組織工程軟骨生物支架材料研究新進展.doc

組織工程軟骨生物支架材料研究新進展前言關(guān)節(jié)軟骨為覆蓋關(guān)節(jié)表面的一層光亮的結(jié)締組織,富有彈性，摩擦系數(shù)小，能吸收關(guān)節(jié)間的振蕩，是機體重要的力學(xué)器官之一。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，組織代謝活性較低，創(chuàng)傷及退行性變等所致的軟骨損傷難以自我修復(fù)或以纖維軟骨、纖維組織所填充替代。這種損傷可涉及全層關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛和功能障礙。兩個半世紀以來，人們一直致力于探索修復(fù)軟骨缺損的最佳途徑和方法，其中包括軟骨刨削、鉆孔、微骨折術(shù)、軟骨組織移植術(shù)等，這些治療方法均存在不同程度的限制如：供體來源不足，免疫排斥、生成軟骨不佳、遠期效果不好等，遠不能滿足臨床應(yīng)用的需要。由Langer和Vacanti提出的組織工程學(xué)使得關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)替代物即人工軟骨顯示出美好的前景。生物支架材料是構(gòu)建人工軟骨的中心內(nèi)容之一， 本文檢索PubMed數(shù)據(jù)庫及中文期刊全文數(shù)據(jù)庫200301200612有關(guān)組織工程軟骨生物支架材料的文章，就近年來生物支架材料的新進展做一綜述。正文1 生物支架材料概述作為細胞賴以生存的三維空間生物支架材料不僅提供軟骨細胞生長依附的空間架構(gòu)、力學(xué)需求和幾何形狀，更重要的是它作為細胞外基質(zhì)之一，可以協(xié)調(diào)生物活性因子和細胞之間的相互作用，增進細胞的附著，潛在地影響細胞表面因子受體的表達和細胞的分化。理想的生物支架材料應(yīng)該具有以下10個特征： 良好的生物相容性?？山到庑?。足夠的孔隙結(jié)構(gòu)。 促進細胞黏附與增殖。 具備承載生長因子的能力。 支架的容積應(yīng)能保持不變。 支架能與周圍組織融為一體。 不易從缺損區(qū)脫落。 具有一定的彈性。 具有關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu)。目前常用的支架材料按其應(yīng)用形態(tài)可分為：凝膠類、微球類、海綿類、人工高分子聚合物支架材料；按其來源可分為：天然生物材料、人工合成高分子材料和復(fù)合材料。天然生物材料主要包括：膠原、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、瓊脂、糖胺多糖(如：透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等)、藻酸鹽、蠶絲蛋白 、松質(zhì)骨骨基質(zhì)、脫細胞基質(zhì)等。作為天然的細胞外基質(zhì)成分或同源成分，天然生物材料具有良好的生物相容性和弱抗原性且材料本身含有特殊的氨基酸序列，有利于細胞表面黏附分子識別，并能維持細胞的分化狀態(tài)。天然脫細胞包括脫細胞軟骨基質(zhì)、小腸黏膜下基質(zhì)等，其方法主要是利用同種或異種器官組織，經(jīng)過脫細胞、去除抗原處理得到脫細胞基質(zhì)材料。該材料具有細胞外基質(zhì)成分，有良好的組織親和性和相容性，有利于細胞的黏附、增殖和分化，并且具有一定的力學(xué)強度。但是脫細胞基質(zhì)比較致密，孔隙率較低制約著種植細胞向深層發(fā)展，因此天然脫細胞生物支架材料有待于進一步改進。Yin等報道制備一側(cè)松質(zhì)骨，一側(cè)皮質(zhì)骨的“雙相”骨質(zhì)基明膠，體外接種免骨髓基質(zhì)干細胞以修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。結(jié)果顯示：“雙相”骨質(zhì)基明膠松質(zhì)骨面，細胞于其中增生，形成富含細胞的軟骨層；皮質(zhì)骨面，細胞層狀覆蓋于其表面，可作為支撐作用的軟骨下骨。