抗抑郁藥R-托莫西汀中間體S-3-氯-1-苯丙醇的生物合成.ppt

1、抗抑郁藥(R)-托莫西汀中間體(S)-3-氯-1-苯丙醇的生物合成,研究背景 論文創(chuàng)新點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 主要結(jié)論與建議,1,2,3,4,研究背景,生物法制備手性藥物中間體具有反應(yīng)條件溫和、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)。而且使用微生物全細(xì)胞作為催化劑還可省去酶純化與輔酶添加費(fèi)用。 因此，利用生物法進(jìn)行(S)-3-氯-1-苯丙醇的制備，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。,研究背景,目前對(duì)于(S)-3-氯-1-苯丙醇的制備多采用化學(xué)法不對(duì)稱(chēng)還原或生物化學(xué)方法拆分外消旋醇；對(duì)于生物法不對(duì)稱(chēng)還原前手性酮制備手性醇研究較少。 當(dāng)前生物法制備手性醇最佳成果為：植物細(xì)胞作為催化劑還原3-氯-1-苯丙酮，20 mmol/L底物濃度下，反應(yīng)48

2、 h，產(chǎn)率達(dá)到78%，e.e.達(dá)到98% 。,論文創(chuàng)新點(diǎn),1、篩選出一株催化性能優(yōu)異的酵母，與其它相關(guān)研究進(jìn)行比較，本研究可以在實(shí)現(xiàn)同等對(duì)映體過(guò)量率的情況下，得到更高的時(shí)空產(chǎn)率； 2、在水/有機(jī)溶劑體系和含離子液體的水/有機(jī)溶劑體系中不對(duì)稱(chēng)還原得到(S)-3-氯-1-苯丙醇，未見(jiàn)報(bào)道； 3、研究了單一水相體系和兩相體系不同條件對(duì)還原過(guò)程中細(xì)胞膜流動(dòng)性、完整性等的影響，初步探索了細(xì)胞生物學(xué)特性與不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的關(guān)系。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論,1、菌株的篩選與鑒定 2、單一水相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原 3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,1、菌株的篩選與鑒定,菌株的篩選,表1 不對(duì)稱(chēng)還原酵母菌株的篩選,由表

3、1可知，同等條件下，酵母FU5菌株對(duì)底物3-氯-1-苯丙酮具有最佳的還原產(chǎn)率和對(duì)映體過(guò)量率。因此，選擇其做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。,1、菌株的篩選與鑒定,菌株鑒定 采用ITS全長(zhǎng)序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。,圖1 酵母基因組電泳圖,圖2 酵母ITS序列電泳圖,1、菌株的篩選與鑒定,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建以剛果錐蟲(chóng)（Trypanosoma congolense）ITS序列作為外類(lèi)群，以擔(dān)子 酵母（ Basidiomycete yeast ）ITS序列作為參照，使用NJ算法，并對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1000次可信度檢驗(yàn)。,圖3 基于ITS 序列和Neighbor-Joining 算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),2、單一水相

4、體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,表2 有氧無(wú)氧條件對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原的影響,圖4 底物濃度對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原的影響,2、單一水相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖5 細(xì)胞濃度對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原的影響,圖6 不對(duì)稱(chēng)還原的時(shí)間進(jìn)程,產(chǎn)率維持恒定的原因：（1）反應(yīng)達(dá)到平衡；（2）體系中細(xì)胞死亡，反應(yīng)不再進(jìn)行；（3）底物或產(chǎn)物的毒性導(dǎo)致細(xì)胞失去催化能力；（4）體系中存在產(chǎn)物抑制。,100,2、單一水相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,在反應(yīng)體系中加入產(chǎn)物對(duì)可能存在的產(chǎn)物毒性進(jìn)行考察。,圖7 不同濃度的產(chǎn)物對(duì)還原的影響,表3 不同濃度的產(chǎn)物對(duì)酵母的影響,說(shuō)明體系中存在產(chǎn)物毒性。,2、單一水相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,在體系中加入環(huán)糊精、表面活性劑等添加物降低體系中

