基因芯片的操作流程及步驟；

1、,1 cell =23 pairs of chromosomes,23 pairs of chromosomes = 3,200,000,000 bases,1 human body =100,000,000,000,000 cells,基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖,生物芯片的制作步驟,細(xì)胞,對mrna進(jìn)行標(biāo)記,雜交,基因表達(dá)資料,基因芯片研制的總體藍(lán)圖,研制方向的確定,基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定,檢測樣品 的制備,探針陣列的準(zhǔn)備,檢測設(shè)備的研制,雜交檢測與數(shù)據(jù)分析,簡介,基因芯片 探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù) 激光共聚焦顯微技術(shù),大量探針分子 （通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于500）

2、,于固定支持物上,檢測每個(gè)探針分子 的雜交信號強(qiáng)度,與被標(biāo)記的樣品 分子進(jìn)行雜交,獲取樣品分子的 數(shù)量和序列信息,一次性對樣品大量序列進(jìn)行檢測和分析，解決了 傳統(tǒng)核酸印跡雜交（southern blotting和northern blotting等）技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程序低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。,基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物,橫跨：生命科學(xué)、物理學(xué)、 計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù) 光電技術(shù)、材料科學(xué) 等現(xiàn)代高科技。,中科院遺傳所人類基因組中心 北京大學(xué) 聯(lián)合基因集團(tuán)有限公司 我國第一家批量生產(chǎn)基因 芯片 擁有近2千條基因藥物發(fā)明專利 東南大學(xué)吳健雄實(shí)驗(yàn)室 中科院計(jì)算所生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室 上

3、海生科院,4.我國主要研究單位,我國基因芯片的研究現(xiàn)狀,目前，我國尚未有較成型的基因芯片問世，但據(jù)悉已有幾家單位組織人力物力從事該技術(shù)的研制工作，并取得了一些可喜的進(jìn)展。標(biāo)志著我國相關(guān)學(xué)科與技術(shù)正在走向成熟。 涉及領(lǐng)域：生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、精密機(jī)械科學(xué),生物芯片分類,根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,6400點(diǎn)的基因芯片 （面積 12x14 mm),基因芯片（gene chip）的原理,基因芯片的測序原理是雜交測序法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法。在一塊基片

4、表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列tatgcaatctag，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置 ，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶序列的核酸。,基因芯片又稱dna微陣列（dnamicroarray）,三種主要類型： 1）固定在聚合物基片（尼龍膜、硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cdna片段通過同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測 2）用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的dna探針陣列通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測 3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測,把大量

5、分子檢測單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。,基因芯片原型,主要類型,多種方法將寡核苷酸或短肽 固定到固相支持物上 原位合成（in situ synthesis） 合成點(diǎn)樣 支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等,薄膜型、玻片型,微板型,集成電路型,基因芯片 /dna 微陣列g(shù)ene chip /dna microarray,核酸雜交技術(shù) 是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。,第二節(jié)、基因芯片技術(shù),核酸體外雜交技術(shù),表達(dá)型基因芯片的設(shè)計(jì),一、基因芯片（dna微陣列）,寡核苷酸芯片、cdna芯片、genomic芯片 模式一：

6、是將靶dna固定于支持物上，適 合于大量不同靶dna的分析， 模式二：將大量探針分子固定于支持物上， 適合對同一靶dna進(jìn)行不同探針序列的分 析。,1.基因芯片原理,基因芯片是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布來進(jìn)行分析?；蛐酒汛罅糠肿訖z測單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測和分析。 基因芯片技術(shù)是建立在southern blot基礎(chǔ)之上的，可以說它是southern blot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性dna 加入探針后在一定溫度下退火，同源片段

7、之間通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。,2.基因芯片的基本原理分析,任何線狀的單鏈dna或rna序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列ttagctcatatg分解成5個(gè)8 nt亞序列：,這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。 亞序列中a、t、c、g 4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。 假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8 nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶dna雜交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記dna/rna序列雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有

8、能與靶dna雜交的寡核苷酸，從而推出靶dna中的所有8 nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對大量熒光信號的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶dna 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。,原理 - 通過雜交檢測信息,一組寡核苷酸探針,tatgcaatctag,cgttagat,acgttaga,atacgttagatc,tacgttag,由雜交位置確定的一組,核酸探針序列,gttagatc,雜交探針組,tatgcaatctag,重組的互補(bǔ)序列,靶序列,tacgttag,acgttaga,atacgtta,cgttagat,gttagatc,atacgtta,基因芯片,熒光標(biāo)記的樣品,共聚焦顯微鏡,獲取熒光圖象,雜

