第三節(jié)免疫檢測技術的基本原理 教育學習

第三節(jié)免疫檢測技術的基本原理,抗原、抗體反應的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原.將免疫反應與現(xiàn)代測試技術結合超微量的檢測,1,優(yōu)質課件,2,優(yōu)質課件,免疫學檢測技術的優(yōu)點,高度的靈敏性高度的特異性,3,優(yōu)質課件,免疫分析技術的應用,常用的診斷技術血凝試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗膠體金免疫技術放射免疫分析技術,4,優(yōu)質課件,凝集試驗,概念：顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應。1.直接凝集反應抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽性結果。玻片直接凝集法：定性試驗試管直接凝集法：半定量試驗,5,優(yōu)質課件,試管法半定量試驗,6,優(yōu)質課件,2.間接凝集法,先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上(如RBC,乳膠顆粒)，再與相應抗體或抗原反應，出現(xiàn)凝集為陽性結果。臨床常用的有間接血凝試驗、乳膠凝集試驗等。,待檢樣品,抗原吸附血球或乳膠顆粒,反應凝集物,7,優(yōu)質課件,3.間接凝集抑制試驗,先將待檢抗原與已知的抗體反應，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結果。,例：乳膠凝集抑制試驗檢測HCG(妊娠診斷),步驟1：將已知抗體與待檢標本混勻,步驟2：加入抗原吸附的乳膠顆?；靹?抗原吸附乳膠顆粒,結果判斷：,不凝集為陽性結果,已知抗體,待檢標本,8,優(yōu)質課件,凝集反應,9,優(yōu)質課件,2.沉淀反應,概念：可溶性抗原與相應抗體結合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應。,類型：單向免疫擴散,免疫比濁法,雙向免疫擴散,對流免疫電泳,10,優(yōu)質課件,單向瓊脂擴散試驗,11,優(yōu)質課件,雙向瓊脂擴散試驗,12,優(yōu)質課件,對流免疫電泳,13,優(yōu)質課件,測吸光度計算抗原或抗體的含量,抗體,抗原,免疫復合物的濃度與透射光的衰減呈正相關,免疫比濁法原理,14,優(yōu)質課件,3.中和反應如抗“O”試驗,4.免疫標記技術,概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原用以測定相應抗原或抗體的技術稱為免疫標記技術。常用方法有免疫熒光技術、酶免疫技術、放射免疫檢測技術等。特點：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。,15,優(yōu)質課件,免疫標記技術,酶免疫標記技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術免疫金標記技術,16,優(yōu)質課件,酶聯(lián)免疫吸附試驗,1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),17,優(yōu)質課件,酶及其底物酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應.,18,優(yōu)質課件,19,優(yōu)質課件,2、標記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法,20,優(yōu)質課件,戊二醛交聯(lián)法(一步法）,抗體-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體,酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,21,優(yōu)質課件,戊二醛交聯(lián)法（二步法）,COH-（CH2）3-COH+NH2-酶,抗體-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,22,優(yōu)質課件,過碘酸鹽氧化法,NaIO4,O,O,OH,+NH2抗體,O,O,O,N,N,抗體,抗體,H2O,N,抗體,NaBH4,Schiff堿,酶-五炭糖環(huán),23,優(yōu)質課件,標記免疫物的分離與鑒定,1、分離目的：去除游離酶方法：鹽析、柱層析2、鑒定抗體活性酶活性標記物純度,24,優(yōu)質課件,ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA,25,優(yōu)質課件,26,優(yōu)質課件,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,27,優(yōu)質課件,獲得待分析物的未標定抗體,將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結合的抗體及雜質,加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結合位點,洗滌并除去未結合的封閉蛋白,加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復合物,洗滌除去其他未結合的物質,加酶標抗體生成抗體待測抗原酶標記抗體的復合物,徹底洗滌未結合的酶標抗體,加底物進行酶催化反應,根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定,28,優(yōu)質課件,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,29,優(yōu)質課件,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA-間接法),30,優(yōu)質課件,包被固相載體:用已知抗原包被固相載體,加待檢標本:使相應抗體與固相抗原結合洗滌，除去無關的物質,加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結合；洗滌，除去未結合的酶標抗抗體,加底物顯色,根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量測定,31,優(yōu)質課件,（三）競爭法,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。,32,優(yōu)質課件,用已知特異性抗體包被固相載體,測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結合,對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合,分別洗滌除去未結合的成分,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值，根據對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量,33,優(yōu)質課件,對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。,34,優(yōu)質課件,飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）,甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析,ELISA在飼料安全檢測中的應用,ELISA用于農藥殘留的檢測,35,優(yōu)質課件,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。