中藥龜甲膠的質量控制方法研究.docx

中藥龜甲膠的質量控制方法研究劉琳 1，張貴鋒 2*，查圣華 3，孔英俊 2，高建萍 2，王明林 1*，張宏 3，蘇志國 2（1山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271018； 2中科院過程工程研究所，北京 100190； 3同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司，北京 100022）摘要 目的：研究龜甲膠酶產(chǎn)物的多肽組成，探索基于特征多肽的龜甲膠質量控制方法；方法：利用液質聯(lián)用技術結合酶解技術，比較龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物的多肽組成，篩選差異性多肽；結果：龜甲膠酶解 產(chǎn)物中檢測出特征多肽，其對應離子分別為 m/z 856.0 和 m/z 732.7，而牛明膠中檢測出的多肽(m/z 727.8 和 m/z 782.5)在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測出。結論：龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物存在差異性多肽，基于特征多肽 或特征離子的龜甲膠質量控制方法具有可行性。關鍵詞 龜甲膠；質量控制；牛明膠；特征多肽；液質聯(lián)用龜甲膠是龜甲經(jīng)過漂泡、煎煮和濃縮等處理并添加輔料制成的固體膠，其功效包括滋陰潛陽、益腎強骨和養(yǎng)血補心等。龜甲膠主要成分為可溶性膠原蛋白及其降解產(chǎn)物1-3。近 年來隨著龜甲膠等膠類中藥的需求量不斷上升，市場上出現(xiàn)了摻加牛皮膠甚至皮革降解物偽 品龜甲膠，其有效功效較低甚至產(chǎn)生毒副作用。研究龜甲膠中蛋白質或多肽組成并篩選特征 性多肽不僅有利于龜甲膠質量控制，而且有利于建立相應的真?zhèn)舞b別方法。張思巨4等采用 IR、UV、TCL 和 HPLC 等技術研究了龜甲膠、鹿角膠和阿膠的理化性 質并嘗試用于三種膠的鑒別，但由于不同動物膠的宏觀性質相似，采用這些方法難以獲得有 顯著差異的信息。李春梅5等人利用 SELDI-TOF MS 分析了龜甲膠的蛋白質組成，但未比較 不同動物膠的蛋白質或多肽組成差異。其它方法如示差掃描量熱法6、等電聚焦電泳法7和 圓二色譜法8等也曾嘗試用于膠類中藥的鑒別。由于膠類中藥制備過程中需添加輔料且不同 廠家使用的輔料存在差異，龜甲膠在成分、分子量范圍和光譜特性等性質不穩(wěn)定。龜甲膠中存在大量的膠原蛋白降解物，不同動物來源的膠原蛋白其氨基酸序列會存在 差異9，這些差異可作為區(qū)分不同動物膠原或明膠的依據(jù)9,10。本研究擬采用 HPLC-MS 結 合蛋白酶切技術比較龜甲膠和牛皮膠酶解產(chǎn)物中的多肽組成差異，篩選特征離子或特征多 肽，探索一種基于特征多肽的龜甲膠質量控制方法。1 材料與方法1.1 樣品來源龜甲膠購自北京同仁堂藥店；牛明膠購自美國 Sigma 公司。1.2 儀器與試劑胰蛋白酶(序列純)購自美國 Promega 公司；牛 I 型明膠購自美國 Sigma 公司， 2,4-二硝 基氟苯(DNFB)購自 Acros Organics 公司，其他試劑均為市售分析純。液質聯(lián)用系統(tǒng)由 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo 公司 LCQ DecaXP 質譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件分別為 Xcalibur1.3 和 Biowroks3.1。2891.3 實驗方法1.3.1 樣品處理稱取 1 g 研磨后的龜甲膠樣品，加入 20 mL 水，50水浴溶解，室溫 10 000 r min-1 離心 15 min，取清液加入 20%飽和三氯乙酸，4保存 10 min，10 000 r min-1 離心 15 min，收 集上清液和沉淀物。