基因克隆與表達(dá)ppt課件

蛋白原核表達(dá) 衛(wèi)文強(qiáng)2015 12 目的基因 T表達(dá)載體酶切 膠回收 連接轉(zhuǎn)化到克隆用細(xì)胞 Top10 提質(zhì)粒 酶切驗(yàn)證轉(zhuǎn)化到表達(dá)用細(xì)胞 BL21 DE3 誘導(dǎo)表達(dá)SDS PAGE DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì) 酚 氯仿 乙醇 SDS EDTA等都會(huì)影響酶的活性 1 DNA的純度 影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素 2 DNA的甲基化程度 dam甲基化酶 修飾GATC中的A dcm甲基化酶 修飾CCA TGG的C 3 溫度 不同的限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同 大多數(shù)是37oC 少數(shù)要求40 65oC 是影響限制酶活性的重要因素 4 緩沖液 Buffer 商品化的限制酶一般都帶有專(zhuān)用緩沖液 MgCl2 NaCl KCl 提供Mg2 和離子強(qiáng)度 Tris HCl 維持pH 二硫蘇糖醇 DTT 保持酶穩(wěn)定性 牛血清白蛋白BSA等 有助于酶的穩(wěn)定 巰基乙醇 保持酶的穩(wěn)定性 防止酶失活 用時(shí)在冰上操作 取酶用干燥 滅菌 新的槍頭酶用量不能超過(guò)酶切總體積的10 多種酶進(jìn)行酶切時(shí) 先低鹽后高鹽緩沖液 關(guān)心小貼士告訴你 使用時(shí)注意事項(xiàng) 連接 轉(zhuǎn)化與重組子鑒定 1 連接 1 必須是兩條雙鏈DNA 2 DNA3 端有游離的 OH 5 端有一個(gè)磷酸基團(tuán) P 3 需要能量 動(dòng)物或噬菌體中 ATP大腸桿菌中 NAD 2 連接條件 ATP 反復(fù)凍熔 ATP活性降低 ATP溶解度不高 連接緩沖液宜分裝 單價(jià)離子 150 200mMNaCl 提高連接效果 PEG 5 以下可以提高連接效率 連接效果最好在37 但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定 最佳連接溫度 12 16 較好的連接效果 互補(bǔ)又較穩(wěn)定 2 連接溫度 3 反應(yīng)液中的成分 目的或作用 4 插入片段與載體的濃度比例 載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1 3左右 甚至1 10或更高 增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì) 減少載體自我連接的現(xiàn)象 化學(xué)法 CaCl2法 轉(zhuǎn)化原理 是Ca2 與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu) 后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用 使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙 質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 感受態(tài)細(xì)胞 2 轉(zhuǎn)化 影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素 載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象 超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高 插入片段的大小 插入片段越大 轉(zhuǎn)化效率越低 受體細(xì)胞的類(lèi)型及預(yù)處理 轉(zhuǎn)化方法 電擊法高于化學(xué)法 限制性酶切圖譜法 3 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù) 并表達(dá)所攜帶的遺傳信息 質(zhì)粒 Plasmid 是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子 大小從1 200kb不等 為雙鏈 閉環(huán)的DNA分子 并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中 質(zhì)粒DNA提取方法 堿裂解法 煮沸法 SDS法等 堿裂解法原理 在堿性條件下 雙連DNA氫鍵斷裂 結(jié)構(gòu)破壞變性 環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性 在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來(lái)構(gòu)型 而線(xiàn)性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去 抽提出質(zhì)粒的構(gòu)型 1 超螺旋質(zhì)粒DNA 在提取質(zhì)粒過(guò)程中 超螺旋DNA占大部分 2 開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA 如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力 形成松馳型的環(huán)狀分子 稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA 3 線(xiàn)狀質(zhì)粒DNA 如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂 則形成線(xiàn)狀DNA 抽提出的質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳結(jié)果 凝膠電泳技術(shù) 電泳目的 對(duì)核酸分子進(jìn)行分離和檢測(cè) 凝膠分辨DNA的能力 凝膠濃度 濃度大 篩孔小 適合小分子電泳 濃度小 篩孔大 適合大分子電泳 凝膠濃度的選擇 取決于待檢測(cè)的DNA的大小 原來(lái)如此 電泳緩沖液 pH值 偏堿性 帶負(fù)電荷 離子濃度 離子濃度高 電流大 發(fā)熱快 膠溶解 種類(lèi) TAE Tris EDTA 醋酸 電流大 易產(chǎn)生離子富集TBE Tris EDTA 硼酸 緩沖能力最強(qiáng)TPE Tris EDTA 磷酸 緩沖能力低TNE Tris EDTA 醋酸鈉 pET表達(dá)載體 pET表達(dá)載體的啟動(dòng)子是T7噬菌體基因10啟動(dòng)子 T7啟動(dòng)子 需要T7RNA聚合酶才能轉(zhuǎn)錄 T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制十分有效并具有選擇性 充分誘導(dǎo)時(shí) 幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白 在非誘導(dǎo)條件下 幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉(zhuǎn)錄 T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動(dòng)子控制 DE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上 T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是l噬菌體的衍生株 一段含有l(wèi)acI lacUV5啟動(dòng)子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌 調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型 類(lèi)似于Lac表達(dá)系統(tǒng) T7RNA聚合酶基因 lac啟動(dòng)子 E Coli DE3 IPTG誘導(dǎo) BL21 lon ompTBL21 DE3 T7polymeraseRosetta optimalcodonsOrigami thioredoxinreductase trxB glutathionereductase gor Rosetta gamiOrigamiB IPTGconcentrationdependent 菌株種類(lèi) 基本原理 SDS PAGE技術(shù)是根據(jù)SDS能使蛋白質(zhì)變性解聚成肽鏈并與肽鏈側(cè)鏈以一定比例結(jié)合成SDS 肽鏈復(fù)合體 從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷 SDS帶負(fù)電 并消除了蛋白質(zhì)分子間的形狀差異 再結(jié)合PAGE技術(shù) 根據(jù)分子的形狀 電荷 分子量綜合差異來(lái)分離不同分子的技術(shù) 來(lái)分離不同分子量蛋白質(zhì)或測(cè)定定蛋白質(zhì)分子量的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 基本步驟 制備分離膠制備濃縮膠上樣并電泳凝膠板剝離與染色脫色結(jié)果分析 加入分離膠溶液pH8 8 制備分離膠 封水的目的是使分離膠上表面平直 并排除氣泡 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面 分離膠pH8 8 制備濃縮膠 濃縮膠pH6 8 分離膠pH8 8 上樣及電泳 開(kāi)始電壓恒定在80V 當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為120V 溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí) 停止電泳 凝膠板剝離與染色 電泳結(jié)束后 撬開(kāi)玻璃板 將凝膠做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi) 加入染色液 染色1 2小時(shí)左右 脫色 染色后的凝膠用蒸餾水漂洗數(shù)次 再用脫色液脫色 直到