【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）β2腎上腺素受體基因的克隆及表達動物營養(yǎng)與飼料科學碩士論文

密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 2腎上腺素受體基因的克隆及表達 2 o. 2 摘 要 畜產(chǎn)品安全問題越來越成為社會關(guān)注的的焦點問題。鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺等 2激動劑在飼喂家畜過程中的濫用，使這些物質(zhì)在動物內(nèi)臟、肌肉組織大量積累。這些畜產(chǎn)品加工的食物直接影響人的健康。建立多殘留的快速檢測技術(shù)，對我國這樣一個養(yǎng)殖量巨大、養(yǎng)殖單元小的國家十分迫切。 2 腎上腺素受體（ 2一種具有 7 個螺旋結(jié)構(gòu)的整合膜蛋白。天然激素或人工合成的 2 激動劑與 2異性結(jié)合后，能引發(fā)細胞內(nèi)一系列生理變化。本研究的目的是克隆 2因，在大腸桿菌中表達 2白，為建立測定多組分 2 激動劑的殘留檢測方 法進行基礎(chǔ)研究。 本研究從大倉鼠的肺細胞組織總 ，用特異性引物，通過 方法擴增得到 2因全序列。測序結(jié)果表明，該基因與 報道的 5 種動物的 2 96%的同源性，表明該基因?qū)儆?2族成員，大倉鼠 2因序列長度為1254碼 417 個氨基酸。 本研究將 2長基因（ 2 N 端和（或） C 端截短的 4 個不同長度的片段（2 2 2 2 C 端通過 建有 6簽的兩個長度 的片段（ 2 2建到表達載體 ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 后，經(jīng) 導與 測發(fā)現(xiàn) 合蛋白在體外能夠表達。蛋白質(zhì)印跡實驗進一步確認了受體蛋白在體外的表達。 在原核表達的分析基礎(chǔ)上，將 2建到畢赤酵母表達載體 ，以建立酵母表達系統(tǒng)。已完成了 4 個表達載體的構(gòu)建，分別為： 序結(jié)果證實 2 因片段已正確插入表達載體中，為在畢赤酵母中表達 2造了條件。 關(guān)鍵詞 ：大倉鼠， 2 腎上腺素受體基因，克隆，表達 he of by As in in of of in is a 2 to of 2 or a of at AR on is to 2 of in by of in by of In 2AR NA of as a of 96% in to 254 bp 17 In AR . in in of ST on 2AR to of AR 2AR in 2 目 錄 第一章 引言 . .1 腎上腺素受體 激動劑的研究進展 1 腎上腺素受體 (研究進展 . . 3 G 蛋白偶聯(lián)受體表達的 研究進展 . .研究內(nèi)容和技術(shù)路線 . . .本研究的目的和意義 . . 11 第二章 試驗材料與方法 . . .試驗材料與試劑 . 12 儀器與設(shè)備 . . . 13 研究方法 . . . . 13 第三章 試驗研究與結(jié)果分析 . . 27 大倉鼠 2 腎上腺素受體（ 2因的克隆 2 7 2 腎上腺素受體（ 2因表達載體的構(gòu)建 .3 4 2腎上腺素受體（ 2基因的體外表達 .四章 討論 . 論 . . . 51 參考文獻 . 52致 謝 . 57作者簡歷 . 58 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 腎上腺素受體激動劑的研究進展 腎上腺素受體激動劑的化學結(jié)構(gòu)及作用機理 腎上腺素受體激動劑 (簡稱 激動劑 ) 是一類天然兒茶酚胺（如：腎上腺素（ 衍生合成的一類化合物。 激動劑一般可分為兩大類： 1）含取代基的苯胺型：如克侖特羅（ 和西馬特羅（ 化合物。 2）含取代基的苯酚型：如沙丁胺醇（ 特布他林（ 化合 物。 圖 1出了兩類激動劑中有代表性的化合物結(jié)構(gòu)。