HIV核酸檢測技術(shù)2014.ppt

HIV核酸檢測及嬰幼兒診斷,HIV核酸檢測的意義,早期診斷嬰兒的早期診斷：HIV感染母親所生小于18個月齡的嬰兒，不同時間的兩次HIV核酸檢測均為陽性即可作出診斷。18個月齡以上兒童診斷與成人相同：有急性HIV感染綜合癥或流行病學(xué)史，且不同時間的兩次HIV核酸檢測結(jié)果均為陽性，即可診斷。也可使用多樣品集合的方法，對采供血機構(gòu)的原料血漿以及HIV抗體陰性的高危人群樣品進行集合核酸檢測，及時發(fā)現(xiàn)窗口期感染，降低“殘余危險度”，減少二代傳播。,疑難樣本的輔助診斷在一般情況下，HIV抗體檢測足以對HIV感染與否做出正確診斷，但在特殊情況下，單純HIV抗體檢測結(jié)果不能進行明確的診斷，如在感染早期或疾病終末期出現(xiàn)抗體不確定反應(yīng)時，RNA的測定結(jié)果可幫助提供HIV感染早期或終末期的證據(jù)。由于試劑的靈敏度、接受有效的抗病毒治療后以及存在長期低水平病毒的少數(shù)感染者等原因，應(yīng)對其它檢測數(shù)據(jù)和樣品背景情況進行綜合判斷。,遺傳變異監(jiān)測可用于HIV分子流行病學(xué)監(jiān)測，包括HIV-1和HIV-2感染的鑒別診斷、HIV感染傳播鏈的分析、HIV基因亞型和重組病毒的鑒定和分析以及人群HIV遺傳變異趨勢的監(jiān)測,耐藥性監(jiān)測可用于HIV耐藥檢測和監(jiān)測，指導(dǎo)公共衛(wèi)生醫(yī)生了解耐藥性病毒株流行的態(tài)勢和指導(dǎo)臨床醫(yī)生判斷抗病毒治療效果和修改抗病毒治療方案。,病程監(jiān)控及預(yù)測HIV感染發(fā)生后病毒載量變化具有一定規(guī)律，這種變化與疾病的進程有著密切的相關(guān)性。因此定期進行病毒載量檢測有助于確定疾病發(fā)展的階段，以確定相應(yīng)的治療方案,指導(dǎo)抗病毒治療及療效判定通常在病毒載量達到一定水平后（如35，00050，000c/ml）抗病毒治療才顯示良好的治療效果。治療后，通過病毒水平的檢測能夠確定治療是否有效。通常在治療6個月后病毒水平降低0.5log以上才被認為臨床有效。,樣本采集原則,樣品恰當(dāng)?shù)牟杉?、保存和運送是所有檢測需要考慮的很重要的一部分。樣品的采集和保存時，要使用無菌技術(shù)，包括消毒管、吸頭和試劑及工作環(huán)境都要防止樣品污染。,樣品的采集,艾滋病檢測最常用的樣品是血液，包括血清、血漿和全血。病毒載量通常不使用全血。血清的檢測結(jié)果大約是血漿的50（3080），可能是因為HIV病毒顆粒被包裹在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中,血漿中RNA量比血清中高并穩(wěn)定。全血中病毒載量非常不穩(wěn)定。EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝素對PCR擴增有抑制作用。（用ACD抗凝的樣品檢測結(jié)果大約會比EDTA抗凝的樣本低15)采集的樣品應(yīng)在48小時以內(nèi)分離血漿。,樣品的保存,用于核酸檢測的血漿和血細胞樣品應(yīng)凍存于20以下，進行病毒RNA檢測的樣品如長期（3個月以上）保存應(yīng)置于80或液氮里。,樣品的運送,病毒載量測定的樣品應(yīng)為血漿，樣品應(yīng)置于帶螺旋蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明顯的標記，標明樣品的編號或受檢者姓名、種類和采集時間。隨樣品應(yīng)附有送檢單，送檢單應(yīng)與標本分開，不能混放。在冷凍條件下運送，每一包裝的體積不得超過50ml。,實驗室設(shè)置原則,明確實驗室的設(shè)置原則和工作流程設(shè)計，最終目的是為避免實驗室污染。明確實驗室設(shè)置和工作流程中好的和不好的實例。明確我們當(dāng)前實驗室設(shè)置中，為避免實驗室污染有必要進行的整改。,要點：,各區(qū)必須是相互獨立的，有條件各區(qū)內(nèi)分別設(shè)置緩沖間，以保證不同區(qū)之間始終完全分開。各區(qū)的儀器設(shè)備以及各種物品必須專用。試劑準備區(qū)和樣品處理區(qū)科保持低度正壓或常壓，是空氣始終由室內(nèi)流向室外，以避免擴增物進入此區(qū)。擴增產(chǎn)物分析區(qū)保持低度負壓，可安裝排風(fēng)扇或其他排風(fēng)裝置。