將沉淀物重新溶解于水中，調 pH8.0，加入 100 L 胰蛋白酶 37酶解 12 h，采用 HPLC-MS 分析其多肽組成。1.3.2 分析方法1.3.2.1 凝膠過濾色譜分析 色譜柱 TSK G3000SWxL(7.830 cm, 5 m)；流動相 0.02 mol L-1磷酸緩沖液(pH7.0)；流速 0.5 mL min-1；進樣量 20 L；紫外檢測波長 214 nm。1.3.2.2 氨基酸組成分析 樣品水解、DNFB 法氨基酸衍生和液相條件分析條件參照文獻11。1.3.2.3 高效液相色譜質譜聯(lián)用分析色譜柱 ZORBAX SB-C18(2.1150 mm, 5 m)；流動相： 水(0.1%TFA)(A), 乙腈(0.1%TFA)(B)；梯度 0100 min，5%40%B；100120 min，40%70%B；進樣量樣品 20 L；流速 0.2 mL min-1。質譜條件噴霧電壓 4.5 kV；毛細管溫度為 300； 鞘氣(N2)60 個單位；正離子模式，一級質譜掃描范圍 m/z300900,精確質量數(shù)掃描(Zoomscan) 和二級質譜(MS/MS)掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描(Data Dependent Scan)；動態(tài)排除次數(shù) 1；動態(tài) 排除時間 0.5 min；二級質譜碰撞能量 35%，上述質譜條件中掃描范圍更改為 m/z 9001 400 和 1 4002 000，重復進樣。1.3.2.4 數(shù)據(jù)處理從 UniProtKB/Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫中提取全部膠原蛋白序列的數(shù)據(jù)庫。將質 譜數(shù)據(jù)使用 Biowork 軟件中 Turbosequest 進行數(shù)據(jù)庫檢索，檢索結果過濾參數(shù)：Xcorr1.5， DeltaCn0.1，二級質譜離子數(shù)量15，并綜合考慮目標離子色譜峰的信噪比及二級質譜圖中 b、y 離子匹配性和連續(xù)性。2 結果2.1 凝膠過濾色譜分析 龜甲膠樣品溶解后經(jīng)離心處理形成上下兩層，上次呈乳白色粘稠狀，下層為澄清透明的溶液。有研究報道龜甲膠中主要包含蛋白質和多肽類、多糖類和脂類物質11,12，樣品溶液經(jīng) 離心后分成的兩層中上層主要為脂類物質，多糖和蛋白質及多肽類物質分布在下層溶液，圖 1A 是下層溶液的凝膠過濾色譜圖。下層溶液經(jīng) TCA 處理后出現(xiàn)沉淀物，實驗采用凝膠過濾 色譜對上清液和重新溶解的沉淀物進行了分析。圖 1B 是下層沉淀物重新溶解后的凝膠過濾 分析結果，表明樣品溶解經(jīng) TCA 沉淀后下層沉淀物具有較高的分子量分布，沉淀物經(jīng)考馬 斯亮藍法分析的結果表明沉淀物主要是蛋白類物質。上清液中的組分平均分子量較低，在保 留時間 1320 min 范圍內未檢測分子量較高的組分(圖 1C)。由于糖類物質在 TCA 溶液中可 溶解，因此，TCA 沉淀處理后樣品中的多糖類物質主要存在于上清液?？捡R斯亮藍法分析 結果表明上清液中存在少量蛋白或多肽類物質，但平均分子量較低，應屬于膠原蛋白降解后 的低分子量多肽類物質。實驗將沉淀物充分洗滌后進行了酶解處理，圖 1D 是酶解產(chǎn)物的凝膠過濾分析結果，表 明沉淀物的酶解液保留時間主要集中在 29 min 左右，比圖 1B 保留時間 13.5 min 明顯延后， 說明龜甲膠中蛋白質被酶解成分子質量較小的多肽片段。2.2 氨基酸組成分析290為研究龜甲膠中蛋白質的性質，實驗首先將經(jīng)過 TCA 處理后的沉淀物進行了水解，采用 DNFB 法衍生后采用 HPLC 進行了氨基酸組成分析。