這些化合物在側(cè)鏈上都有共同的 亞氨基團（ 六元芳香環(huán)；它們的區(qū)別在于苯環(huán)部分和亞氨基有不同的取代基。 2 3 激動劑 ) 上腺素 ) 丙腎上腺素 ) 羥甲苯腎上腺素 ) 布他林 ) 諾特羅 ) 克多巴胺 ) 丁胺醇 ) 布特羅 ) 馬特羅 ) 侖特羅 ) - 布特羅 ) 圖 1 1he 論是合成的激動劑（如：克侖特羅）還是 腎上腺髓質(zhì)分泌的天然激素（如：腎上腺素），中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 2 都是通過與細胞膜上 腎上腺素受體（ （簡稱 合，來啟動一系列生化反應的。激動劑與 結(jié)合使 象發(fā)生變化，激動劑 R 復合物與 G 蛋白發(fā)生偶聯(lián)，激活的 G 蛋白（ 與腺苷酸環(huán)化酶（ 聯(lián)。激活的 三磷酸腺苷（ 轉(zhuǎn)化為 3,5。 而激活蛋白激酶（ 或在磷酸二酯酶（ 作用下自身失活 誘發(fā)酶磷酸化反應，觸發(fā)生理反應。激活的 產(chǎn)生以下效應：心率加快，支氣管、子宮和腸道平滑肌松弛，促進胰島素釋放和 糖原分解等。 激動劑在動物飼料中的應用 激動劑最初只是應用于醫(yī)學，屬于擬交感神經(jīng)作用藥物，能興奮支氣管平滑肌的 2 腎上腺素受體（簡稱 2使平滑肌松弛，支氣管擴張，用來治療支氣管哮喘?。▽O毓秀， 1996）。1965 年 表數(shù)據(jù)表明：咖啡因、茶堿、煙堿和 腎上腺素等藥物有可能改變哺乳動物的生長，它們可以直接或間接通過改變細胞膜的 度來發(fā)揮作用。 80 年代初期，美國司發(fā)表了用克侖特羅喂飼動物促進生長的文章（ et 1984）。研究 者通過對類似腎上腺素物質(zhì)的大量篩選和對豬、雞、牛、羊、魚等的動物試驗，把 激動劑引入到畜禽飼養(yǎng)領(lǐng)域中。 80 年代以后， 2 激動劑在畜禽飼養(yǎng)領(lǐng)域中得到了應用，最為常用的有： 克侖特羅 、萊克多巴胺、沙丁胺醇 、西馬特羅等 (王若軍， 1994)。 由于激動劑對動物具有促進肌肉生長，減少胴體脂肪含量，改善生產(chǎn)性能等功能，因此 激動劑后來又被稱為營養(yǎng)重分配劑，俗稱瘦肉精。 90 年代前后， 隨著 激動劑在畜牧業(yè)中的應用， 激動劑在飼養(yǎng)中的負效應開始被人們所關(guān)注。 激動劑產(chǎn)生的負效應有： 1）對動物生理產(chǎn)生不良作用，如：發(fā)現(xiàn)豬服用 激動劑后出現(xiàn)非病態(tài)的心率加快、血壓升高、血管擴張、呼吸加劇、心臟和腎臟負擔加重等現(xiàn)象； 2）肉品質(zhì)降低，口感變劣； 3）停藥后脂肪迅速補償性沉積； 4）動物對環(huán)境的調(diào)節(jié)能力降低等（屈健， 1998；朱愛民， 1996；王彥文， 1995）。更為嚴重的是，大量服用 激動劑，在動物組織中存在大量殘留，其中：眼睛中殘留量最高，其次是肝臟、腎臟、脾臟、毛發(fā)（楊志凌 ,2003）。 由于數(shù)倍于治療劑量的使用 激動劑， 90 年代后在世界范圍內(nèi)發(fā)生多次消費者食用含有 2激動劑類藥物較多的肉品，導致集體中毒的事件。 1990 年首次報道了西班牙中部 135 人由于食用了被克侖特羅污染的牛肝而集體中毒的事件。隨后歐洲發(fā)生多起食用被 激動劑污染的食物中毒事件（ 992； 991； 995）。近年來，我國也發(fā)生多起 食用被克侖特羅等 激動劑污染的食物而導致中毒的事件，如： 2002 年江蘇蘇州發(fā)生 26 人食用污染豬肝的中毒事件， 2003 年廣東佛山市順德區(qū)近 100 余人和遼寧遼陽市 39 人食用污染豬肉的中毒事件等。 所以，鑒于 激動劑 在 飼養(yǎng)中的負效應和它大量使用后在 動物體內(nèi)的殘留問題，歐盟已 經(jīng)禁止使用 2 激動劑 作為動物生長促進劑。 1997 年我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部和國家醫(yī)藥管理局共同發(fā)布了 176 號公告，禁止在飼料和動物飲水中使用 2 激動劑。 