CE-SDS與SEC-HPLC比較

CE-SDS(非還原）與SEC-HPLC方法比較,報告人：袁梵雨、謝敏、婁昆、陳小龍,CE-SDS(非還原法）,原理簡介：,毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道。毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠，此時凝膠會在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細(xì)管內(nèi)移動速度不同而進(jìn)行分離，能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。,CE-SDS(非還原）,儀器組成,毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)包括進(jìn)樣、填灌/清洗、電流回路、毛細(xì)管/溫度控制、檢測/記錄/數(shù)據(jù)處理等部分。,CE-SDS(非還原）,檢測器,CE-SDS(非還原）,進(jìn)樣方式,1.流體力學(xué)進(jìn)樣方式（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣,進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；nL級、非常小；,2.電動進(jìn)樣方式毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓。,3.擴(kuò)散進(jìn)樣試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。,CE-SDS(非還原）,工作電壓的確定,1、在電泳條件下，改變電壓（或電流）測定對應(yīng)的電流（或電壓）2、做電壓電流曲線3、取線性關(guān)系中的最大電壓（或電流），作為分離電壓（或電流）。線性以上的電壓，焦耳熱效應(yīng)過大，一般不宜選用。但如果分離效率很高，就可以選用，以便加快分離速度。在做CGE時，電場強(qiáng)度應(yīng)控制在150400V/cm之間，否則容易導(dǎo)致凝膠的破壞。,電泳溫度的選擇,電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)性控制、分離效率控制盒分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。多數(shù)情況下，在2030之間進(jìn)行電泳，就能獲得良好的分離結(jié)果。,各試劑的作用,SDS-MWSampleBuffer：由于蛋白是兩性的，與SDS結(jié)合會使蛋白帶負(fù)電荷，使其在毛細(xì)管中往正極方向移動。內(nèi)參蛋白溶液：指示遷移時間的變化。碘乙酰胺：與游離巰基反應(yīng)，防止其攻擊二硫鍵導(dǎo)致片段增多。,樣品處理：,在1.5mL離心管中加入SDS-MWSampleBuffer50L，內(nèi)參蛋白溶液2L，碘乙酰胺溶液10L振蕩混勻。取供試品溶液（2.5mg/L）40L，振蕩混勻。將離心管置于70水浴加熱10min，再次振蕩混勻，室溫冷卻。3000rpm離心60s，取上清液90L至PCR管中。,CE-SDS(非還原）,2010版中國藥典對儀器的一般要求：,毛細(xì)管：彈性石英毛細(xì)管，內(nèi)徑50m和75m使用較多。根據(jù)分離度要求，可選用20cm-100cm長度。,CE-SDS(非還原）,直流高壓電源：采用0-30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300A電流。具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。,沖洗進(jìn)樣系統(tǒng)：每次進(jìn)樣之前毛細(xì)管要用不同溶液沖洗。進(jìn)樣方式有壓力進(jìn)樣，負(fù)壓進(jìn)樣，虹吸進(jìn)樣和電動進(jìn)樣。通過控制壓力或電壓及時間來控制進(jìn)樣量。,檢測系統(tǒng)：將毛細(xì)管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)?mm一段，使石英壁裸露，毛細(xì)管一側(cè)放置一個石英聚光球，使光源聚集在毛細(xì)管上，透過毛細(xì)管達(dá)到光電池。對無光吸收或熒光的溶質(zhì)的檢測，還可采用間接測定法，即在操作緩沖液中加入對光有吸收或熒光的添加劑，在溶質(zhì)到達(dá)檢測窗口時出現(xiàn)反方向的峰。,對電泳實(shí)驗(yàn)的影響因素,緩沖液pH：pH能影響樣品的解離能力，樣品在極性強(qiáng)的介質(zhì)中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。,CE-SDS(非還原）,分離電壓：,溫度：溫度影響分離重現(xiàn)性和分離效率。溫度升高，緩沖液粘度降低，分析時間減短，分析效率提高。但溫度過高，會引起毛細(xì)管柱內(nèi)徑向溫差增大，焦耳熱效應(yīng)增強(qiáng)，柱效降低，分離效率也會降低。,SEC-HPLC,體積排阻色譜(SEC)是利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來分離的液相色譜方法。,簡介：,分離機(jī)理：,固定相是多孔性凝膠，大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被洗脫出來；中等大小的分子能進(jìn)入凝膠中一些適當(dāng)?shù)目锥粗?，但不能進(jìn)入更小的微孔，在柱中受到滯留，較慢地被洗脫出來；小分子可進(jìn)入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強(qiáng)的滯留，會更慢地被洗脫出。,圖示,儀器：高效液相色譜儀需定期檢定，周期為1年。,SEC-HPLC,2010版中國藥典對儀器的一般要求和色譜條件,色譜柱：多使用凝膠或親水剛性、多孔微球、機(jī)械強(qiáng)度好的聚合物等填充物使用水或緩沖鹽作為流動相，流動相的pH值一般控制在28之間。流速一般在0.51.0ml/min,檢測器：常用UV（紫外-可見）檢測器，檢測波長通常為280nm。,SEC-HPLC,柱效率N：色譜柱的效率可借用“理論塔板數(shù)”N進(jìn)行描述。,分離度R：判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況,常作為柱的總分離效能指標(biāo)。,式中，tR1，tR2分別為對應(yīng)于峰1和峰2的保留時間；W1，W2分別為峰1和峰2的峰底寬,色譜柱性能評價的兩個重要參數(shù),N=16(tR/W)2=5.54(tR/W1/2)2,tR為保留時間；W代表峰寬；W1/2：半高峰寬，通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離。,R=2(tR2-tR1)/(W1+W2),SEC-HPLC,色譜柱填料的孔徑大小及其粒徑分布均勻性孔徑太小，待測物不易流出，分析時間長，展寬嚴(yán)重?？讖教髣t很可能導(dǎo)致組分分不開。在做凝膠色譜時，先大致估計下待分析物的分子量，然后選擇合適的柱子，如果不知道粒徑，可先用大孔徑的先試試，接著再用小粒徑的以達(dá)到更高的精度。,流動相,凝膠色譜中流動相的影響不像別的色譜（如反相or離子色譜)那么明顯。其中主要影響的是流動相的流速，一般流速越大，出峰越快，但分離效果可能不是很好。,色譜柱高度和直徑,色譜柱越長，樣品組分分的越開，但過長時會消耗太多的溶劑，而且柱展寬等也容易變的嚴(yán)重。色譜柱直徑太大時，樣品沿徑向的分布容易不均勻，容易出現(xiàn)柱中心處比柱四周跑的快，從而增加了展寬。,影響色譜分離因素,兩種檢測方法的結(jié)果評定,抗體結(jié)構(gòu),IgG,HL,HH,HHL,LC,HC,HMW(11.9%),HMW(7.4%),HMW（0.9%）,兩種方法例證比較,SEC-HPLC,示例圖如下,CE-SDS,DP(40，30天)_GB232-20121102DP(40，20天)_GB232-20121102DP(40，10天)_GB232-20121102DP_GB232-20121102,HMW,LMW,總結(jié)：,優(yōu)勢,不足,分子尺寸相同的混合物（如同分異構(gòu)體的混合物）不易分開。,優(yōu)勢與不足,操作簡便快捷、數(shù)據(jù)可靠且重現(xiàn)性