,農藥的檢測：,36,優(yōu)質課件,食源性病原菌檢測試劑盒,大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡萄球菌,37,優(yōu)質課件,轉基因成份的檢測：如轉基因玉米中中的cry9e蛋白轉基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質肉制品的摻假檢測：以辣根過氧化物酶標記不同動物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為1%時即可檢出,食品其他檢測：,38,優(yōu)質課件,熒光抗體技術的原理與方法,用熒光素標記抗原或抗體，再與標本中抗體或抗原反應，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的IC可散發(fā)出熒光，對標本中的抗原或抗體進行測定和定位。常用的熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。常用的方法直接熒光法間接熒光法,39,優(yōu)質課件,免疫熒光技術,40,優(yōu)質課件,免疫熒光技術直接法,41,優(yōu)質課件,免疫熒光技術間接法,42,優(yōu)質課件,免疫熒光技術,43,優(yōu)質課件,熒光顯微鏡,44,優(yōu)質課件,熒光顯微鏡使用原理,激發(fā)濾片（BG）,吸收濾片（OG）,標本,FITC吸收光峰值：490-495nmFITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650,45,優(yōu)質課件,免疫金標記技術,免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。,46,優(yōu)質課件,一、膠體金制備,膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。,47,優(yōu)質課件,膠體金的制備及特性,*還原100ml0.01%HAuCl4所需量,48,優(yōu)質課件,膠體金（ColloidalGold）1560nm,優(yōu)質,劣質,49,優(yōu)質課件,膠體金結合物（Conjugate）,50,優(yōu)質課件,一、免疫滲濾測定(IFA),51,優(yōu)質課件,斑點滲漏法,其原理與層析法相類同，中心圓點為一株單抗，邊上小點為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結合在中心圓點，洗去未結合抗原，再滴加金標另一株單抗，若有抗原則形成金-Ab-Ag薄膜的紅色斑點，而邊上是金-Ab-Ab2薄膜的質控點，是為金標二步法。,52,優(yōu)質課件,IFA雙抗體夾心法測抗原,53,優(yōu)質課件,IFA結果判斷,54,優(yōu)質課件,二、免疫層析測定（ICA）,55,優(yōu)質課件,層析法,將金標的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應抗原，既形成Ag-Ab-金復合物，當上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結合并被固定下來，顯示陽性結果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標單抗上行此處即被固定下來，作為金標單抗質控的提示。此種方法稱金標一步法。,56,優(yōu)質課件,兔抗鼠IgG,鼠抗HCG單抗,金標鼠抗HCG單抗,尿液浸濕標志線,手持端,斑點金免疫層析試驗（一）,57,優(yōu)質課件,斑點金免疫層析試驗（二）,尿樣,陽性,弱陽性,陰性,無效,質控線,測試線,58,優(yōu)質課件,ICA雙抗體夾心法測抗原,59,優(yōu)質課件,ICA-競爭法測抗原,免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖,60,優(yōu)質課件,ICA竟爭法結果觀察,陰性,陽性,無效,61,優(yōu)質課件,ICA間接法測抗體,62,優(yōu)質課件,ICA結果觀察,陽性,陰性,無效,63,優(yōu)質課件,IFA與ICA的比較,64,優(yōu)質課件,IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）,65,優(yōu)質課件,1、羅立新,繆瓏,潘力,等.快速檢測產單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究J.中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(2):154-156.2、賴衛(wèi)華,熊勇華,陳高明,等.應用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究J.食品科學,2005,26(5):204-207.,66,優(yōu)質課件,3、諶志強,段惠莉,王新為,等.大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測J.中國公共衛(wèi)生,2005,21(4):705-706.4、謝昭聰,宋志強,呂敬章,等.應用膠體金免疫層析法檢測水產品中霍亂弧菌的研究J.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2005,28(3):163-165.,67,優(yōu)質課件,5、王中民,李君文,王新為,等.免疫金滲濾試驗檢測食品中沙門氏菌的研究J.微生物學免疫學進展,2001,29(4):45-47.6、劉永德,汪毅,陳禹雷,免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究J.上海交通大學學報:農業(yè)科學版,2005,23(3):321-324.,68,優(yōu)質課件,斑點金免疫滲濾試驗,A,D,C,B,陰性（未懷孕）,陽性（懷孕）,加尿樣,除去濾器,加膠體金標記抗體,加洗滌液,結果判定,69,優(yōu)質課件,免疫印跡法圖解,SDS裂解病毒,聚丙酰胺凝膠電泳,-,+,95684512KD,電轉印至NC膜上,置待測血清中，漂洗；加酶標抗抗體，漂洗；,加底物顯色,1204124KD,70,優(yōu)質課件,第四節(jié)放射性核素標記技術,一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化,71,優(yōu)質課件,R：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物，而探測待測物上的標記信號(標記物的放大效應)I：免疫學反應高特異廢除以往沿用的無機或有機試劑，代之以抗體為結合劑,72,優(yōu)質課件,常用標記方法,1、常用放射性核素2、125I的標記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）,73,優(yōu)質課件,直接法（氯胺T法）,Na125I4。C,125I,氯胺T,74,優(yōu)質課件,間接法（連接法）,+Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,75,優(yōu)質課件,間接法（連接法）,CH2,OH,H-C-C-N-蛋白質,HOH,+NH2-蛋白質,125I,125I,76,優(yōu)質課件,標記免疫物的分離與鑒定,1、分離目的：去除游離放射性核素方法：柱層析2、鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）,77,優(yōu)質課件,結合相,游離相,放射免疫分析法的原理與方法,78,優(yōu)質課件,液閃儀,79,優(yōu)質課件,計數(shù)器,80,優(yōu)質課件,化學發(fā)光標記免疫技術,直接化學發(fā)光酶促化學發(fā)光特點電化學發(fā)光特點,81,優(yōu)質課件,標記免疫分析三方式與四環(huán)節(jié),三個方式A、直接法B、間接法C、夾心法四環(huán)節(jié)為：1、抗體生產2、標記