但是由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使，違法濫用的現(xiàn)象仍然存在，中毒事件時有發(fā)生 (楊曙明， 2003)。 激動劑的殘留檢測技術(shù) 激動劑的殘留檢測方法的研究，國外有許多報道。 1996 年對生物基質(zhì)中 激動劑的檢測方法有詳細的綜述（常碧影等， 2002）。歐盟也建立了測定生物樣品或動物飼料中 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 3 激動劑單一組分或多組分的篩選方法（ 確證方法（ S， S）。我國于 2001 年建立了飼料、動物組織中鹽酸克侖特羅的測定方法。但是多組分殘留檢測技術(shù)還遠遠滯后于國外水平。 目前用于檢測 激動劑的方法主要分兩大類。一類為確證方法，有 S， S，S 等 (孫遠明 ,2002；谷峰 ,2002)。通過質(zhì)譜檢測器對 激動劑類化合物結(jié)構(gòu)特征的分析，來確認殘留物的存在。另一類為篩選檢測方法。主要是放射免疫分析法（ 酶聯(lián)免疫分析法（ （陳勇等， 2002）。 中的 法，由于其具有簡捷，快 速、省時、靈敏度高等優(yōu)點，近年來得到了廣泛的應用，在大量樣品篩選工作中發(fā)揮重要的作用。 析法的局限性有： 1）在測定過程中由于多種原因會產(chǎn)生一定比例的假陽性。 2）每一種 針對一種 激動劑化合物的，不適用于多組分殘留檢測。 受體分析法是近年來提出的一種適用于多組分殘留檢測的方法，但由于其技術(shù)難度大，目前國內(nèi)外還未有商品化的產(chǎn)品用于檢測工作。在研究初期，受體的獲得是通過生物分離技術(shù)。分離動物體內(nèi)細胞膜上受體的辦法來獲得與 激動劑特異性結(jié)合的 于天然 非常低，提取和純化工作難度大， 且細胞膜上常常是同時存在著多種不同亞類的 以無法分離得到一種單一亞類的 使得受體分析法發(fā)展緩慢。隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展，多種動物的 外高效表達 為可能。本研究旨在通過克隆和體外表達技術(shù)得到 2 建立測定多組分 2 激動劑的殘留檢測方法進行基礎(chǔ)研究。 腎上腺素受體（ 研究進展 圖 1腎上腺素受體 1 結(jié)構(gòu) 圖 1鑲 嵌于細胞膜脂質(zhì)雙層中的整合糖蛋白， 64跨在靶細胞的細胞膜上，具有 G 蛋白偶聯(lián)受體的共性。 它在細胞膜上的排列結(jié)構(gòu)可以看到三個顯著特征：中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 4 1） 7 個平行排列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，每個螺旋均由 20疏水氨基酸殘基組成，這個區(qū)域的氨基酸殘基同源性和序列保守性最高； 2） N 端含兩個糖基化位點和三個親水性聯(lián)結(jié)環(huán)位于細胞膜外； 3） C 端和三個親水性環(huán)狀序列位于細胞膜內(nèi)側(cè)，其中 C 端富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，構(gòu)成潛在的磷酸化調(diào)節(jié)位點。腎上腺素的結(jié)合位點處于跨膜螺旋所形成的一個“口袋”內(nèi)。 功能域 跨膜結(jié)構(gòu)域 在 G 蛋白偶聯(lián)受體中， 7 個跨膜域中氨基酸的同源性和保守性最高，目前認為這些跨膜域共同參與形成一個“口袋”狀配基結(jié)合位點，任何一個跨膜結(jié)構(gòu)或其與膜外側(cè)環(huán)狀之間的聯(lián)結(jié)序列缺失或突變，均可影響 折疊，如位于，螺旋上的第 274氨基酸缺失的倉鼠 2突變受體不能與配基結(jié)合，但膜兩側(cè)的親水性環(huán)狀區(qū)氨基酸缺失的突變受體一般不改變配基結(jié)合特性?？