藥品質(zhì)量檢測技術(shù)（可編輯）

1、藥品質(zhì)量檢測技術(shù) 藥品質(zhì)量檢測技術(shù) 儀器分析 教學目標 1.掌握紫外分光光度法及可見分光光度法的 基本原理 2.掌握色譜法基本理論 3.了解分光光度法和色譜法在工業(yè)生產(chǎn)和科學研究 中的應(yīng)用 知識要點 1.吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系和光吸收基本定律 2.色譜法基本理論 技能要點 1.紫外-可見分光光度計的應(yīng)用 2.GC、HPLC、TLC的基本應(yīng)用 第一節(jié) 分光光度法 一、概述 二、紫外-可見分光光度法 三、紅外分光光度法 一、概述 分光光度法： 測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收度，對物質(zhì)進行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。 主要包括: 紫外分光光度（電子光譜）法：吸收光波長范

2、圍200400nm，可用于物質(zhì)的定性和定量分析。 可見分光光度（電子光譜）法：吸收光波長范圍400760nm，主要用于有色物質(zhì)的定性和定量分析。 二者合稱為紫外-可見分光光度法即UV-ViS 二、紫外-可見分光光度法 光的基本特性 物質(zhì)對光的選擇性吸收 吸收定律 紫外吸收光譜的應(yīng)用 紫外-可見分光光度計 光的基本特性 光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長?、頻率?、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述： ? ? c ； 波數(shù) 1/ ? ?/c 光是由光子流組成，光子的能量： E h ? h c / ? （Planck常數(shù)：h 6.626 10 -34 J S 單色光：單波長的光（

3、由具有相同能量的光子組成） 白光（太陽光）：由各種單色光組成的復(fù)合光 物質(zhì)對光的選擇性吸收 物質(zhì)的吸收光譜曲線： 吸收定律 吸收系數(shù) A Kbc中比例常數(shù)K稱為吸收系數(shù)； 物理意義：單位濃度的溶液液層厚度為1 cm 時，在一定波長下測得的吸光度。 在藥品檢驗的實際工作中，通常有兩種表示方法： 質(zhì)量吸收系數(shù)a 當c的單位為g/L，b的單位為cm時，K用a表 示，稱為質(zhì)量吸收系數(shù)這時朗伯-比耳定律為： Aabc。 摩爾吸收系數(shù) 當式中濃度c的單位為mol/L，液層厚度的單位為cm時，則用另一符號表示，稱為摩爾吸收系數(shù)，它表示物質(zhì)的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時，溶液的吸光度。其單位為L/m

4、ol?cm。這時朗伯-比耳定律就變?yōu)椋?Abc 紫外吸收光譜的應(yīng)用 鑒別：同一物質(zhì)在相同條件下，測得的紫外-可見吸收光譜應(yīng)具有完全相同的特征。 對比吸收光譜特征參數(shù) 比較吸收度比值的一致性 對比吸收光譜的一致性 雜質(zhì)檢查：藥物與雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別 含量測定：朗伯-比耳定律 對照品比較法 吸收系數(shù)法 計算分光光度法 紫外-可見分光光度計 儀器的基本組成部件 信號顯示器 早期使用的是檢流計、微安表、電位計、數(shù)字電壓表、自動記錄儀等。 現(xiàn)代的分光光度計廣泛采用數(shù)字電壓表、函數(shù)記錄儀、示波器及自動記錄型裝置和數(shù)據(jù)處理臺（稱為工作站）。 紫外-可見分光光度計的類型 單光束分光光度計: 常用的有75

5、1G型、752型、721型、722型。 雙光束分光光度計 ： 常用的有710型、730型、UV-210型等。 雙波長分光光度計 ： 與單波長分光光度計的主要區(qū)別在于采用雙單色器。 三、紅外分光光度法 紅外吸收產(chǎn)生的原理與條件 紅外光譜法的應(yīng)用 紅外光譜儀 紅外吸收產(chǎn)生的原理與條件 原理：當分子中某個基團的振動頻率和紅外光的頻率一致時，分子就吸收紅外光的能量，從原來的基態(tài)振動能級躍遷到能量較高的振動能級。物質(zhì)對紅外光的吸收曲線稱為紅外吸收光譜。 根據(jù)試樣的紅外吸收光譜進行定性、定量分析和確定分子結(jié)構(gòu)等分析的方法，稱為紅外分光光度法。 紅外光譜產(chǎn)生的條件 紅外光的能量應(yīng)恰好能滿足振動能級躍遷所需要

