生物藥物分析與檢驗(yàn) 第三章 免疫分析法

1、第三章 免疫分析法,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用 五、免疫擴(kuò)散法,主要內(nèi)容,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用 五、免疫擴(kuò)散法,主要內(nèi)容,免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對(duì)機(jī)體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理?yè)p傷的機(jī)制，研究有效的免疫措施，實(shí)現(xiàn)以防病，治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。,一、概述,什么叫免疫分析？ 基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)手段。抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。高選擇性和低檢出限。 在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答的

2、效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于抗原或抗體的檢測(cè)，用于免疫學(xué)診斷。,(1) 在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測(cè)定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況； (2) 在藥物的臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)； (3) 在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效組分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測(cè)； (4) 對(duì)藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。,在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：,免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)

3、合作用，來選擇性識(shí)別和測(cè)定，可以作為抗體或抗原的待測(cè)物. 免疫分析方法,免疫分析檢測(cè)的發(fā)展,放射免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)70年代),酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；,以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)（20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。,可逆性,比例性 反應(yīng)階段性,特異性,免疫分析法的特點(diǎn),特異性,特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性 分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性,可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。 影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原

4、的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度,比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系 前帶(prezone)：抗體過量 后帶(postzone)：抗原過量 等價(jià)帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用 五、免疫擴(kuò)散法,主要內(nèi)容,抗原（antigen,Ag)：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì) 抗原的兩種特性：免疫原性和抗原性（免疫反應(yīng)性） 免疫原性（immunogenicity),能刺激機(jī)體發(fā)

5、生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的能力。 免疫反應(yīng)性能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)稱為完全抗原 只有抗原性而不具有免疫原性的物質(zhì)稱為半抗原 半抗原+蛋白質(zhì)完全抗原 賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱為載體。,2.1 定義,1.抗原的免疫原性,抗原物質(zhì)必須具備的條件： 一、異物性 二、一定的理化性狀 三、完整性 四、宿主的遺傳性,一、異物性,異物是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與宿主的自身成分相異或機(jī)體的免疫細(xì)胞從未與它接觸過的物質(zhì)。異物性的物質(zhì)包括以下幾類： 1、異種物質(zhì) 如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體而言都是異種物質(zhì)，具有強(qiáng)的免疫原性。 2、同種異體物

6、質(zhì) 如：ABO血型抗原、人類主要組織相容性抗原。 3、自身抗原物質(zhì) 如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。,二、一定的理化性狀,大分子膠體物質(zhì) 凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量都較大，一般在10kDa以上,在一定范圍內(nèi),分子量越大免疫原性越強(qiáng)。 一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu) 從化學(xué)組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質(zhì)，其免疫原性較強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜其免疫原性越強(qiáng)。 分子構(gòu)象與易接近性 分子構(gòu)象是指抗原分子中一些特殊化學(xué)基團(tuán)的三維結(jié)構(gòu)，它決定抗原分子是否能與淋巴細(xì)胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學(xué)基團(tuán)與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)的抗原受體相互接觸的難易

7、程度。,三、完整性,具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細(xì)胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。 自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多糖、核蛋白,四、宿主遺傳性,抗原的免疫原性也與機(jī)體的應(yīng)答能力有關(guān)，同種動(dòng)物不同個(gè)體對(duì)同一種抗原的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應(yīng)答的基因稱為免疫應(yīng)答基因（immune response, Ir)。,2.抗原的特異性,抗原決定簇（基） 載體決定簇和半抗原決定簇 共同抗原和交叉反應(yīng),一、抗原決定簇,1、概念 抗原決定簇（antigen

8、ic determinant, AD)是指抗原中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱為表位（epitope)。表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定著抗原的特異性。抗原通過AD與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。 2、種類和數(shù)量 一個(gè)抗原分子可以有一種或多種不同的AD ，一種AD決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性 3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相應(yīng)淋巴細(xì)胞所識(shí)別，稱功能性決定簇，存在抗原分子內(nèi)部的AD無激發(fā)免疫應(yīng)答的功能，稱隱蔽決定簇。只有經(jīng)理化因素處理后，使之暴露可能成為新的功能決定簇。,4、大小 抗原決定簇的大小與相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相當(dāng)。 一個(gè)蛋白質(zhì)抗原決