梢娺@些跨膜結(jié)構(gòu)為維持 級結(jié)構(gòu)所必需，且構(gòu)成了配基結(jié)合位點。用胰蛋白酶處理 125親和標記的倉鼠 2 現(xiàn)其烷基化共價結(jié)合位點位于第條螺旋的 基上。第、和條螺旋上的個別氨基酸殘基的改變，也會顯著地影響配基結(jié)合特性，如位于第螺旋上的 代后，與激動劑的親和力下降，但不影響拮抗劑的結(jié)合能力；位于第螺旋上的 代后，對激動劑和拮抗劑的親和力均下降 （ ， 1987）。 基在所有的以具有潛在質(zhì)子化的氨基化合物為特異配基的受體中呈高度保守性，說明酸性氨基酸側(cè)鏈可能與質(zhì)子化的氨基陽離子配基 形成離子鍵結(jié)合。 激動劑 分子是含有兒茶酚結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)，其中的酚羥基可能與第、螺旋上的 鏈上的羥基形成氫鍵結(jié)合， 激動劑 分子中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可與第、螺旋中的 疏水側(cè)鏈形成疏水鍵結(jié)合。 某些跨膜結(jié)構(gòu)中也呈高度保守，它們可誘導跨膜螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生彎折，與其他氨基酸殘基 激動劑 結(jié)合位點 (， 1997； ， 2001)。 氨基端和膜外側(cè)結(jié)構(gòu)域 N 端有兩個典型的糖基化位點 有糖基，并對內(nèi)切糖苷酶 F 敏感，這些寡糖基鏈不參與受體與配基的識別和結(jié)合過程，但能增加受體的分子量，影響受體蛋白的折疊，促進新生受體插入細胞膜。此外，受體糖基化可以保護受體分子免受蛋白酶作用而過早降解。G 蛋白偶聯(lián)受體含有 10胱氨酸殘基，位于第一外側(cè)環(huán)上 第二個外側(cè)環(huán)上 蛋白偶聯(lián)受體中是絕對保守的，它們在兩個外側(cè)環(huán)之間形成二硫鍵，對維持受體三 級結(jié)構(gòu)有重要作用，若被其他氨基酸取代，可使受體結(jié)合特性發(fā)生顯著變化。第二外側(cè)環(huán)上的第 179氨基酸殘基缺失的倉鼠 2 突變受體，不能形成二硫鍵，從而導致配基與突變受體親和力的降低。對于 激動劑 和 結(jié)合位點和作用機理的研究對更好的利用受體提供了依據(jù)。 羧基端和膜內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)域 細胞膜內(nèi)側(cè)親水性環(huán)狀序列和羧基端的一個重要功能是構(gòu)成 G 蛋白偶聯(lián)域。第一，二內(nèi)側(cè)環(huán)的氨基酸殘基在 G 蛋白偶聯(lián)受體中保守性較高，第三內(nèi)側(cè)環(huán)上的氨基酸殘基在不同受體中的變化較大，說明受體與各種 G 蛋白相互作用的特異 性第三環(huán)起著關(guān)鍵性作用，而第一，二環(huán)無決定性作用。在 2 G 蛋白偶聯(lián)中絕對必需的第 221氨基酸殘基在溶液中能形成一種雙親中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 5 螺旋結(jié)構(gòu)，雙親螺旋結(jié)構(gòu)在受體與 G 蛋白的偶聯(lián)過程中具有重要作用， 激動劑 結(jié)合，導致受體構(gòu)象變化，從而使螺旋結(jié)構(gòu)適應 G 蛋白偶聯(lián)反應（呂志良等， 1992）。 分型和分布 20 世紀 40 年代晚期科學家系統(tǒng)地研究了腎上腺素，去甲腎上腺素和幾種化合物激活或阻礙 酸化，對受體和 了進一步了解。 （ 1967）根據(jù)對腎上腺素和異 丙腎上腺素結(jié)合力的大小、將組織中的 為 1 和 2 兩種亞型。 （ 1984）在大鼠脂肪組織中發(fā)現(xiàn)一種“非典型”的激動劑位點，與常規(guī)的激動劑結(jié)合力低，而與 激動劑的親和力較高，這種 稱為 3 1要分布于心臟和脂肪細胞膜上，與心臟刺激和脂肪分解有關(guān)； 2要分布于骨骼肌、平滑肌、胰島的 ， 1987），與氣管擴張及血管抑制有關(guān)。 （ 1989）認為，大部分器官組織中 1 2有可能存在。只是受體種類和數(shù)量存 在差異。心臟組織不僅含有 1時存在 2骼肌細胞膜上也存在少量有功能的 1 3研究始于 70 年代中期。陸續(xù)克隆出了人（ 989），大鼠 (991)和小鼠 (991)的 3因。通過 交分析技術(shù)對 3轉(zhuǎn)錄本（ 行研究發(fā)現(xiàn)，人、大鼠、小鼠和豬的白色脂肪組織中以及大鼠、小鼠的棕色脂肪組織中分布了大量的 3外，大鼠的肝臟、骨骼肌和回腸以及人的消化系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)和骨骼肌中存在 3（ 1999）研究 3豬體組織中的分布時發(fā)現(xiàn)， 3豬皮下脂肪組織中含量最多，心臟和骨骼肌中的含量高于肺中的含量，而肝臟中未檢測到 3轉(zhuǎn)錄本。研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠脂肪組織中的 3多，而豬脂肪組織中的優(yōu)勢亞型為 1 G 蛋白偶聯(lián)受體表達的研究進展 G 蛋白偶聯(lián)受體屬于一類整合膜蛋白超家族，由于它對外界刺激細胞反應調(diào)節(jié)作用中的重要性，使它在藥理學上有著重要地位 (. 996)。為了研究 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)， 20世紀 70代，科學家從動物的細胞膜上分離純化 et 1979； et 1981；et 1984），這種方法制備的 非常少，不足以滿足研究受體蛋白所需要的量。科學家發(fā)現(xiàn)，這種天然制備的膜蛋白是多種受體蛋白亞類的復合物，多種受體有著相似的藥理學性質(zhì)，多種受體的共存使得研究組織中一種特定的受體十分困難。隨著 G 蛋白偶聯(lián)受體基因克隆技術(shù)的發(fā)展，異源表達一種特定的受體蛋白，成為研究單一受體蛋白亞類的有效手段（ ,1998； ,1996）。 1986 年 在 志上發(fā)表了第一個 G 蛋白偶聯(lián)受體：金色中倉鼠的 2 基因后，隨后人的 2et 987），挪威鼠的 2et 1987)，家鼠的2et 1989)，牛的 2et 2003）基因等許多 G 蛋白偶聯(lián)受體的基因被克隆出來。異源表達受體主要用于三個方面的研究： 1) 受體與配體結(jié)合性質(zhì)的研究； 2）受體與 G 蛋白偶聯(lián)的研究； 3）受體結(jié)構(gòu)的 研究。 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌，酵母，桿狀病毒和哺乳動物等幾乎所有的表達系統(tǒng)中都可以表中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 6 達出有功能活性的蛋白，但成功的程度因受體的種類不同和宿主細胞特點的不同而有差異(. 996)。真核動物的 G 蛋白偶聯(lián)受體在哺乳動物細胞和桿狀病毒中表達有其優(yōu)勢，但由于操作復雜，所以更多的科學家選擇在大腸桿菌和酵母中表達 G 蛋白偶聯(lián)受體。即使在同一種表達體系中，不同的 G 蛋白偶聯(lián)受體表達的水平差異在 2 個數(shù)量級以上。不同類的 G 蛋白偶聯(lián)受體或同一類不同亞類的 G 蛋白偶聯(lián)受體的 7 個跨膜域的氨基酸是 很保守的，主要差異在于 N 端， C 端和膜外膜內(nèi)環(huán)部分。所以可以得出這樣的結(jié)論：對表達水平的影響主要就是這些保守性不強的部分。下面介紹 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌和酵母中的表達。 