也可以設(shè)在遠離其他各區(qū)的地方。工作時必須遵循單一工作流向進行，工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)(簡稱擴增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)。清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。,三實驗室布局實例(備選1),實驗室2,實驗室3“擴增后Lab電泳分析、測序反應(yīng),和毛細管電泳,實驗室1“樣品處理Lab樣品接受儲存MastermixpreparationRNA提取和第一輪PCR反應(yīng)混合,“擴增Lab第一輪擴增2ndroundPCRset-up第二輪擴增在密閉箱中以專用加樣器操作,樣品FrozenplasmaWholebloodDBS,13,PCR工作站(Dead-airCabinets),15,三實驗室布局(備選2A),實驗室2“樣品處理和PCRLab樣品接收儲存提取和第一輪PCR反應(yīng)混合,樣品FrozenplasmaWholebloodDBS,1stroundamplification2ndroundPCRset-up實驗室1,“無模板Lab試劑儲存主反應(yīng)混合物制備,實驗室3“擴增后Lab第二輪擴增、電泳分析、測序反應(yīng)和毛細管電泳,在密閉箱中以專用加樣器操作,16,三實驗室布局(備選2B),實驗室3“擴增后Lab1stroundamplification2ndroundPCRset-up,第二輪擴增、電泳分析、測序反應(yīng)和毛細管電泳如果不需進行nestedPCR，備選2B更理想,樣品FrozenplasmaWholebloodDBS實驗室1“無模板Lab試劑儲存主反應(yīng)混合物制備,實驗室2“樣品處理和PCRLab樣品接收儲存提取和第一輪PCR反應(yīng)混合,在密閉箱中以專用加樣器操作,試劑配制,只能在規(guī)定區(qū)域完成，配制完后，試劑必須及時放回存放區(qū)。,核酸提取,在規(guī)定區(qū)域完成保證無菌、實驗材料無菌并一次性使用保證無核酸酶污染,加樣和擴增,只能在規(guī)定區(qū)域完成，加完后蓋緊蓋子并作好標記。操作超過10分鐘時應(yīng)將反應(yīng)管置于冰盒內(nèi)。擴增儀預(yù)熱不少于20分鐘,擴增產(chǎn)物分析,酶切、電泳、雜交等，在產(chǎn)物分析區(qū)完成定量檢測通常采用商用系統(tǒng)。,結(jié)果判定和報告,定性檢測：HIV核酸檢測陰性，只能報告本次實驗結(jié)果陰性，不排除感染可能。HIV核酸檢測陽性，可作為感染的輔助診斷指標，不單獨用于感染的診斷。報告結(jié)果是應(yīng)注明反應(yīng)條件和引物序列。,定量檢測按照讀數(shù)報告結(jié)果，應(yīng)注明使用的方法、樣品種類和樣品量。測定結(jié)果低于最低檢測限時，應(yīng)注明最低檢測限水平。低于最低檢測的結(jié)果不能排除HIV感染。應(yīng)附上儀器打印的數(shù)據(jù)。,2020/5/26,28,常用的病毒載量測定方法,分枝DNA信號放大系統(tǒng)HIV-1Quantiplex(bDNA)逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)AmplicorHIV-1Monitor（RT-PCR）核酸序列擴增系統(tǒng)NucliSensHIV-1QT（NASBA）,2020/5/26,29,各種HIV定量檢測方法的比較,2020/5/26,30,關(guān)于不同HIV定量檢測方法的選擇,目前用于統(tǒng)一不同定量方法檢測值的標準品還沒有問世不同定量方法結(jié)果之間還無法直接比較同一病人治療前后建議用同一方法進行HIV定量檢測,2020/5/26,31,提高敏感性的方法增加標本用量，例如從500l血漿增加到1ml離心沉淀病毒顆粒，離心時間從60min延長到80minat23,600 