圖 2 是樣品的氨基酸組成分析 HPLC 圖譜，氨基酸組成分析結果見表 1，結果表明龜甲膠含有膠原蛋白特有的羥脯氨酸，含量約 占總氨基酸含量的 10%，與脯氨酸之和約占 20%，甘氨酸含量約占 32.5%，未檢出蛋氨酸和 半胱氨酸，這種氨基酸組成與膠原蛋白的氨基酸組成特征較為一致，說明龜甲膠中主要蛋白 質是膠原蛋白。樣品中甘氨酸含量低于 33%(膠原蛋白核心序列氨基酸組成特征)，表明龜甲 膠中也存在少量的非膠原類蛋白質或多肽13。A龜甲膠溶解并離心后的清液；B龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過 TCA 處理后的沉淀物；C龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過 TCA 處理后的上清液；D龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過 TCA 處理后的沉淀物酶解 產(chǎn)物圖 1 龜甲膠的凝膠過濾譜圖圖 2 龜甲膠氨基酸組成分析 HPLC 圖表 1 氨基酸組成分析表氨基酸含量*氨基酸含量*天冬氨酸谷氨酸 羥脯氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 甘氨酸 脯氨酸 精氨酸6310399321632510953丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 組氨酸 賴氨酸 酪氨酸95221528103244注：*龜甲膠中氨基酸含量以每 1000 個氨基酸殘基中的氨基酸的比例計算291圖 3 牛明膠(A)和龜甲膠(B)酶解產(chǎn)物質譜分析總離子流圖2.3 酶解產(chǎn)物 HPLC-MS 分析氨基酸組成分析結果表明龜甲膠中主要是膠原蛋白降解物，分子量分布范圍寬且多肽 的親疏水性相近。圖 3 表明龜甲膠的酶解質譜圖與牛明膠酶解產(chǎn)物質譜圖中多肽的保留時間 分布和分子量范圍較為相似，質譜數(shù)據(jù)的檢索結果也表明兩種膠的酶解產(chǎn)物中存在大量相同 氨基酸序列的多肽，其原因在于不同動物來源膠原蛋白的整體氨基酸組成差異并不顯著且存 在局部相同的氨基酸序列，酶解后這些多肽被釋放并形成質荷比相同的離子。不同動物來源的膠原蛋白序列存在局部氨基酸差異，膠原蛋白降解后的明膠經(jīng)酶解處 理后可形成有序列差異的多肽。實驗采用數(shù)據(jù)比對的方法對圖 3 中龜甲膠與牛明膠的酶解產(chǎn) 物的質譜數(shù)據(jù)進行了分析，并對存在差異的離子進行了篩選，結果表明龜甲膠酶解產(chǎn)物中存 在部分多肽，這些多肽對應的離子在牛明膠酶解產(chǎn)物中未檢出。圖 4 是龜甲膠酶解產(chǎn)物質譜 分析獲得的提取離子流圖，檢測出保留時間為 37.15 min 特征性多肽(m/z 856.0)；盡管牛明 膠中存在保留時間為 57.99 min 的 m/z 856.0 離子(圖 4B)，但其帶電荷狀態(tài)以及二級質譜均與 圖 4A 中離子 m/z 856.0 的帶電荷狀態(tài)以及二級質譜存在顯著差異，表明其氨基酸序列不同。 龜甲膠中存在保留時間為 40.68 min 的特征性多肽(m/z 732.7)(圖 4C)，而牛明膠酶解產(chǎn)物中 未檢測出該離子以及對應的多肽(圖 4D)。數(shù)據(jù)檢索結果表明龜甲膠中還存在其它特征多肽，這些多肽與牛膠原蛋白序列中對應的多肽局部氨基酸殘基發(fā)生了變化。A.龜甲膠 m/z 856.0；B.牛明膠 m/z 856.0；C.龜甲膠 m/z 732.7；D.牛明膠 m/z 732.7圖 4 龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物提取離子流圖292數(shù)據(jù)比對結果表明牛明膠酶解產(chǎn)物也存在許多特征多肽，其對應的離子在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測出，這些多肽可作為鑒定龜甲膠樣品中是否存在牛明膠的標志物。