9、定簇含5-7個(gè)氨基酸殘基 一個(gè)多糖抗原決定簇含5-7個(gè)單糖 一個(gè)核酸半抗原決定簇含6-8個(gè)核苷酸 5、抗原結(jié)合價(jià)（antigenic valence)是指能和抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)。 半抗原為一價(jià) 天然抗原的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子表面有多個(gè)決定簇為多價(jià),構(gòu)象決定簇：序列上不相連而依賴于蛋白 質(zhì)或多糖的空間構(gòu)象形成的決定簇，多暴 露于分子表面。 順序決定簇：一段相連的氨基酸序列所形 成的決定簇，多位于抗原分子內(nèi)部。 功能性AD：分子表面，易被識(shí)別。 隱蔽性AD：分子內(nèi)部。 B細(xì)胞決定簇：分子表面。 T細(xì)胞決定簇：分子內(nèi)部。,二、AD的分類,三、共同抗原和交叉反應(yīng),兩種來源不同的抗原，除各有其

10、主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原。 親緣關(guān)系很近的生物之間存在的共同抗原稱為類屬抗原。 無種屬關(guān)系的生物之間存在的共同抗原稱為異嗜性抗原。 一種共同抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)。,2.2 藥物分子的抗原性,1、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物也是完全抗原。 2、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會(huì)發(fā)生改變。,3、藥物分析中，為了得到高效價(jià)的抗血清，通常會(huì)與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗(yàn)。 常用載體

11、：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。,（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng),多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基縮合形成肽鍵 甾體：甾體激素的羥基和酮基不能直接和載體蛋白形成有效的共價(jià)鍵，需要制備甾體的衍生物，通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連 抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價(jià)結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實(shí)現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接,在選擇結(jié)合半抗原的化學(xué)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮不同的連接方式可能對(duì)抗體的專一性產(chǎn)生不同的影響。 半抗原沒有可以結(jié)合的官能團(tuán)時(shí)需要合成

12、適當(dāng)?shù)难苌铩?為得到特定抗原決定簇相對(duì)單純的合成抗原，需要根據(jù)半抗原的化學(xué)特性及連接產(chǎn)物的化學(xué)特性選擇連接的半抗原。,（2）半抗原和載體的選擇原則,半抗原選擇原則： 最好含有芳香結(jié)構(gòu)； 應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)的微環(huán)境； 合理利用分子類似物之間的交叉反應(yīng)。,載體選擇原則： 應(yīng)考慮載體對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響：選擇的載體應(yīng)和檢測(cè)體系不發(fā)生交叉反應(yīng)；用于包被合成抗原的載體和用于免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的合成抗原的載體蛋白不同。 免疫過程中考慮載體效應(yīng)的影響：抗體的特異性依賴于半抗原分子結(jié)構(gòu)中的免疫決定區(qū)，但整個(gè)載體蛋白大分子對(duì)于抗體反應(yīng)的性質(zhì)和量也有影響；應(yīng)使用相同載體的合成抗原制備半抗原抗體。,（3）合成抗原的測(cè)定

13、,定性測(cè)定方法： 光譜分析：半抗原和載體蛋白的結(jié)合導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的改變，改變程度和半抗原的結(jié)合量有關(guān)，半抗原結(jié)合量越大，構(gòu)象改變程度越大。 熱力學(xué)分析：半抗原和載體蛋白結(jié)合后熱力學(xué)特征會(huì)有變化，差異可通過差示掃描量熱法（DCS）等方法測(cè)定。,定量測(cè)定方法 相對(duì)含量測(cè)定法：通過ELISA法比較半抗原與載體蛋白的相對(duì)結(jié)合量。 絕對(duì)含量測(cè)定法：半抗原具有與載體蛋白完全不同的廣譜吸收特征，且半抗原在此特定波長(zhǎng)下具有較強(qiáng)的吸收；或能利用特定的化學(xué)反應(yīng)定量測(cè)定半抗原的量，且不與載體蛋白發(fā)生反應(yīng)。,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用 五、免疫擴(kuò)散法,主要內(nèi)容,免疫分析實(shí)際上是一種特