xg減少內(nèi)部定量標準的體積，例如從25l減少到6.6lperlysisvial減少沉淀的病毒重懸的體積，例如從100l減少到55l加底物孵育時間延長1015min,2020/5/26,32,假陽性(FalsePositive)控制污染物理隔離PCR前后的反應(yīng)器械專用（加樣器、吸頭、離心機、離心管、手套、工作服、筆）分裝試劑陽性和陰性對照最近的進展防氣溶膠吸頭半自動操作封閉試管系統(tǒng)（實時PCR）全自動（樣品處理擴增檢測）,2020/5/26,33,假陰性(FalseNegative)原因序列變異丟失核酸樣本核酸樣品被消化抑制DNA聚合酶的活性預(yù)防避免肝素、血紅蛋白、乙醇、酚、SDS使用合適的提取技術(shù)檢測陽性對照內(nèi)部對照,選擇病毒載量檢測的注意事項,方法的線性范圍、特異性、重復(fù)性、對不同亞型的檢測性能檢測試劑和耗材等消耗品對人員和實驗室的要求、可操作性樣本的運輸、保存、樣品量質(zhì)量控制：污染控制、室內(nèi)控制和室間控制自動化操作程度檢測時間,病毒載量測定的基本要求,儀器需要按公司要求的進行定期維護加樣器的校準水浴箱的溫度校準實驗室的處理檢測實驗室的分區(qū),嬰幼兒HIV感染核酸檢測,HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒在出生后18個月內(nèi)可應(yīng)用HIV核酸（DNA或RNA）檢測進行早期HIV感染診斷。盡管HIVRNA檢測敏感性在感染早期較高（出生后1個月內(nèi)），但是HIVDNA檢測不受母親圍產(chǎn)期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及嬰幼兒預(yù)防性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的干擾而影響早期診斷。另外，考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進行HIV核酸檢測。,適用范圍,未滿18個月的HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；未滿18個月的嬰幼兒，其母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染者,檢測程序及結(jié)果報告,濾紙片載體及其特性（1）,作為血液載體，濾紙應(yīng)具備極強的吸水性、厚度均一、液體流速一致、純度高、沒有污染、FDA在冊，據(jù)不同的檢測需求選擇不同類型的濾紙。,濾紙干血斑樣本特點（1）,需要樣本量少，僅50-100l；易采集，末梢血即可，適用嬰兒和靜脈采血困難者；樣本安全，生物危險性低，費用低廉的運輸方式，可直接郵寄，被IATA歸入最低危險水平；室溫保存減少了保存費用，密封袋中加干燥劑和濕度指示劑.,濾紙片載體及其特性（2）,*903濾紙上的樣本可在-20長期保存，蛋白的保存時間依據(jù)特異蛋白特性，見后。,濾紙片干血斑作為一種有效載體在HIV檢測中具有非常重要的作用,定性檢測HIV抗體定量檢測HIV的病毒載量HIV耐藥性檢測HIV新發(fā)感染的檢測快速檢測的一種質(zhì)控手段定性檢測前病毒DNA,嬰幼兒早期診斷,HIV耐藥檢測,抗病毒治療的效果：大幅度降低病毒載量提升CD4細胞數(shù)改善癥狀，延長生存期。,抗病毒治療存在問題：毒副作用大患者依從性差耐藥性毒株的出現(xiàn),什么是HIV耐藥性？,HIV耐藥性是指病毒通過自身的遺傳變異，產(chǎn)生對藥物抑制作用敏感性降低或不敏感的現(xiàn)象。,AvailableAntiretroviralAgents,NucleosideAnalogsAZT,zidovudine,RetrovirddI,didanosine,VidexECddC,zalcitabine,Hividd4T,stavudine,Zerit3TC,lamivudine,Epivirabacavir,ZiagenFTC,emtricitabine,EmtrivaNucleotideAnalogstenofovir,VireadNonNucleosideRTinhibitorsdelavirdine,Rescriptornevirapine,Viramuneefavirenz,Sustivaetravirine,Intelence,ProteaseInhibitors13.indinavir,Crixivan+/-r14.saquinavirInvirase+r15.ritonavir,Norvir16.nelfinavir,Viracept17.lopinavir+r,Kaletra18.atazanavir,Reyataz+/-r19.fos-amprenavir,Lexiva+/-r20.tipranavir,Aptivus+r21.darunavir,Prezista+rFusionEntryInhibitors22.enfuvirtide,FuzeonCCR5Entryinhibitors23.maraviroc,SelzentryIntegraseinhibitors24.raltegravir,Isentress,藥物的作用機制,核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：被靶細胞的細胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式與天然三磷酸競爭，從而參與病毒DNA的合成，由于該抑制劑經(jīng)化學(xué)修飾，將導(dǎo)致病毒DNA鏈合成終止。,藥物的作用機制,非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：是一組結(jié)構(gòu)多樣化的化合物，通過非競爭性的方式結(jié)合于或者接近于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性位點，從而抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。,藥物的作用機制,蛋白酶抑制劑：肽類似物，通過結(jié)合于病毒蛋白酶的活性位點來抑制酶的活性，使之不能將病毒合成的多聚前體蛋白水解為病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和酶的組成部分。,耐藥性是怎么產(chǎn)生的？,一、病毒本身的因素內(nèi)因1.1HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在復(fù)制過程中，病毒核酸表現(xiàn)出高度的錯誤傾向性。1.2在病毒的高速復(fù)制過程中，高頻率突變在很短的時間內(nèi)隨時發(fā)生,耐藥性是怎么產(chǎn)生的？,二、藥物的選擇壓力外因1.1在藥物選擇的壓力下，耐藥變異株完全取代藥物敏感株最快能發(fā)生在14至28天內(nèi)。1.2耐藥株是在病毒自發(fā)的、高頻率的基因突變中產(chǎn)生的，在藥物選擇性的壓力下優(yōu)勢復(fù)制的結(jié)果。,哪些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)？,1.病毒載量2.服藥的依從性3.藥物的配伍不當(dāng)4.其他因素：胃腸道吸收不好，隨意間歇服藥，與中藥或其他藥物同時服用。,HIV-1耐藥檢測的意義,耐藥監(jiān)測用于HIV-1感染人群和抗病毒治療人群的耐藥性監(jiān)測和檢測。用于新近感染人群的耐藥性監(jiān)測，了解耐藥毒株流行的情況，并采取防控措施，用于治療前人群的監(jiān)測，指導(dǎo)制定一線抗病毒治療方案；用于抗病毒治療人群的耐藥性監(jiān)測，進行HIV-1耐藥發(fā)生、發(fā)展趨勢以及影響因素的分析，指導(dǎo)和完善大規(guī)模公共衛(wèi)生模式抗病毒治療的程序，以及制定二線治療方案。耐藥檢測用于個體患者的耐藥檢測。在抗病毒治療前進行耐藥檢測，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定抗病毒治療方案，保證抗病毒治療的效果；在抗病毒治療過程中進行耐藥檢測，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生分析治療失敗的原因，并制定補救治療方案,如何檢測耐藥株？,目前耐藥性檢測有2種方法：表型檢測和基因型檢測。表型檢測通過用藥期間的病毒培養(yǎng)進行，而基因型檢測則通過分子生物學(xué)方法檢測與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變?；蛐蜋z測的費用低，技術(shù)也相對容易，可在樣品收集后12周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測時，需要掌握大量相關(guān)知識，如突變與抗病毒藥物及其他藥物的交叉耐藥等，才能對結(jié)果進行正確的分析。表型檢測可以通過直接檢測病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國際上廣泛運用于臨床的是基因型耐藥檢測。