5、的產(chǎn)物濃度，并考察加入這些物質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響。,圖8 不同濃度的環(huán)糊精對(duì)還原的影響,圖9 不同濃度的表面活性劑對(duì)還原的影響,2、單一水相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖10 不同濃度的表面活性劑對(duì)酵母細(xì)胞的影響,Circle: CTAB Square: SDS Triangle:Tween 80 Open shape: OD260 Solid shape: OD280,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,表4 兩相體系有機(jī)溶劑的選擇,圖11 兩相體系有機(jī)溶劑的選擇,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖12 兩相體系底物濃度對(duì)還原的影響,圖13 兩相體系相體積比對(duì)還原的影響,1.5,3、水/有機(jī)溶

6、劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,單一水相體系和兩相體系的細(xì)胞膜流動(dòng)性研究（熒光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞熒光各向異性）：Ex 358 nm，Em 430 nm ，DPH標(biāo)記時(shí)間：60min。,表5 不同條件處理酵母細(xì)胞的熒光各向異性,Control:10mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0),100 g/L酵母濕菌體,30 g/L葡萄糖。 四種體系均在32 ，150 r/min下處理20 h。,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,PI對(duì)酵母細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯強(qiáng)熒光和弱熒光的酵母?jìng)€(gè)數(shù)，衡量酵母細(xì)胞膜完整性。,如膜流動(dòng)性研究中四種方式處理酵母處于強(qiáng)熒光區(qū)的酵母細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)量

7、比值都極低，其原因在于此種酵母細(xì)胞膜完整性難以被破壞，四種處理方式可能對(duì)酵母細(xì)胞膜完整性影響較小。,圖14 酵母細(xì)胞流式圖,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖15 兩相體系中底物的分配,圖16 不同體系水相中的產(chǎn)物濃度,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖17 不同細(xì)胞濃度對(duì)還原的影響,表6 兩相體系輔助底物的選擇,圖18 不同葡萄糖濃度對(duì)還原的影響,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖20 不同pH對(duì)還原的影響,圖19 不同反應(yīng)溫度對(duì)還原的影響,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖21 不同緩沖液濃度對(duì)還原的影響,表7 緩沖體系的選擇,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不

8、對(duì)稱(chēng)還原,圖22 不同振搖速度對(duì)還原的影響,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,圖23 兩相體系不對(duì)稱(chēng)還原的時(shí)間進(jìn)程,在水/正己烷兩相體系中，酵母細(xì)胞的催化活性保持時(shí)間較長(zhǎng)；但相比與單一水相體系，即使在較高的底物濃度下，兩相體系中的催化速率仍較低。,底物濃度15 mmol/L,底物濃度20 mmol/L,3、水/有機(jī)溶劑兩相體系中的不對(duì)稱(chēng)還原,水/正己烷兩相體系中加入離子液體對(duì)反應(yīng)的影響 加入不同種類(lèi)的離子液體對(duì)酶的立體選擇性影響較小。但離子液體會(huì)對(duì)還原產(chǎn)率產(chǎn)生不利影響。,主要結(jié)論,1、篩選到一株對(duì)3-氯-1-苯丙酮具有良好的不對(duì)稱(chēng)還原能力的酵母FU-5，初步鑒定為釀酒酵母。 2、在單一水

9、相體系中，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5 mmol/L，反應(yīng)20 h后，產(chǎn)率達(dá)到65%，e.e.達(dá)到98%。研究顯示，體系中不存在底物抑制與產(chǎn)物抑制，但產(chǎn)物毒性限制了產(chǎn)率的提高。 3、在水相體系中，適當(dāng)濃度的添加物（Tween 80和-環(huán)糊精）可提高產(chǎn)率：當(dāng)反應(yīng)體系中Tween 80濃度為2.0 mmol/L，-環(huán)糊精濃度為5.0 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率從對(duì)照組的64.7%分別提高到73.8%和70.6%。說(shuō)明同時(shí)具有包結(jié)作用和改善細(xì)胞膜滲透性的Tween-80提高產(chǎn)物得率的效果優(yōu)于僅具有包結(jié)作用的-環(huán)糊精。但對(duì)于產(chǎn)物e.e.值而言，兩種包結(jié)物對(duì)其基本無(wú)影響。,主要結(jié)論,4、在水/正己烷兩相體系中，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，當(dāng)?shù)孜餄?/p>