6、的能量，當紅外光的頻率與分子中某基團的振動頻率相同時，紅外光的能量才能被吸收。 紅外光與物質(zhì)之間有耦合作用。分子必須有偶極矩的變化。 紅外光譜法的應(yīng)用 定性分析 研究分子結(jié)構(gòu)：如確定分子的空間構(gòu)型，求化學鍵 的力常數(shù)、鍵長和鍵角及未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定等。 定量分析 紅外光譜定量分析是通過對特征吸收譜帶強度的測量來求出組份含量。其理論依據(jù)是朗伯-比耳定律。 由于紅外光譜的譜帶較多，選擇的余地大，所以能方便地對單一組份和多組份進行定量分析。 此外，該法不受樣品狀態(tài)的限制，能定量測定氣體、液體和固體樣品。因此，紅外光譜定量分析應(yīng)用廣泛。但紅外光譜法定量靈敏度較低，尚不適用于微量組份的測定。 紅外光譜

7、儀 第二節(jié) 色譜法 一、色譜法概述 二、薄層色譜法 三、氣相色譜法 四、高效液相色譜法 一、色譜法概述 色譜分離的原理 二、薄層色譜法 TLC thin layer chromatography 展開：將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜，密閉。一般展開815cm。溶劑前沿達到規(guī)定 展距，取出薄層板，晾干，待檢測。 定性鑒別：利用Rf值進行定性鑒別 定量分析 三、氣相色譜法 GC gas chromatography 氣相色譜儀 四、高效液相液相色譜法 HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色譜儀 氣路系

8、統(tǒng) 作用：獲得純凈、流速穩(wěn)定的載氣。包括氣源、壓力計、流量計及氣體凈化裝置等。 常用的載氣：H2、He、N2、Ar 載氣的要求：化學惰性，不與有關(guān)物質(zhì)反應(yīng)。載氣的選擇除了要求考慮對柱效的影響外，還要與分析對象和所用的檢測器相匹配。 載氣的來源： 氣體鋼瓶和減壓閥：壓力表多為兩級壓力指示 氣體發(fā)生器：氮氣、氫氣、空氣及一體機 進樣系統(tǒng) 構(gòu)成：進樣器、進樣口、氣化室等 要求： 進樣量或體積要適宜、準確； 采用常規(guī)色譜柱分離，進樣體積幾至幾十微升； 對毛細管柱分離，體積約為10-210-3L； 體積過大或進樣過慢，將導(dǎo)致分離變差（拖尾）； 進樣針最大容量與進樣量要匹配。 汽化室要求：體積小；熱容量大

9、；對樣品無催化作用 包括：填充柱和毛細管柱（或開管柱） 分離系統(tǒng) 填充柱：多為U形或螺旋形；內(nèi)徑26mm； 長13m；內(nèi)填固定相。 毛細管柱：分為涂壁、多孔層和涂載體開 管柱，內(nèi)徑0.10.5mm，長達幾十至100m， 通常彎成直徑1030cm的螺旋狀；其特點 為滲透性好、傳質(zhì)快，分離效率高（n可達 106）、分析速度快、樣品量小。 作用對象：氣化室、柱箱、檢測器 控溫方式：恒溫和程序升溫 溫控系統(tǒng) 作用：將經(jīng)色譜柱分離后順序流出的化學組分的信息轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌诩o錄的電信號，然后對被分離物質(zhì)的組成和含量進行鑒定和測量。 常用的檢測器： 氫火焰離子化檢測器 Flame ionized detector

10、，F(xiàn)ID 熱導(dǎo)檢測器 Thermal conductivity detector，TCD 電子捕獲檢測器 Electron capture detector ，ECD 質(zhì)譜檢測器 MSD 即氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC-MS 檢測系統(tǒng) 主要用于可在H2-Air火焰中燃燒的有機化合物（如烴類物質(zhì)）的檢測。 通用型檢測器 主要對含有較大電負性原子的化合物響應(yīng)。它特別適合于環(huán)境樣品中鹵代農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯等微量污染物的分析。 質(zhì)譜是唯一可以給出分子量, 確定分子式的方法, 而分子式的確定對化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 是至關(guān)重要的 HPLC的概念、分類、特點及應(yīng)用 HPLC系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜

11、柱進行分離測定的色譜方法。 根據(jù)分離機制不同，分為液固吸附色譜、液液分配色譜、化學鍵合色譜、離子交換色譜、分 子排阻色譜等 概念 分類 肯定法：根據(jù)紅外光譜的特征吸收峰，確認某基團的存在。 如某化合物的IR譜，在官能團區(qū)1740cm-1有吸收C O，在指紋區(qū)1300cm-11150cm-1范圍內(nèi)有兩個強吸收峰CO，根據(jù)官能團區(qū)及指紋區(qū)的這三個相關(guān)峰： 否定法：基于某個波數(shù)區(qū)間內(nèi)的吸收峰對某個基團是 特征的，在譜圖中若無此吸收峰出現(xiàn)，則說明此基團 在分子中不存在。 已知化合物的鑒定 用標準試樣對照 將試樣的譜圖與標準樣品的譜圖進行對照。 與標準譜圖對照 在沒有純凈的標準物質(zhì)時，可用標準譜圖比較。