術(shù)后1個月即可重建關(guān)節(jié)骨軟骨缺損；6個月內(nèi)始終保持關(guān)節(jié)面及軟骨下骨結(jié)構(gòu)完整。天然生物材料來源于動物或人體，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、成分、生物力學(xué)環(huán)境適合種子細胞的生長、發(fā)育及新陳代謝，材料可降解，因此越來越受到研究者的重視。但是在運用中均存在不足：如膠原、纖維蛋白、瓊脂等在體外水解過程中不能保持空間構(gòu)型，并且吸收過快；殼聚糖支架的親水性、吸附能力較差，降解率偏慢。而且天然材料每批之間都有差別，產(chǎn)品質(zhì)量比較難以控制，因此亟待對天然生物材料進行多材料復(fù)合等改性。3 人工合成高分子材料人工合成高分子材料的微結(jié)構(gòu)、機械性能以及材料的降解時間等都可以預(yù)先設(shè)計和調(diào)控。目前常用的主要包括：聚乙醇酸、聚乳酸、B一磷酸三鈣、聚乙二醇(PEG)、聚乙內(nèi)酯(PCL) 、聚氨酯(polyurethane) 引、聚乙烯氧化(polyethylene oxide)、聚N異丙基丙烯酰氨(PNIPAAm)等。目前運用較廣泛的聚乙醇酸、聚乳酸由于具有良好的生物相容性、可降解性、降解可調(diào)性等，已被美國食品與藥品管理局(FDA)批準可用于組織工程支架材料。但是在運用中也發(fā)現(xiàn)了不少缺點，如其親水性不夠，對細胞的黏附性較弱，降解產(chǎn)物偏酸性可引起炎癥反應(yīng)，并且有一定的免疫原性 。lbusuki等用聚N一異丙基丙烯酰氨與凝膠制成可注射熱反應(yīng)凝膠支架，并接種兔軟骨細胞，結(jié)果表明細胞擴張增值，培養(yǎng)12周后，生成的膠原和硫酸糖胺聚糖(sGAG)含量接近體內(nèi)透明軟骨。近年來法國地中海大學(xué)成功地研制了微孔結(jié)構(gòu)可控的B一磷酸三鈣多孔陶瓷材料，該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機械強度，而且能夠根據(jù)需要調(diào)節(jié)材料在體內(nèi)的降解時間。其平均孔徑為100-300 m， 孔隙率為52 ， 孔與孔之間連接橋大小為30100 m，其體內(nèi)完全降解時間在6個月左右。郭希民等將擴增后的骨髓間質(zhì)干細胞接種到預(yù)制的B一磷酸三鈣上，植入羊關(guān)節(jié)軟骨缺損處，發(fā)現(xiàn)p一磷酸三鈣在體內(nèi)具有良好的生物相容性和軟骨組織生長引導(dǎo)能力，其微孔結(jié)構(gòu)適宜軟骨組織生長，新生組織為透明軟骨樣組織，結(jié)果表明B一磷酸三鈣為目前軟骨組織工程較為理想的細胞支架材料。4 復(fù)合材料復(fù)合材料是目前研究的熱點， 即將兩種或兩種以上具有互補特征的生物相容性可降解材料，按一定比例和方式組合，可設(shè)計出結(jié)構(gòu)與性能優(yōu)化的三維材料。以彌補單用人工合成或天然生物材料的缺陷。復(fù)合材料的制備不僅包括同一類生物材料的復(fù)合，還包括不同類別生物材料之間的交叉復(fù)合。41 天然生物材料之間的復(fù)合 軟骨細胞外基質(zhì)為膠原蛋白和糖胺聚糖形成的物理與化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，該基質(zhì)不僅使細胞在空間結(jié)構(gòu)形成特定的組織，而且還為其提供和傳導(dǎo)環(huán)境信號，引導(dǎo)細胞粘連。并形成組織之間的間隔。運用仿生學(xué)原理，通過多種天然生物材料的復(fù)合，模擬軟骨細胞外基質(zhì)成分來構(gòu)建與人體軟骨組織結(jié)構(gòu)和性能相類似的支架材料即仿生材料。目前常用的包括：殼聚糖，型膠原l、殼聚糖，透明質(zhì)酸、殼聚糖，硫酸軟骨素、纖維蛋白，透明質(zhì)酸、膠原、明膠、膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸鈉、明膠、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸鈉等。