9、交結(jié)果分析,探 針 設(shè) 計(jì),雜交,pcr擴(kuò)增 靶基因標(biāo)記,表達(dá)差異分析 多態(tài)性分析 再測序,生物信息學(xué) 數(shù)學(xué)優(yōu)化 數(shù)據(jù)庫,基因芯片的相關(guān)技術(shù)示意圖,二、 基因芯片基本操作流程,制備總rna mrna經(jīng)rt-pcr用cy3（正常對照組）和cy5（實(shí)驗(yàn)組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cdna 探針 混合標(biāo)記探針與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交掃描分析雜交結(jié)果結(jié)論 載體+寡核苷酸-探針分子+熒光染料-點(diǎn)樣儀-掃描儀-計(jì)算機(jī)+專業(yè)軟件,基 因 芯 片 流 程,樣品制備,芯片制備,雜交,雜交信號檢測,數(shù)據(jù)分析,基因芯片的操作流程,基因芯片流程（一）,1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2. 樣品制備（指mrna或總rna樣

10、品，包括對照組和實(shí)驗(yàn)組。將mrna或總rna分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cdna，然后將對照組和實(shí)驗(yàn)組cdna分別標(biāo)記cy3和cy5熒光信號） 3. 芯片制備（寡核苷酸探針或 cdna探針，包括pcr，純化，點(diǎn)樣等步驟）,例 基于芯片的基因測序,基因芯片流程（二）,4. 芯片雜交（將用cy3和cy5熒光標(biāo)記的對照組和實(shí)驗(yàn)組的cdna 等量混合，與芯片進(jìn)行雜交） 5. 芯片掃描（采用激光掃描儀，分別用532nm和635nm波長激光掃描芯片，對于每張芯片，得到cy3和cy5通道兩幅圖象）,cdna spotted microarrays,基因芯片流程（三）,6. 圖象處理（采用專門軟件，對圖象進(jìn)行分析，提取

11、每個(gè)點(diǎn)上的數(shù)字信號，得到原始數(shù)據(jù)表） 7. 數(shù)據(jù)校正和篩選（對cy5或cy3信號進(jìn)行校正，消除實(shí)驗(yàn)或掃描等各環(huán)節(jié)因素對數(shù)據(jù)的影響，同時(shí)利用篩選規(guī)則對數(shù)據(jù)中的“壞點(diǎn)”，“小點(diǎn)”，“低信號點(diǎn)”進(jìn)行篩選，并作標(biāo)記）,基因芯片流程（四）,8. 目的基因或序列的確定（采用ratio值對差異基因進(jìn)行判斷，或采用統(tǒng)計(jì)方法如線性回歸、主成分分析、調(diào)整p值算法等對差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷） 9. 生物信息學(xué)分析（如cluster 算法、差異基因的同源性比對，差異基因的相關(guān)文獻(xiàn)檢索等）,微流控芯片檢測儀,基因芯片的閱讀分析系統(tǒng),芯片掃描儀,芯片雜交盒,三、 基因芯片設(shè)計(jì)步驟,1. 基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則 基因芯片設(shè)

12、計(jì)主要包括兩個(gè)方面: 探針的設(shè)計(jì) 指如何選擇芯片上的探針 探針在芯片上的布局 指如何將探針排布在芯片上。,確定芯片所要檢測的目標(biāo)對象 查詢生物分子數(shù)據(jù)庫 取得相應(yīng)的dna序列數(shù)據(jù) 序列對比分析 找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。 數(shù)據(jù)庫搜索 得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。,在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮以下幾個(gè)方面： (1)互補(bǔ)性 (2)敏感性和特異性 (3)容錯(cuò)性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可讀性,基因芯片使用步驟,芯片制作,把探針固定于載體表面,樣品處理,目標(biāo)分子富集,分子間的雜交,結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析,基因芯片的制作方式,原位合成,直接點(diǎn)樣,原位光蝕刻合成,原位噴印合成,分

13、子印章法,針式點(diǎn)樣,噴墨點(diǎn)樣,光導(dǎo)原位合成法,原位合成法,主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。 主要步驟為： 首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來。 每次選取適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。 每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。,優(yōu)點(diǎn)是可以用很少的步驟合成及其大量的探針陣列,1、原位光蝕刻合成,寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由affymetrix公司開發(fā)的，采用的技