圖 5 是牛明 膠酶解產(chǎn)物質譜分析后的提取離子流圖，檢測出保留時間為 52.06 min 特征性多肽 (m/z727.8)(圖 5B)，而龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測出該多肽(圖 5A)；牛明膠酶解產(chǎn)物中檢測出 m/z782.5 的特征多肽，其保留時間分別為 45.33 min、46.75 min、48.43 min 和 49.54 min(圖 5D)，而龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測出 m/z782.5 的多肽(圖 5C)。牛明膠酶解產(chǎn)物的質譜數(shù)據(jù)搜 集結果還存在其它多肽，其序列具有特征性且在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未被檢測。A.龜甲膠 m/z 727.8；B.牛明膠 m/z 727.8；C.龜甲膠 m/z 782.5；D 牛明膠 m/z 782.5圖 5 龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物提取離子流圖脯氨酸(Pro)羥基化修飾形成羥脯氨酸是膠原蛋白序列中最為常見的翻譯后修飾，有研究表明哺乳動物在其不同生長時期以及不同組織中，羥基化修飾位置和修飾程度存在一定差 異，使用質譜法進行多肽識別需綜合考慮多肽可能存在的羥基化修飾。牛明膠酶解產(chǎn)物提取 離子流圖中保留時間分別為 45.33 , 46.75 , 48.43, 49.54 min 色譜峰中多肽具有相同的質荷比 (m/z 782.5)，序列分析結果表明這些多肽具有相同的氨基酸序列，但羥基化修飾位置存在差 異。利用質譜技術檢測龜甲膠中特征多肽過程中，不同樣品中特征多肽的 Xcorr 和 DeltaCn 值可能會出現(xiàn)波動，主要原因在于脯氨酸的羥基化修飾不均一導致同一序列出現(xiàn)多條檢索結 果，需要結合多級質譜技術通過碎片離子的種類確定發(fā)生羥基化修飾的具體位置。3 討論龜甲膠以龜甲為原料經(jīng)熬制并添加一些輔料制成，龜甲中存在蛋白質(膠原蛋白和角蛋 白等)、糖胺多糖、脂類和無機鹽14-16等，這些物質在熬制過程中發(fā)生降解導致組成更為復 雜，基于理化性質的鑒別方法存在諸多不穩(wěn)定因素。為了去除樣品中的非膠原多肽類物質的 干擾，實驗首先采用沉淀法對樣品進行了預處理，以使高分子量的膠原蛋白降解物沉淀出， 提高特征多肽的檢出率。龜甲中膠原蛋白含量較高，因此龜甲膠中含有一定量的膠原蛋白降 解物，不同動物膠原蛋白之間的氨基酸序列差異是基于特征多肽的質量控制方法的理論基 礎。然而，由于龜甲膠分子量高且分布范圍寬，難以采用質譜直接進行分析，因此實驗采用 酶解技術進行了樣品處理，以降低龜甲膠中多肽的分子量并使特征多肽得以釋放。293由于膠原蛋白隨著動物年齡和生長情況發(fā)生動態(tài)變化，導致龜甲中脯氨酸和羥脯氨酸相對比例發(fā)生變化，利用質譜技術檢測龜甲膠中的特征多肽需考慮羥基化修飾的影響，尤其 是質譜數(shù)據(jù)解析時需要在搜索參數(shù)中設置脯氨酸發(fā)生羥基化修飾的參數(shù),以提高特征多肽的 識別率。本研究以不同動物之間膠原蛋白序列差異為基礎，采用液質聯(lián)用技術結合蛋白質酶解 技術進行了多肽檢測，證明了基于特征多肽的龜甲膠質量控制方法具有可行性，為深入研究龜甲膠的組成以及相應的有效成分研究提供了理論基礎。參考文獻1Nobuhiro Naqai, Hatsumi Kobayashi, Shizuka Katayama, et al. 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