Yamane等用殼聚糖和透明質(zhì)酸混制得水凝膠，接種軟骨細胞發(fā)現(xiàn)細胞能很好地貼附于材料上，并且能維持細胞表型，存在有限的有絲分裂，能生成型膠原及蛋白聚糖等。閻繼紅等用刀研制膠原一透明質(zhì)酸一硫酸軟骨素支架，結(jié)果表明該復(fù)合支架有較強的案水性，軟骨細胞在支架上增殖分化良好，并分泌大量新的細胞外基質(zhì)，保持球型的軟骨細胞形態(tài)，維持表達特有的型膠原分化表型。體外培養(yǎng)21 d已有軟骨樣組織形成，出現(xiàn)軟骨陷窩。Hsu等將軟骨細胞植入精氨酰一甘氨酰一天冬氨酸肽修飾的殼聚糖藻酸鹽透明質(zhì)酸鈉復(fù)合支架，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞能良好地在支架上黏附生長和繁殖，并分泌豐富的糖胺聚糖和型膠原。將細胞支架復(fù)合物植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處，8周后缺損區(qū)完全修復(fù)，研究表明該支架的殼聚糖，藻酸鹽最佳比例為：1：1。42 人工合成高分子材料之間的復(fù)合 主要包括： 聚乳酸羥基乙酸、聚磷酸鈣纖維，L聚乳酸、聚己內(nèi)脂，乳酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、對苯二甲酸聚乙二醇酯一對苯二甲酸丁二醇酯共聚物(PEGT，PBT)、3一羥基丁酸、3一羥基己酸共聚酯，聚羥基丁酸脂(PHBHHPHB)、聚對二氧六環(huán)L聚乳酸，聚乙二醇(PPDOPLLAbPEG)等。Malda等采用三維纖維沉淀技術(shù)制成的對苯二甲酸聚乙二醇酯一對苯二甲酸丁二醇酯共聚物多孔支架，具有良好的孔隙率(7580)和孔徑(平均525 m)，進行體內(nèi)培養(yǎng)14 d后顯示：該支架能促進基質(zhì)的分泌，GAGDNA 重量比與正常軟骨相近，為一種較為理想的支架材料。清華大學(xué)微生物實驗室開發(fā)了3一羥基丁酸、3一羥基己酸共聚酯聚羥基丁酸脂共混體系作為新型的組織工程材料。研究表明該材料呈現(xiàn)比聚乳酸更好的生物相容性和一定強度的韌性，其生物材料的最終代謝產(chǎn)物為水和二氧化碳，對細胞無毒。培養(yǎng)在3一羥基丁酸、3一羥基己酸共聚酯聚羥基丁酸脂共混支架上的軟骨細胞不但能夠生長、增殖，而且保持了正確的分化形態(tài)，胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量磷酸鈣鹽生成，其成分為天然骨及軟骨中的主要無機成分羥基磷灰石。3一羥基丁酸、3一羥基己酸共聚酯聚羥基丁酸脂最佳比例為2：12023。Bhattarai等采用聚對二氧六環(huán)，L聚乳酸，聚乙二醇纖維制成的電鍍薄膜。實驗表明：該支架具有良好的直徑(平均為380 nm)、中間孔徑(8 m)、孔隙率(80)及機械強度(14 MPa)。接種NIH3T3成纖維細胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該 架具有良好的細胞相容性，能誘導(dǎo)細胞增殖，保持細胞表型。43 天然生物材料與人工合成高分子材料之間的交叉復(fù)合利用天然生物材料的良好生物相容性、細胞表面識別信號和人工合成高分子材料合適的機械性能等特性，設(shè)計出結(jié)構(gòu)與性能優(yōu)化的三維材料。盧華定等 研制具有分層柱狀結(jié)構(gòu)的膠原一羥基磷灰石復(fù)合支架，該支架表層為膠原；中層為多孔膠原一羥基磷灰石復(fù)合；底層為羥基磷灰石。研究表明該復(fù)合支架具有良好的細胞相容性、親水性，較膠原纖維有更強的力學(xué)性能，有望成為比較理想的軟骨支架材料。李忠等 。 將膠原凝膠包埋的軟骨細胞整合入聚乳酸，羥基乙酸、聚磷酸鈣纖維，L聚乳酸巨孔三維支架進行體外培養(yǎng)。既能發(fā)揮巨孔三維支架力學(xué)強度好及易于塑形等優(yōu)點，又能發(fā)揮膠原凝膠對細胞的均勻包埋和黏附作用。結(jié)果顯示軟骨細胞能高效種植、均勻分布于支架內(nèi)并能在支架上良好的黏附、生長和增殖，細胞一支架復(fù)合物能保持培養(yǎng)前的形貌，新形成組織為透明軟骨樣組織。