為學(xué)表現(xiàn)加一側(cè)或雙前肢抬高、陣攣抖動，無明顯站立，閉眼頭部抖動明顯加重； 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 材料與方法一 - 7 - 級：級行為學(xué)表現(xiàn)加后肢站立、站立不穩(wěn)，但無跌倒； 級：級加雙側(cè)前、后肢強直、身體背屈強直、跌倒或口角嘔出白沫，持續(xù)站立和傾倒，失平衡和四肢痙攣抽動，或持續(xù)倒地不起，全身痙攣抽搐。 大鼠連續(xù)出現(xiàn) 10 次 3. 腦電圖描記 從開始刺激至試驗結(jié)束，共 50天，采用 6通道的信號記錄系統(tǒng)，對從每個電極的 。 24鼠自發(fā)癲癇的次數(shù)及時間和發(fā)作的強度。 4. 學(xué)習(xí)記憶實驗 （避暗試驗） 全部大鼠均采用避暗試驗（ 博士 ）箱進(jìn)行行為學(xué)測試 ，設(shè)備自帶軟件分析系統(tǒng)（上海移數(shù)信息科技公司）進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測試。實驗前將大鼠在試驗箱內(nèi)適應(yīng) 35 分鐘 ， 試驗箱分明箱、暗箱兩室，兩室間有一直徑 5“ n”形孔空洞，暗室底部有可外部自主控制通電銅網(wǎng)板。由于大鼠有喜暗的習(xí)性，將大鼠背對暗室的洞口放入明室，并開始計時，進(jìn)行學(xué)習(xí)實驗，大鼠可很快自由進(jìn)入暗室，此時即為大鼠潛伏期，并記錄，同時 接通暗室電源，直流電電擊，受到電刺激后大鼠會逃出暗室，如此訓(xùn)練104大鼠休息 24 小時 后，暗室銅網(wǎng)板通電，將大鼠同前置于明室，研究大鼠記憶功能，記錄大鼠從明室第 1 次進(jìn)入暗室的時間即為本次實驗大鼠潛伏期（ ，大鼠受電擊后會逃避性地跑出暗室，然后記錄 10鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)即穿梭次數(shù)（ 并記錄和觀察大鼠在明暗是活動時間和活動路線距離 ，共同作為記憶成績表現(xiàn)為潛伏期和穿梭次數(shù)。 5. 統(tǒng)計學(xué)處理及分析 采用 計軟件包進(jìn)行分析避暗試驗所得潛伏期及穿梭次數(shù)，所得數(shù)據(jù)以x s 表示，數(shù)據(jù)采用單因素因素方差分析，組間比較用 驗， p 有統(tǒng)計學(xué)意義。 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 結(jié)果一 - 8 - 結(jié) 果 1. 模型制作：模型點燃成功率為 大鼠島葉電刺激后發(fā)放閾值為： 35030A，點燃所需天數(shù)為： 5。實驗發(fā)現(xiàn)，實驗大鼠體重在一定范圍內(nèi)對大鼠的后發(fā)放閾值及點燃所需天數(shù)無明顯影響。點燃成功后， 24 小時視頻跟蹤顯示，大鼠會自發(fā)出現(xiàn)癲癇大發(fā)作，一般發(fā)作時間集中 于 下午（ 13 時 15 時）和凌晨（ 4 時 5 時）。一 般自發(fā)性發(fā)作次數(shù)為： 2 /天。有實驗研究證明，大鼠點燃成功后，如長時間不再行外界刺激，會出現(xiàn)癲癇不再發(fā)作現(xiàn)象，這位模型局限性，所以我們在每周固定時間行電刺激一次，使其保持癲癇鼠狀態(tài)。對實驗大鼠正常腦電圖、后發(fā)放閾腦電圖、癲癇發(fā)作腦電圖的測定進(jìn)行對比。記錄大鼠點燃過程中腦電波。如圖 1 圖 1（ a） 正常大鼠腦電圖，兩通道出現(xiàn)平穩(wěn)的波；（ b）癲癇發(fā)作大鼠腦電圖，出現(xiàn)明顯的癲癇波，波幅增高增寬； （ c）后放閾腦電圖，持續(xù)出現(xiàn) 3 2. 避暗試驗 ： 空白組避暗試驗結(jié)果 ），假手寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 結(jié)果一 - 9 - 術(shù)組避暗試驗結(jié)果 、 （ ），點燃組：點燃 0周（即點燃當(dāng)天至點燃第七天）避暗試驗結(jié)果 （ （ ）；點燃 1 周避暗的結(jié)果 （ ）； 點燃 2 周 避暗試驗結(jié)果的 ( （ ）； 點燃 3 周 避暗試驗結(jié)果的 (、 . 15次）；點燃 4周避暗試驗的結(jié)果為 ）。點燃 2周、 3周組 與 對照組相比學(xué)習(xí)記憶能力 增強（ P 點燃 4 周 與對照組比學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降（ P 假手術(shù)組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 表（ 1） 點燃 大鼠 避暗試驗的 s）及 ） 點 燃 組 0 周 1周 2周 3周 4周 注： 個亞 組內(nèi)比較， *示 P *示 P 各亞 組間相比較 示 P 示 P 照組大鼠避暗試驗的 s）及 ） 項目 空白對照組 假手術(shù)對照組 N 燃組各亞組避暗試驗周 2周 3周 4周分組 結(jié)果一 - 10 - 點燃組避暗試驗周 2周 3周 4周分組次數(shù) 材料與方法二 - 11 - 二、 島葉慢性電點燃癲癇大鼠海馬 材料與方法 標(biāo)本收集 大鼠單籠飼養(yǎng)， 避暗試驗后 ， 無外界刺激 無痛處死假手術(shù)對照組及空白對照組大鼠 ，每組取大鼠 n=12 只。點燃組每亞組避暗試驗后于 1h、 3h、 6h、 12h、 24h 等不同時間 點無痛 處死大鼠 ，每時間點取大鼠 n=12 只； 1h、 3h、 6h、 12測， h、 12h、 24h 等時間 檢測 7每組大鼠 一半用乙醚麻醉后斷頭取腦，迅速取出海馬組織，分別放于凍存管中，置于液氮后再移至 冰箱以備 ，另一半經(jīng)乙醚麻醉后用 4%多聚甲醛灌注后取全腦放于蔗糖溶液分別梯度過夜脫水，應(yīng)用 包埋， 冰箱保存以備組織切片用。 注方法 將大鼠無刺激的放置 醚箱中麻醉，正中開胸，從左心室至升主動脈快速灌注生理鹽水 100速沖洗體內(nèi)血液，隨后用 4含 4%多聚甲醛的 磷酸鹽緩沖液 (快后慢關(guān)注固定 15 分鐘，待固定完成后，以大鼠雙側(cè)眼球瞳孔變白為準(zhǔn)，剪刀快速斷頭，用咬骨鉗取腦，切取視乳 頭至乳頭體之間的腦組織，依次浸入相同的多聚甲醛固定液、 30%蔗糖、 20%蔗糖及 10%蔗糖梯度脫水中各 24 小時，并都存放于 4冰箱內(nèi)過夜，液氮內(nèi)異戊烷隔離行 埋劑冷凍包埋， 箱保存。 驗材料 56211 中杉金橋公司 N 235聚賴氨酸 )： 10 冰凍切片機： 動磨刀機 南京醫(yī)療器械模具廠 編號： 387821 自動雙重純水蒸餾器： 海第二生化儀器廠 編號： 232215 寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)