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達 通常 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達量非常低，因為大腸桿菌自身不具有 G 蛋白偶聯(lián)受體，蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中表達，對大腸桿菌來講是一種毒性蛋白。許多科學家通過嘗試，采取了一些策略和方法，改善了 G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達量。采取的策略有：融合表達，截去受體基因的非跨膜域，在受體基因的外側(cè)環(huán) 中導入正電荷， C 端融合 6多達十幾種標簽，誘導條件的優(yōu)化等多種方法，使受體蛋白在大腸桿菌中高效表達。下面就從這幾個方面作詳細的介紹。 外源基因在大腸桿菌中表達常用的策略是構(gòu)建融合基因。融合蛋白比天然蛋白更加穩(wěn)定，還可以提供蛋白純化的方法。 在 1995 年對膜蛋白的表達有詳細的綜述。目前用于受體表達構(gòu)建的融合表達載體有：麥芽糖結(jié)合蛋白（ 統(tǒng)，谷胱甘肽 統(tǒng)。一種大腸桿菌中具有的膜蛋白（ 1993），受體蛋白融 合在 面，使表達出的融合蛋白能正確插入到大腸桿菌的膜組織中，提取膜組織和溶解膜蛋白后可以得到表達的受體蛋白。 一種胞內(nèi)表達的蛋白， G 蛋白偶聯(lián)受體與 合后，表達的融合受體蛋白在細胞膜內(nèi)側(cè)松散的聚集在膜上，用柔和的條件可以分離受體蛋白（見表 1 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 7 表 1G 蛋白偶聯(lián)受體在大腸桿菌中的表達 蛋白名稱 N 端融合伴侶 C 端融合伴侶 啟動子 蛋白細胞中定位 參考文獻 6 細胞膜上 993 神經(jīng)緊張素受體 io 996 細胞膜上 994 神經(jīng)緊張素受體 2a 10 細胞膜上 H 2002 苷受體 5 6 細胞膜上 999 五羥色胺受體 . 1 細胞膜上 989 1 腎上腺素受體 6 胞內(nèi) 1996 嗅覺受體 1B 6 胞內(nèi) 2000 1 of 在 1987 年法國人 將 1 和 2一種膜蛋白 合后，在大腸桿菌中表達，并將表達的融合蛋白與同位素標記的激素做了結(jié)合試驗，得出結(jié)論融合表達的蛋白與配體有結(jié)合活性，他提出表達的融合蛋白可以作為一種有效的篩選配體的工具。英國劍橋大學 在 1993 年將 鼠神經(jīng)緊張素受體 （ 合在麥芽糖結(jié)合酶（ 后面，在大腸桿菌中得到表達。 1996 年 在進一步的研究中，截短了鼠 神經(jīng)緊張素受體，在 N 端融合麥芽糖結(jié)合 蛋白 C 端融合了 18 種 不同的標簽。他們的研究結(jié)論是 ： 1）受體蛋白 N 端蛋白酶敏感區(qū)的去除可以防止融合蛋白被蛋白酶水解；2） C 端標簽的加入對表達量有影響，同一受體不同標簽造成的表達量差異在 2 個數(shù)量級以上。他們認為在大腸桿菌中高效表達受體蛋白的關(guān)鍵因素很多，不僅僅是一方面的因素。主要因素有：1）受體蛋白的熱力學穩(wěn)定性； 2） C 端序列的特點； 3） N 端氨基酸對表達來說是不穩(wěn)定因素， 4） C 端標簽的影響是復雜的。在此之后德國人 002年在英國劍橋 驗室用同樣的表達系統(tǒng)完成了在大腸桿菌 2 腺苷受體。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 8 將受體蛋白與谷胱甘肽 合后，在大腸桿菌中表達的策略也有應用。 1996 年）在大腸桿菌 表達了 N 端融合 C 端結(jié)合 6簽的的嗅覺受體。表達的融合蛋白，由于受體蛋白的疏水性使其聚集在大腸桿菌的細胞膜的內(nèi)壁上，而并未整合到細胞膜上。將表達的蛋白與膜組織重組后，能表現(xiàn)出與配體的結(jié)合特性。 