14、殊的試劑分析， 特點(diǎn)是抗體成為分析試劑。,1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能,抗體泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）, 受體（receptor）和其他結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 .,抗體（antibody，Ab）：是由抗原進(jìn)入機(jī)體刺激B細(xì)胞分化增殖為漿細(xì)胞而合成并分泌的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合并產(chǎn)生免疫效應(yīng)的含有糖基的球蛋白。抗體分布于體液（血液、淋巴液、組織液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清內(nèi)。,1. 抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白。

15、抗體主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。所有抗體都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗體。,免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu),IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。,抗體的基本結(jié)構(gòu),輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個(gè)四肽鏈分子稱為Ig分子的單體；單體是構(gòu)成所有免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)；所有抗體的單體都是四條肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即：兩條糖基化重鏈(H)和兩條

16、非糖基化輕鏈(L)；每條重鏈和輕鏈分為氨基端(N端)和羧基端(C端)。,IgG分子由四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連，有三個(gè)功能區(qū)。 抗體在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時(shí)通過hi區(qū)的轉(zhuǎn)動(dòng)以適應(yīng)不同距離的抗原決定簇。 與抗原結(jié)合后，IgG分子構(gòu)象改變，暴露出Fc上的活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出固定和激活補(bǔ)體以及粘結(jié)單核細(xì)胞等親細(xì)胞反應(yīng)的功能。,Fab：抗原結(jié)合片段 Fc：可結(jié)晶片段,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,巰基乙醇還原,胃蛋白酶（pepsin）水解片段,裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（C端） 裂解片段，F(xiàn)（ab）2，無Fc片段 與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng),木瓜蛋白酶（papain）水解片段,裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫

17、鍵（N端） 裂解片段，2個(gè)Fab（54KD），一個(gè)Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。,一、多克隆抗體（polyclonal antibody） 1. 定義：抗原分子通常具有多個(gè)抗原決定簇，動(dòng)物免疫后可刺激多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對(duì)不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAb）。 2. 實(shí)際意義 （1）預(yù)防、治療感染性疾病（特異性差，可發(fā)生超 敏反應(yīng)） （2）臨床診斷,二、單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb） 1. 定義：由單一克隆B細(xì)胞雜交

18、瘤產(chǎn)生的、只識(shí)別 抗原分子某一特定抗原決定簇的、具有高度特異性的 抗體。每種單克隆抗體其類、亞類、型及親和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特點(diǎn) 具有高度均一性。 3. 雜交瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞無限增殖； 免疫B細(xì)胞合成、分泌特異性抗體。 4. 雜交瘤技術(shù) HAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。,三、基因工程抗體 基因工程抗體是通過PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床診斷、預(yù)防和治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。 人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）； 人改型抗體（reshaped hu

19、manized antibody）； 小分子抗體； 雙特異性抗體（bispecific antibody）等。,、,抗體的功能：,清除侵入機(jī)體的微生物，寄生蟲等異物，中和它們所釋放的毒素或清除某些自身抗原。,初次反應(yīng)，再次反應(yīng)和回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體。,初次反應(yīng)，再次反應(yīng)和回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體。,抗體的規(guī)律：,2抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià),抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需要簡(jiǎn)單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性。 這兩點(diǎn)奠定了分析免疫高度靈敏和高度專一的基礎(chǔ)。 此外，抗體還有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)：每個(gè)抗體分子有兩個(gè)抗原的結(jié)合點(diǎn)，即多價(jià)性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號(hào)反差。,3、抗體的制備,（1）常規(guī)抗血清（多

20、克隆抗體）：指人工被動(dòng)免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制備、動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。,免疫原的制備,免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。 水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。 弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達(dá)到油包水的程度。 不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。,動(dòng)物免疫,通常的免疫動(dòng)物為家兔和羊。 免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。 免疫抗原量通常為110mg或50100mg。,試血及效價(jià)測(cè)定,家兔的試血通?？捎啥夓o脈取血