,表型檢測方法,表型耐藥性檢測,克隆病毒RT、PR基因,分離病毒,在藥物存在的情況下培養(yǎng),計算IC50,插入含報告基因的骨架病毒,轉(zhuǎn)染細胞,在藥物存在的情況下培養(yǎng),計算IC50,改良方法,傳統(tǒng)方法,表型耐藥性檢測,優(yōu)點：直接定量測定耐藥性結(jié)果容易解釋有臨床臨界值（cut-off)可立即檢測對新藥的耐藥性缺點：操作復(fù)雜、價格昂貴、耗時長,HIV基因型耐藥性檢測,（序列測定法）,基因型檢測方法（序列測定法）,病人血漿標本,HIVRNA,病毒cDNA,HIVRT和PR基因片斷,序列測定,結(jié)果解釋,RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增,特定的解釋系統(tǒng),標本,新鮮EDTA抗凝血漿，或-80保存，避免反復(fù)凍融。,病毒RNA提取（Qiagen公司試劑盒）,裂解標本，滅活RNA酶,加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合,洗兩次，去除雜質(zhì),用無RNA酶的緩沖液洗脫RNA,收集RNA備用,優(yōu)點：操作簡便、快速、得率高,核酸擴增類試劑的操作主要步驟,核酸（DNA和RNA）的擴增擴增產(chǎn)物的檢測,HIV-1耐藥基因型解釋系統(tǒng),提供HIV-1耐藥基因型檢測數(shù)據(jù)分析和解釋系統(tǒng)（HIVDRDB）的主要機構(gòu)有：國際艾滋病協(xié)會TheInternationalAIDSSociety-USA(IAS-USA)美國斯坦福大學(xué)TheHIVDrugResistanceDatabase(StanfordUniversity)法國國家艾滋病研究署TheFrenchANRS(NationalAgencyforAIDSResearch)比利時Leuven大學(xué)Rega醫(yī)學(xué)研究所RegaInstituteforMedicalResearchinKatholiekeUniversiteitLeuven(REGA),耐藥性突變記分,高度耐藥：大于60分中度耐藥：3059分低度耐藥：1529分潛在低度耐藥：1014分敏感：09分,HIV-1耐藥性檢測的臨床指征,1.抗病毒治療病毒類失敗需要改變抗病毒治療方案時應(yīng)進行耐藥性檢測以協(xié)助選擇有效的抗病毒藥物。2.抗病毒治療病毒載量下降不理想時可進行HIV-1的耐藥性檢測。3.抗病毒治療失敗需要進行耐藥性檢測時，應(yīng)該在病人仍在服藥時或停藥后立即（4周內(nèi)）進行檢測。,HIV-1耐藥性檢測的臨床指征,4.急性HIV-1感染的病人進行抗病毒治療，最好進行耐藥性檢測，對于選擇合適的抗病毒藥物、取的最佳抗病毒效果很有益處。5.對于未經(jīng)抗病毒質(zhì)量的慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測，但當(dāng)有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒株時（例如感染來自于正在服用抗病毒藥物的病人），就應(yīng)當(dāng)進行耐藥性檢測。6.不推薦對病毒載量1000CP/ML的病人做耐藥性檢測，因為病毒水平太低很難擴增出目的基因片段。,耐藥性檢測結(jié)果的解釋,1.HIV-1的耐藥性不是全或無的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測結(jié)果的分析和解釋都有困難。2.所有的抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性。3.藥物即使有耐藥性也可能有益處，因為有耐藥性突變的病毒比敏感毒株的復(fù)制適應(yīng)性要差得多。4.血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平的蛋白酶耐藥性有時能夠被克服。,耐藥檢測在臨床中應(yīng)用,兒童HIV感染的診斷,兒童感染HIV的途徑,大部分兒童感染HIV是由母嬰傳播。宮內(nèi)經(jīng)胎盤傳染、產(chǎn)時分娩過程中創(chuàng)傷性操作和經(jīng)產(chǎn)道分泌物傳染、生后母乳喂養(yǎng)經(jīng)乳汁傳染。血液傳播,兒童艾滋病的流行病學(xué)特點,全世界已有百萬兒童感染了HIV。7590%的小兒感染的