14、術(shù)原理是在合成堿基單體的5羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。,目前美國affymetrix公司已有同時(shí)檢測6,500個(gè)已知人類基因的dna芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約1

15、00萬美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。 目前，用于分子診斷的dna芯片不僅已可用于檢測愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（cf）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。 鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進(jìn)行以下研究：對光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。,2、光導(dǎo)原位合成法,是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithog

16、raphic mask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而n個(gè)核苷酸長的芯片需要4n個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針稱為一個(gè)“feature”，這樣的芯片便具有4n個(gè)“feature”，包含了全部長度為n的核苷酸序列。 這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和pcr產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米

17、，即探針間隔為 510m，但只能制作ii型 dna芯片。,3、原位噴印合成,芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的dna固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。,4、點(diǎn)樣法,點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cdna或基因組dna通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。 采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，

18、制備好的dna芯片可置于緩沖液中保存。 用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模cdna芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。dna芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類pcr產(chǎn)物。,玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)。 點(diǎn)樣針沾取探針溶液。 點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。 針式點(diǎn)樣的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡單，密度高（幾千-幾十萬點(diǎn)/cm2)， 轉(zhuǎn)移過程中探針溶液損失小。 缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確

19、性、重現(xiàn)性不好,5.針式點(diǎn)樣,生產(chǎn)商 bio-rad 性能介紹 分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(z軸) ， 重復(fù)性：3um 球面精確性：l0um。一次制成芯片數(shù)：126塊芯片 每塊玻片點(diǎn)樣量82,000個(gè)點(diǎn),2202芯片點(diǎn)樣儀,噴墨點(diǎn)樣的方式類似于噴墨打印機(jī)。將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并根據(jù)芯片不同位點(diǎn)探針序列需要將特定的探針試劑（不足納升）噴印到特定位點(diǎn)。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。,6.噴墨點(diǎn)樣,7.分子印章法,根據(jù)陣列合成的要求設(shè)計(jì)并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成

20、的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個(gè)依次壓印到芯片特定位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。合成的后續(xù)反應(yīng)與壓電打印類似。 分子印章法不僅可用于制備原位合成芯片，還可用于dna微集陣列的制作。,1樣品制備。,一般所需mrna的量是以一張表達(dá)譜芯片需要3g mrna計(jì)算的,2 樣本采集過程關(guān)鍵點(diǎn),氰代磷酸二乙酯(depc),離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。 在rnase-free 0.9生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。 用鋁箔包裹組織，或用5

21、ml凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐 保留1-2張取材部位的病理切片。,以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過15分鐘，超過時(shí)間會導(dǎo)致樣品的rna降解。 對腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來判定要進(jìn)行研究的取材部位。,待分析基因在與

22、芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。 高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。 為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、pcr、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來源樣品的平行分析。 用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號，通過計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)

23、信息。,雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測出來。 通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測定出該堿基的種類。 如果芯片僅用于檢測基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。 表達(dá)檢測需要長的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。,雜交信號的檢測是dna芯片技術(shù)中的重要組成部分。 由于dna芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確

24、定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模dna芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，ccd)攝像機(jī)等弱光信號探測裝置。 此外，大多數(shù)dna芯片雜交信號譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。 雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個(gè)部分組成。,1熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測,1熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法,（1）激光掃描熒光顯微鏡探

25、測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為510m。同時(shí)通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺xy方向上步進(jìn)平移，dna芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20m象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的dna芯片及大規(guī)模dna芯片雜交信號檢測，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。,(2)激光掃描共焦顯微

26、鏡,激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與dna芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動(dòng)步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長，比較適合研究用?，F(xiàn)在 affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12萬美元。,（3）采用了ccd相機(jī)的熒光顯微鏡,這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以ccd相

27、機(jī)作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動(dòng)平臺。由于采用了ccd相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用,（4）光纖傳感器,將 dna芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200m，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔。化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物

28、產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號返回到熒光顯微鏡，由ccd相機(jī)接收。 這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測dna微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模dna芯片，有一定的應(yīng)用局限性。,2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測,以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于dna芯片雜交將受到很大的限制，

29、因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。 目前應(yīng)用較多的是美國general scanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(scanarray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號，并對每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了scanarray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。,5.結(jié)果的分析,樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細(xì)胞中的dna或rna釋放出來，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交。 雜交完成后，要對基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。 檢測結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。 樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對時(shí)產(chǎn)生的熒光信號要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過對信號強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對。,為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡便和快速，affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對一幅包含數(shù)萬個(gè)探針位點(diǎn)