21、，取血量0.5ml。 不同稀釋度的抗血清和1%的血細(xì)胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測(cè)血細(xì)胞的凝聚情況，即可測(cè)得免疫血清的效價(jià)。,（2）單克隆抗體,單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。 高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個(gè)識(shí)別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)法 & 接種動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法,制備步驟,2、抗體的純化,利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。 利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專一性的抗體。,2020/10/27,59,沉淀分離,通過改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀

22、析出，與其它成分分離的技術(shù)。 是純化生物大分子物質(zhì)常用的經(jīng)典方法 包括鹽析沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和非離子聚合物沉淀法等。,2020/10/27,60,（一）鹽析法,在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析”。 優(yōu)點(diǎn)：成本低，不需要昂貴的設(shè)備；操作簡(jiǎn)便，安全；對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；對(duì)pH、溫度要求不嚴(yán)格。 缺點(diǎn)：分離效果有限,2020/10/27,61,鹽析的基本原理,蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團(tuán)、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。 當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是減弱甚至消除蛋

23、白質(zhì)分子周圍的水化膜。同時(shí)，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導(dǎo)致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。,2020/10/27,62,鹽類和濃度的選擇,常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等 硫酸銨最為常用，其優(yōu)點(diǎn)是：溶解度大；溫度系數(shù)小；密度小，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價(jià)廉易得；分離效果比其它鹽好。 但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。,2020/10/27,63,脫鹽,蛋白質(zhì)用鹽析

24、沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有： 透析法 超濾法 葡聚糖凝膠G50層析法。,2020/10/27,64,（二）有機(jī)溶劑沉淀法,利用待分離物質(zhì)與雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使某一溶質(zhì)沉淀析出，從而與其它成分分離的方法。,有機(jī)溶劑破壞溶質(zhì)分子周圍的水化層；有機(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。,2020/10/27,65,優(yōu)點(diǎn)： 分辨率比鹽析法高，即一種溶質(zhì)發(fā)生沉淀的有機(jī)溶劑濃度范圍比較窄； 溶劑容易除去，并可以回收； 沉淀無需脫鹽，易于離心或過濾分離。 缺點(diǎn)： 有機(jī)溶劑可使某些生物大分子變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行； 有機(jī)溶劑具有一

25、定毒性。,2020/10/27,66,有機(jī)溶劑的選擇,選擇有機(jī)溶劑的原則： 有機(jī)溶劑的水溶性好； 沉淀效率高； 毒性小，避免損害工作人員的健康和污染環(huán)境； 不與溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，價(jià)格便宜。 使用較多的是乙醇、丙酮、甲醇等。,2020/10/27,67,殘留的有機(jī)溶劑去除的方法： 自然蒸發(fā)或負(fù)壓蒸發(fā)，可在室溫進(jìn)行； 凝膠過濾除去。,（三）離子交換層析法,離子交換層系（ion exchange chromatography， IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時(shí)結(jié)合力的差別，而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。,優(yōu)點(diǎn)： 重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)單易

26、行； 分辨力強(qiáng)，回收率高； 具有多孔性，表面積大、交換容量大； 具有親水性，對(duì)大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。,2020/10/27,69,離子交換法的固定相是離子交換劑； 若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽(yáng)離子則直接流出，不會(huì)被吸附上去。 這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為 counter ion，因?yàn)槠潆姾膳c擔(dān)體上的電荷相反 (counter 是 相反 的意思),離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團(tuán)，根據(jù)這些基團(tuán)所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽(yáng)離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、

27、電荷基團(tuán)和平衡離子。,基本原理,2020/10/27,70,陽(yáng)離子交換反應(yīng)：R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + H+ 陰離子交換反應(yīng)：R-B+ OH- + X- R-B+ X- + OH- R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)， A- 和B+分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)， H+ 和OH-分別代表陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子， Y+ 和X-分別代表溶液中的離子基團(tuán)。,2020/10/27,71,離子交換層析對(duì)物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管（1.5 cm15 cm）中進(jìn)行的。,含有預(yù)被分離的離子的溶液通過離子交換柱時(shí)，各種離子

28、即與離子交換劑上的荷電部位競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。 任何離子通過柱時(shí)的移動(dòng)速率取決于與離子交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競(jìng)爭(zhēng)性離子的性質(zhì)和濃度。,2020/10/27,72,2020/10/27,73,兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 大多數(shù)蛋白在生理pH（pH68）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。 洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度的方法。改變pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵

29、的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。,2020/10/27,74,表3-8 在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫,2020/10/27,75,三、技術(shù)要點(diǎn),（一）離子交換劑的選擇和處理 兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 大多數(shù)蛋白在生理pH（pH68）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。 處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上

30、需要的反離子。 （二）裝柱和加樣 選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH時(shí)，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。 溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)度為20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。 （三）洗脫和收集 洗脫可采用改變?nèi)芤旱膒H或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度的方法。改變pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。 用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被

31、從柱上洗脫下來。 （四）離子交換劑的再生與保存 使其帶上所需的平衡離子。,2020/10/27,76,（四）親和層析法,親和層析是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。 配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。 配體本身必須有兩個(gè)基團(tuán)： 一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)分子的親和力不會(huì)改變 一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。,2020/10/27,77,親和層析法有點(diǎn)像在釣魚，魚是我們所要的分子 (B) 雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚餌是與 B 具有專一性的分子 (A, 上圖 1)；A 與 B 的專一性很高，只會(huì)在樣本中與 B 結(jié)合，而排除其它雜質(zhì) (

32、上圖 2)；若把結(jié)合在吸著劑上的 B 溶離下來，就可以得到均質(zhì)的 B (上圖 3)。,2020/10/27,78,2020/10/27,79,表3-16 親和層析中部分蛋白配體,3、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定,抗體的效價(jià)又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗體的效價(jià)指將血清稀釋，測(cè)定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價(jià)。 常用的效價(jià)測(cè)定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。 特異性抗體的篩選，制備出含不同的抗原決定簇的特異性抗原，然后根據(jù)抗體和這些抗原相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行分析。,一、概述 二、抗原 三、抗體與免疫反

33、應(yīng) 四、免疫分析方法及應(yīng)用,主要內(nèi)容,四、免疫分析方法及其應(yīng)用,放射免疫分析法（RIA） 熒光免疫分析法（FIA） 克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA） 酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）,放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）,1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量范圍也明顯擴(kuò)大。 由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。 放射免疫分析（radioimmunoas

34、say，RIA）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù).,基本原理,基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 ,這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來表示：,抗原 抗體,常用的標(biāo)記物：125 I和氚標(biāo)記物 放射性活度（貝克，Bp） 1Bp：每秒一次核衰變 比活度（Bp/g）： 每單位質(zhì)量所含的放射性比活度,游離狀態(tài),結(jié)合狀態(tài),具體步驟,抗原抗體反應(yīng),結(jié)合的和游離的 放射性物質(zhì)的分離,放射性活度的測(cè)定,柱色譜法 吸附法 沉淀法 抗抗體發(fā) 微孔濾膜法 固相法,求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）,熒光免疫分析法（Fluo

35、rescence immunoassay, FIA）,免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù) 以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原,熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）,在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位 在實(shí)際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù),根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類,直接法 間接法 補(bǔ)體法 其他,直接法,將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（

36、抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢 操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性染色少 敏感性低,抗原,標(biāo)記抗體,熒光,間接法,先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢,未知抗原,未標(biāo)記抗體,標(biāo)記抗體,熒光,補(bǔ)體法,利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光,補(bǔ)體,標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定,利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時(shí)間分辨熒光儀即可測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而推測(cè)待測(cè)物含量。

37、,基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。 測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。 在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色劑）,酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）,雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。 它是檢測(cè)抗原最常用ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。 其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正比。測(cè)定復(fù)合

38、物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測(cè)抗原含量。,實(shí)驗(yàn)原理 雙抗體夾心法,酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。 具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 1、HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)。 供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長(zhǎng)為492nm TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，用HCL或H2SO4終止后，由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長(zhǎng)為405n

39、m 2、AP為磷酸酯酶 一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng),一、光度酶聯(lián)免疫分析 1、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面； 抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原或抗體； 在測(cè)定時(shí)，使受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原或固相抗體起反應(yīng)； 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例； 加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本