12、 未知物結(jié)構(gòu)分析 未知物結(jié)構(gòu)分析的一般步驟如下： 了解與試樣性質(zhì)有關(guān)的其他資料 了解來源 元素分析的結(jié)果 相對分子質(zhì)量 熔點、沸點等物理性質(zhì)和有關(guān)的化學性質(zhì) 由元素分析結(jié)果和相對分子質(zhì)量推算出分子式 計算不飽和度： n11價原子數(shù)目 n33價原子數(shù)目 n44價原子數(shù)目 規(guī)定：雙鍵 C C、C O 、飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)： 1；叁鍵 CC ： 2；苯環(huán)： 4。 分子結(jié)構(gòu)式中達到飽和時所缺一價元素的對數(shù)，每缺兩個一價元素時，不飽和度為一個單位 試樣的制備和紅外光譜的制作 被分析的試樣應(yīng)該是純物質(zhì) 純物質(zhì)可以通過對試祥進行分離和精制的方法 如分餾、萃取、重結(jié)晶、層析等 得到 根據(jù)試樣的性質(zhì)，按照試驗條件制作

13、紅外光譜圖 譜圖的解析 首先觀察官能團區(qū)，解析第一強吸收峰屬于何種基團的特征吸收峰。 如，羰基 C O 在1820cm-11600cm-1有強吸收峰，其中： 1820 cm-1 1750 cm-1 1750 cm-1 1725 cm-1 1740 cm-1 1720 cm-1 1740 cm-1 1720 cm-1 找出該基團的全部或主要相關(guān)蜂，包括該基團在指紋區(qū)的吸收峰，進一步確認該基團的存在。然后解析第二強峰及其相關(guān)峰。 確定分子中各個基團或化學鍵所連接的原子或原子團，以及與其他基團的結(jié)合方式，并結(jié)合相對分子質(zhì)量、不飽和度以及其他儀器分析結(jié)果等有關(guān)資料，推測分子的結(jié)構(gòu)。 與標準譜圖進行對照

14、 在相同的實驗條件下操作，將得到的紅外光譜圖與標準譜圖進行比較，若兩張譜圖吸收峰的位置和形狀完全相同，峰的相對強度一樣，可以認為樣品與該種已知物是同一物質(zhì)。 例 某未知物分子式為C8H8O，其IR譜如圖所示，試推測未知物的分子結(jié)構(gòu)。 解： 1 根據(jù)分子式計算不飽和度： 1+8+ 0-8 /25 苯環(huán)及CH3的 CH伸縮振動 苯環(huán)的骨架振動 單取代苯 C O的伸縮振動。因分子式中只有一個氧原子，不可能是酸或酯，只可能是酮，而且分子中有苯環(huán)，很可能是芳香酮。 CH3的CH對稱彎曲振動s CH CH3的CH反對稱彎曲振動as CH 2 圖譜解析 綜上所述，該化合物中有一個單取代的苯環(huán)、一個羰基 估計

15、是芳香酮羰基 、一個甲基，根據(jù)分子式，推測未知物的結(jié)構(gòu)式可能是: 總結(jié)： 3000cm-1 、1600cm-11500cm-1苯環(huán)的骨架振動、指紋區(qū)760cm-1，692cm-1單取代苯 1681cm-1強峰為C O的伸縮振動 1363cm-1 CH3的CH 1430cm-1CH3的CH 色散型IR譜儀：利用單色器作為色散元件 傅立葉IR譜儀：利用光的干涉作用進行測定，沒有色散元件 色譜法的來源 色譜法 chromatography 早在1903年由俄國植物學家茨維特最先發(fā)明并定義，他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素

16、中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。他稱之為色譜。這種方法因此得名為色譜法，又稱層析法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離 色譜分離過程 當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。 兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ) 色譜法分類 TLC的概念、分類、特點 概念： TLC法系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展

17、開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，并可用薄層掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定。 分類： 吸附薄層色譜：固定相為吸附劑，適于異構(gòu)體的分離 原理：產(chǎn)生差速遷移而得到分離 分配薄層色譜：固定相為液體，適于同系物的分離 原理：利用樣品中各組分在固定相與流動相之間的分配系數(shù)差別而實現(xiàn)分離 膠束薄層色譜：以表面活性劑膠束溶液為展開劑的薄層色譜 原理：被分離組分在水、膠束和固定相三者之間形成分配平衡 特點 方法簡便易行，容易掌握； 不需考慮雜質(zhì)的污染問題，對樣品凈化程度的要求低； 在一塊薄層板上可以同時展開多個樣品，分析時間短； 展開后的薄層可以用不同的

18、掃描條件反復(fù)掃描比較，只 要所測的斑點穩(wěn)定，還可存放到需要時再測定； 可選用各種不同顯色劑噴霧顯色，有助于定性鑒別。 載板： 具有一定機械強度、化學惰性、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻，價格合理，常用為玻璃板。 玻璃板的常用規(guī)格：520cm、1020cm、2020cm，要求光滑、平整、洗凈后不附水珠、干燥。 TLC的基本材料 固定相或載體： 硅膠：常用極性吸附劑，具表面活性中心，略帶酸性 氧化鋁：常用極性吸附劑，具表面活性中心，略帶堿性 硅藻土：中性吸附劑 纖維素：液-液分配色譜擔體（水為固定液），具一定粘性 聚酰胺：特殊有機薄層材料 硅膠G 含粘合劑煅石膏 ，GF254 含254nm熒光劑

19、，硅膠H 不含粘合劑 ，硅膠HF254 點樣器： 常用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器。 展開容器： 上行展開可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽 展開缸，展開時須能密閉； 水平展開用專用的水平展開缸。 顯色裝置： 噴霧顯色用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器； 浸漬顯色用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用； 蒸氣熏蒸顯色用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。 檢視裝置： 為裝有可見光、254nm及365nm紫外光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。 TLC的基本操作 除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水（或加有黏合 劑的水溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除 表面的氣泡后，倒入涂布器中，

20、在玻板上平穩(wěn)地移 動涂布器進行涂布（厚度為0.20.3mm），取下 涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干后，在 110烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。 使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視， 表面應(yīng)均勻、平整、光滑、無麻點、無氣泡、無破 損及污染。 制備 點樣： 一般為圓點狀或窄細的條帶狀， 點樣基線距底邊1015mm，圓點 狀直徑一般不大于3mm，條帶狀寬 度一般為510mm；點間距一般不 少于8mm。 展開： 準備：在展開缸中加入適量的展開劑，密閉保持1530分鐘。 展開方式：上行、下行、近水平、雙向展開等，多采用上行展開。 （b）直立式展開 1色譜缸 2薄層板 3展開劑

21、4展開劑蒸氣 （a）傾斜上行法展開 1色譜缸 2薄層板 3展開 顯色與檢視： 對有色物質(zhì)，展開后可直接檢視； 對無色物質(zhì)可在紫外燈 254nm或365nm 下，觀察有無暗斑或熒光斑點，記錄其顏色、位置及強弱。適用于有熒光的物質(zhì)或少數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)； 熒光薄層板 如硅膠GF254板 檢測，在 254nm紫外光燈下觀察熒光板上的熒光 淬滅物質(zhì)形成的色譜； 既無色，又無紫外吸收的物質(zhì)可用噴 霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或 加熱顯色，在日光下檢視。 TLC的應(yīng)用 原點到組分斑點質(zhì)量中心的距離 Rf值 原點到溶劑前沿的距離 GC的概念、分類、特點及應(yīng)用對象 分類 氣相色譜 氣液分配色譜 填充柱氣相

22、色譜 毛細管柱氣相色譜 概念 GC法系采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。 特點 應(yīng)用范圍廣 應(yīng)用對象 具有揮發(fā)性或在一定溫度下能夠汽化的物質(zhì) 不揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的物質(zhì)可衍生化后分析 某些大分子物質(zhì)和高聚物可用裂解色譜法分析 分離效率高，分析速度快 樣品用量少， 靈敏度高 選擇性好 國產(chǎn)氣相色譜儀 氣相色譜儀的構(gòu)成 氣路系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 溫控系統(tǒng) * * 學習目標 紅外分光光度法（IR，分子振-轉(zhuǎn)光譜）：利用紅外吸收光譜對物質(zhì)進行分析的方 法，吸收光波長范圍2.51000?m，主要用于已知結(jié)構(gòu)的有機化合物鑒別（定性） 光的波長越短（頻率越高），其能量越大。 如果把適當顏色的兩種光按一定強度比例混合，也可成為白光，這兩種顏色的光稱為互補色光。 白光 綠 500-580 橙 600-650 黃 580-600 紅 650-780 紫 400-450 藍 450-480 青藍 480-490 青 490-500 光的互補色示意圖 物質(zhì)的顏色是基于物質(zhì)對光有選擇性吸收的結(jié)果 而物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色則是被物質(zhì)吸收光的互補色。 將不同波長的