2000 年）進一步在大腸桿菌 表達了 11 種 G 蛋白偶聯(lián)受體 和其中 2 種 G 蛋白偶聯(lián)受體突變體（見表 1 表 1 融合 13 種 G 蛋白偶聯(lián)受體 3 ST 體 名 稱 全長 構(gòu)建中殘基 1B 倉鼠的 1B 腎上腺素受體野生型 515 32 1B 108R/ 515 32鼠 1B 腎上腺素受體 110R 突變體 A0 鯊魚 嘌呤核苷受體 352 15 人的黑色素 體 317 179R/鼠的神經(jīng)緊張素 80R 突變體 424 43鼠的神經(jīng)緊張素 生型 424 43-1( 人的神經(jīng)肽 體 384 22-2( 人的神經(jīng)肽 體 381 39 人的后葉催產(chǎn)素受體 389 29R5(52鼠的嗅覺受體 變體 314 18R5(鼠的嗅覺受體野生型 314 18視紫紅質(zhì) 348 1魚視紫紅質(zhì) 455 1 1受體及其突變體，構(gòu)建在 C 端，并在受體基因的 C 端連上 6簽。在 13種被表達的 G 蛋白偶聯(lián)受體中， 1B 腎上腺素受體及其突變體的 515 個氨基酸只將 32基酸構(gòu)建在載體中，去掉了 N 端和 C 端的部分序列；鯊魚 嘌呤核苷受體 等 7 種受體和一個突變體，去掉了 N 端部分序列；只有視紫紅質(zhì)（ 3 種受體是將全長構(gòu)建到表達載體中去的。 現(xiàn)在同一標簽（ 6同的受體在同樣的表達條件下，表達量差異在兩個數(shù)量級，表達量從 10%全細胞蛋白。表達水平與蛋白表達過程中表現(xiàn)出的毒性是相一致的。用多線性衰退分析方法研究了受體環(huán)區(qū)域的正電荷氨基酸數(shù)量與表達水平的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在環(huán)區(qū)域正電荷數(shù)量多的受體，表達量相應就高，分析結(jié)果表明： 44%的表達量可能是由受體蛋白膜外 3 個環(huán)和膜內(nèi) 3 個環(huán)的正電荷數(shù)量決定的。將兩個低表達量的受體 1B 腎上腺素受體（ 1B 嗅覺受體（ R5 過環(huán)區(qū)域?qū)胝姾傻霓k法使表達量提高了 5。 融合表達受體蛋白策略是改善 G 蛋白偶聯(lián)受體在大 腸桿菌中的表達量的總原則。不同受體主要的差異在于非跨膜域，這些區(qū)域是影響表達的主要因素。對這些區(qū)域的改造是科學家研究的重點之一。 表達嗅覺受體時截掉了 N 端 52 個氨基酸，在表達腎上腺素受體時截掉了 第一章 引言 9 端 31 個氨基酸和 319 以后的氨基酸，這些改變都提高了受體蛋白的表達量。 嘗試了在受體基因的外側(cè)環(huán)中導入正電荷的辦法，同樣得到了好的結(jié)果。 C 端融合標簽的研究近年來也有許多進展，帶正電荷的標簽，帶負電荷的標簽和中型電荷的標簽都有所研究。 對融合受體蛋白的誘導條件的選擇和優(yōu)化，也有許多報道。 er 1998)發(fā)表文章談到，用透性酶缺失（ 大腸桿菌作為表達宿主菌，是解決毒性蛋白表達問題的有效途徑。 et 002)報道，在誘導培養(yǎng)基中加入 葡萄糖能有效抑制大腸桿菌本底表達量，因為本底表達量高不利于外源蛋白的表達。在誘導培養(yǎng)基中加入激動劑的拮抗劑，可是提高表達后的受體蛋白與激動劑的結(jié)合能力。 受體蛋白是一種親脂性的蛋白，疏水的氨基酸非常多，在檢測表達產(chǎn)物的過程中，科學家發(fā)現(xiàn)在細菌裂解液的上清中沒 有受體蛋白，將不溶的部分用相應的試劑處理后，檢測到表達的受體蛋白（ 996）。受體蛋白與 膜蛋白融合表達時，在 作用下，受體蛋白能插入到大腸桿菌的細胞膜上，在溶解受體蛋白時多種去污劑被嘗試過： 1,2，8 等。其中 污劑的效果要好于其他，特別是將這三種去污劑混合后使用，效果會更好。在受體蛋白與 合表達時，超速離心得到的大腸桿菌細胞膜和受體蛋白的復合物處理起來就沒有那么復雜，用 2% 液處理超速離心后的沉淀物，就可以把受體蛋白溶解下來。這說明與 合的受體蛋白可能沒有正確的插入到細胞膜上，而是