40、中受檢物的量相關(guān)，用分光光度法進(jìn)行定量。,2、ELISA的固相載體 良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。 最常用的是聚苯乙烯。 聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 ELISA載體的形式有小試管、小珠和微量反應(yīng)板。,3、固相載體的包被與封閉 （1）包被（coating）指將抗原或抗體連接到固相載體上的過程。 以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶于pH 9.6的碳酸鹽緩沖液（或pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，pH 78的Tris-HCl緩沖液）中，加滿反應(yīng)孔，置4過夜，洗滌即可。 包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有

41、很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.120g/ml。,（2）封閉（blocking）指繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。 封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 所有的ELISA固相載體均需封閉。 常用封閉劑有0.05%0.5% BSA；10%小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可高濃度使用（5%）。,4、稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液 （1）稀釋液用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。 常用中性PBS或Tris-HCl緩沖液，其中含有無關(guān)高濃度蛋白（如10動(dòng)物血清、1BSA（牛血清白蛋白）、1

42、明膠等）和非離子型表面活性劑（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。 （2）洗滌液一般與稀釋液相同，常用PBS或Tris-HCl緩沖液。 四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-2。,表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液,（3）酶反應(yīng)終止液 辣根過氧化物酶（HRP）反應(yīng)終止液為2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性條件下喪失酶活性）。 很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶，用3mol/L NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。,5、ELISA法常用酶的底物系統(tǒng) ELISA法對(duì)底物的要求： 價(jià)廉易得、安全； 顯色性和穩(wěn)定性好； 底物本身最好為

43、無色物質(zhì)； 終止酶催化反應(yīng)后，底物不應(yīng)再繼續(xù)地自發(fā)性變性； 其最終產(chǎn)物可溶、易于測(cè)定及光吸收值高。,（1）辣根過氧化物酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰苯二胺（OPD，產(chǎn)物橙紅色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm）、5-氨基水楊酸（5-AS，產(chǎn)物橙色，測(cè)定波長(zhǎng)550nm）、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，產(chǎn)物紅色，測(cè)定波長(zhǎng)450nm）、2,2-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）等。 ABTS的反應(yīng)曲線不好。 OPD溶液具有光敏性，相對(duì)來說不穩(wěn)定，且具有誘變特性。 TMB的背景值低，溶液穩(wěn)定，沒有誘變特性。,（2）堿性磷酸酶的底物系統(tǒng) 常用的底物為對(duì)硝基磷酸苯酯（PNP），水解的產(chǎn)物為黃色的

44、對(duì)硝基苯酚，可在405nm處檢測(cè)其吸光度的變化，該底物的轉(zhuǎn)化效率高，線性關(guān)系好。 用酚酞磷酸酯為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色，可在530nm處光度法測(cè)定。 此外還可以百里酚酞單磷酸酯等為底物。,（3）-D-半乳糖苷酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的產(chǎn)物鄰硝基苯酚在405nm處具有最大吸光度值。 其他的底物有對(duì)硝基苯-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-D-半乳糖苷、氯酚紅-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羥基-3-異吩噁唑酮-D-半乳糖苷（RG）等。 （4）青霉素酶（PNC）的底物系統(tǒng) 常用底物有溴麝香草酚藍(lán)（BTB）、青霉酮酸還原淀粉-碘復(fù)合物（SIC）

45、、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚藍(lán)（21）等。,二、ELISA酶聯(lián)方法和試驗(yàn)方法 1、ELISA酶聯(lián)方法 ELISA酶聯(lián)方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以聯(lián)結(jié)具有氨基的酶和蛋白質(zhì)。 戊二醛交聯(lián)法有一步法、兩步法兩種。,圖7-2 戊二醛一步法反應(yīng)原理,一步法 將戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。 該法操作簡(jiǎn)便、有效，重復(fù)性好。 缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。,圖7-3 戊二醛二步法反應(yīng)原理,兩步法 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體；或先將抗體

46、與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。 兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，有助于本底的改善。,（2）過碘酸鹽氧化法 本法只適用于含糖量較高的酶。 辣根過氧化物酶（HRP）的標(biāo)記常用此法。 反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為活潑的醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。 圖7-4 過碘酸鹽氧化法,2、ELISA試驗(yàn)方法 ELISA法中有三個(gè)必要試劑：固相抗原或抗體；酶標(biāo)記抗原或抗體；酶反應(yīng)底物。 根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 如雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、異種動(dòng)物抗體雙夾心法、抗酶抗體法、競(jìng)爭(zhēng)性抑制法、雙夾心法