分析天然高分子材料對于用于人體骨骼支架具有可行性。在未來不久，這一技術(shù)的開發(fā)和利用將受用與千千萬萬的殘疾人，對人類的機體活動再生能力作出貢獻，它的市場開發(fā)前景光明且越來越受到重視?？偨Y(jié)隨著分子生物學(xué)、生物材料學(xué)等的發(fā)展，新型材料不斷開發(fā)，如羥基磷灰石納米微粒聚左乳酸復(fù)合 12物 、細茵纖維素、纖維蛋白聚亞胺酯 、電鍍殼聚糖聚氧乙烯纖維等，實驗證明這些支架材料都具有人工軟骨支架的潛能。然而迄今為止還沒有任何一種材料被認為最理想，尋求一種具有良好的細胞相容性，可控制的降解率并具有一定力學(xué)強度的支架材料是關(guān)節(jié)軟骨組織工程的關(guān)鍵。目前生物支架材料研究的主要方向是： 一是通過對支架材料進行物理和化學(xué)的表面修飾以改善材料的表面活性，使之與種子細胞有更好的黏附、分布和功能發(fā)揮二是采用新型構(gòu)建技術(shù)(如RP技術(shù)等)等方法對材料的表面形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)進行改性，彌補支架材料的不足以構(gòu)建理想的支架材料；三是利用天然和合成材料 19的各自優(yōu)勢聯(lián)合應(yīng)用，進行多材料復(fù)合，以研制出具有生物相容性好、力學(xué)適應(yīng)能力強的復(fù)合材料。隨著納米材料、仿生材料及智能材料等的研制與開發(fā)以及種子細 胞分離培養(yǎng)技術(shù)的提高，相信在不久的將來，關(guān)節(jié)人工軟骨將是治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的一種理想的治療方法。1 鄂征，劉流醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)與臨床運用 ：ITS：北京出版社，2003，378-3792 Aoki H， Tomita N， Morita Y， et a1 Cultu怕of ch0nd 啪s in 24fi-broinhydrogel spongeBiomed Mater Eng 2003；13(4)：309-3163 韓雪峰，楊大平，郭鐵芳，等纖維蛋白膠塑形、異體微粒軟骨脫細胞基質(zhì)支架的人工軟骨研究【J】中國臨床康復(fù)，2005。9(2)：56-58 4 Fox DB， Cook JL， Arnoczky SP，et a1 Fibrochondrogenesis of freeintraarticular small intestinal submuco sa scafolds Tissue Eng 2004；10（1-2)：129-1375 Yin Z， Zhang L， W ang J Repair of articular cartilage defects withtwo-phase tissue engine red ca rtilage constructed by autologous man 1w m( fllchymal stem ca lIs and wo-phase allogeneic bonematrix gelatinZhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke za Zhi 2005；19(8)：652_657 6 楊志明組織工程骨的研究成果及存在的問題【J】中國修復(fù)重建外科雜志，2005，1 9(2)：87-897 Ii W J， Danielson KG， Alexander PG，et a1Biologica l respo nse of chondrocytes cultured in three-dimensional nanofibrous poly(epsilon-caprolactone)scafoldsJ Biomed Mater Res A 2003： 67(4)： 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