47、和抗原直接包被法等方法。,（1）雙抗體夾心法 雙抗體夾心法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最經(jīng)典的ELISA檢測(cè)法。 該法的靈敏度高，特異性強(qiáng)，但提純免疫球蛋白和制備酶標(biāo)記物要求技術(shù)性強(qiáng)，成本較高。 該法只適用于二價(jià)或二價(jià)以上較大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。,圖7-5 雙抗體夾心法,（2）間接法 間接法（indirect ELISA）是最常用的ELISA檢測(cè)方法，其原理是利用酶標(biāo)記的抗體和已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體相結(jié)合。 該法只要更換不同的固相抗原，就可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種

48、與抗原相應(yīng)的抗體。 該方法不必為每個(gè)待測(cè)抗體（或抗原）制備特異性的酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)抗體），極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)。,圖7-6 間接法,（3）競(jìng)爭(zhēng)法 競(jìng)爭(zhēng)法（competing ELISA）是利用待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，或待測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而進(jìn)行測(cè)定的一種方法（圖7-7）。,圖7-7 競(jìng)爭(zhēng)法,（4）異種動(dòng)物抗體雙夾心法 異種動(dòng)物抗體雙夾心法（圖7-8），又稱間接雙抗體夾心法（indirect DAS-ELISA）或三抗體夾心法（triple antibodies sandwich，TAS-ELISA）。 此法可用通用的酶標(biāo)記抗體檢驗(yàn)多種病毒，它不僅免去了標(biāo)記每種抗

49、體，而且靈敏度有所提高。,圖7-8 異種動(dòng)物抗體夾心法,（5）抗酶抗體法 抗酶抗體法（圖7-9）是利用免疫學(xué)反應(yīng)而不是用化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來制備酶結(jié)合物，常用HRP為標(biāo)記酶作為抗原免疫動(dòng)物制備抗HRP抗體。 可用一種動(dòng)物（如兔）制備特異性抗體（第一抗體）和抗酶抗體（第三抗體），再用另一種動(dòng)物（如羊）制備抗第一種動(dòng)物（兔）IgG的抗體（第二抗體）。 讓這種抗IgG的第二抗體把第一抗體（兔IgG）和抗酶抗體（也為兔IgG）通過免疫學(xué)反應(yīng)連接起來。 最后讓酶與抗酶抗體結(jié)合，通過對(duì)底物的作用而揭示在固相載體上待測(cè)抗原的存在。,優(yōu)點(diǎn):HRP通過免疫學(xué)反應(yīng)與抗體結(jié)合，避免了用化學(xué)方法交聯(lián)時(shí)抗體活性的改變，也避免

50、了HRP與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合，防止標(biāo)記抗體和游離的未標(biāo)記抗體之間的競(jìng)爭(zhēng)，提高了標(biāo)記抗體的質(zhì)量。 在純化化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)制備的酶結(jié)合物的過程中，除去未標(biāo)記抗體比較困難，而且該法僅在制備抗酶抗體時(shí)用少量純HRP作抗原，所以用較粗制的HRP與抗酶抗體形成免疫復(fù)合物，并不影響其質(zhì)量，這大大節(jié)約了價(jià)格較昂貴的精制HRP。 因?yàn)橹苽淇姑缚贵w必須在動(dòng)物中進(jìn)行，故抗酶抗體法多適用于檢測(cè)動(dòng)物中的抗體。,圖7-9 抗酶抗體法,三、ELISA反應(yīng)條件的選擇 1、酶標(biāo)抗體濃度的選擇 先用200L IgG（100 mg/ml）包被小孔，再將酶標(biāo)記抗體球蛋白系列稀釋并加入小孔中，洗滌后，加底物反應(yīng)，終止后測(cè)定吸光度。 選擇吸

51、光度為1的稀釋度作為酶標(biāo)抗體最適濃度。,圖7-10 酶標(biāo)抗體濃度的選擇,2、包被濃度的選擇 當(dāng)包被抗原的濃度較低時(shí)，包被量隨抗原濃度的增加而增大；當(dāng)包被抗原達(dá)到一定濃度后，包被量為定值，不再隨抗原濃度的增加而增大。 此濃度稱為抗原的飽和包被濃度。,圖7-11 抗原包被量和ELISA反應(yīng)的關(guān)系,表7-3 SM-EDA-GA包被法中鏈霉素包被質(zhì)量濃度對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)誤差的影響,3、酶-底物反應(yīng)時(shí)間的選擇 抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37反應(yīng)23h達(dá)到高峰。 時(shí)間太短，敏感性下降，時(shí)間太長(zhǎng)，吸附的抗原或復(fù)合物（在這個(gè)溫度下）可能脫落。 酶-底物反應(yīng)時(shí)間一般采用15min、30min或45mi

52、n，也可以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為準(zhǔn)，隨時(shí)測(cè)定其OD值，當(dāng)達(dá)到規(guī)定的OD值時(shí)，即終止反應(yīng)。,四、ELISA的定量計(jì)算與靈敏度 1、ELISA的定量計(jì)算 一般采用分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)合物中的酶量和抗體蛋白（IgG）量，酶量和IgG計(jì)算方法如下。 其中，0.4表示酶的A403nm值為1時(shí)，酶量為0.4mg/ml；0.42表示酶的A403nm值為1時(shí)，其相應(yīng)A280nm值為0.42；0.62表示在A280nm值為1時(shí)，IgG量為0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛結(jié)合后，A280nm增加約6。,酶結(jié)合物中結(jié)合的酶量、酶結(jié)合率計(jì)算方法： 以采用過碘酸鈉氧化法進(jìn)行酶聯(lián)為例，摩爾比值計(jì)算方法： 酶量為1mg/ml

53、，摩爾比值為1.52.0，酶結(jié)合率在30%以上時(shí)，可獲得較好的ELISA分析結(jié)果。,2、ELISA的靈敏度與ELISA放大系統(tǒng) （1）ELISA的靈敏度 ELISA的檢出限已經(jīng)達(dá)到10-810-12g，但對(duì)某些測(cè)定仍需更高的靈敏度。 傳統(tǒng)ELISA中顯色劑發(fā)色團(tuán)的吸光度是限制ELISA靈敏度的主要因素。 改用熒光標(biāo)記或其他化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記抗體替代酶標(biāo)記抗體可以提高靈敏度。 改變傳統(tǒng)ELISA的操作程序也可以提高靈敏度，如SIMIT技術(shù)。 采用放大系統(tǒng)是提高ELISA靈敏度的主要途徑。,（2）ELISA放大系統(tǒng) 生物素-親和素放大系統(tǒng)可增加抗體（或抗原）的標(biāo)記率。 生物素與親和素結(jié)合速率較快且結(jié)合

54、物的穩(wěn)定性高（K=1015），不會(huì)在孵育和各種洗滌過程中脫落。 生物素對(duì)抗體和酶的標(biāo)記率高（10個(gè)生物素分子/抗體分子），且生物素分子易于活化，標(biāo)記后不影響抗體和酶的活性。 每個(gè)親和素分子能結(jié)合4個(gè)生物素，因而可偶聯(lián)更多的聯(lián)結(jié)生物素的酶分子，從而提高ELISA的敏感性。 生物素-親和素標(biāo)記體系有靈活多變的運(yùn)用方式，可以適應(yīng)不同的分析設(shè)計(jì)。,微粒放大。用適當(dāng)?shù)奈⒘４婷?抗體結(jié)合物也可以獲得放大效果。 每個(gè)微粒表面可以同時(shí)結(jié)合大量記酶和抗體分子。在包含微粒放大的夾心ELISA法中，微粒通過結(jié)合于其上的第二抗體結(jié)合于抗原。微粒上又結(jié)合著標(biāo)記酶，其數(shù)量遠(yuǎn)比第二抗體能結(jié)合的標(biāo)記酶多，因此得以放大。 例如，微顆粒放大系統(tǒng)用微顆粒硅膠（直徑約40nm）作為中間體連接酶和抗體，避免酶和抗體直接連接。酶微顆粒硅