葡聚糖凝膠柱的使用方法

1、葡聚糖凝膠柱的使用方法：(1) 預(yù)處理稱取Sephadex G-25（50100目）約5g，加入蒸餾水100ml，置室溫下3h進(jìn)行溶脹。(2) 裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200目尼龍布）墊底或購(gòu)買類似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，先加入1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。同時(shí)大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡23h即可加樣品分離。(3) 加樣加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠

2、表面相齊（或留一極薄液層）為止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來(lái)盛樣品的容器23次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。(4) 洗脫與收集洗脫時(shí)，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。本實(shí)驗(yàn)洗脫液流出的速度應(yīng)控制在0.81.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集3ml，共收集10管。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，4或5號(hào)管核苷酸濃度最大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋L(zhǎng)度的差異，管號(hào)會(huì)有變化，必要時(shí)可用紫外檢測(cè)A260nm，找出濃度最大

3、的管號(hào)。(5) 凝膠的再生和回收凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要再生處理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實(shí)驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60烘箱中烘干，回收保存。實(shí)驗(yàn)五. 葡聚糖凝膠層析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。2學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體

4、是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。 葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3氯1，2環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來(lái)控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬(wàn)不等。 葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個(gè)組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動(dòng)。分子量大于允許進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔范圍的

5、物質(zhì)完全被凝膠排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動(dòng)，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長(zhǎng)，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。 本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖凝膠G25作為固定相載體，來(lái)分離藍(lán)色葡聚糖2000和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚糖2000分子量接近2106， 而溴酚藍(lán)分子量為670，二者分子量相差較大，前者完全排阻，而后者則可完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時(shí)間不同而分開?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材層析柱(120cm)附有一小段

6、乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計(jì)2.實(shí)驗(yàn)試劑 (1) Tris醋酸緩沖液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。 (2) 溴酚藍(lán)溶液：稱取溴酚藍(lán)10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，然后逐滴加入Tris醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍(lán)色。 (3) 藍(lán)色葡聚糖2000溶液：稱取藍(lán)色葡聚糖2000 10毫克，溶于2毫升Tris醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。 (4) 樣品溶液：取溴酚藍(lán)溶液0.1毫升，藍(lán)色葡聚糖2000

7、溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。 (5)葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex-G-25)【實(shí)驗(yàn)操作】1.實(shí)驗(yàn)?zāi)z的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時(shí)，或沸水浴溶脹 2小時(shí)，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris醋酸溶液)洗滌23次，使pH和離子強(qiáng)度達(dá)到平衡，最后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。 2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液

8、，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動(dòng)均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時(shí)，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達(dá)到8厘米,關(guān)閉出口。裝柱過程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡l至2個(gè)柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。取溴酚藍(lán)及藍(lán)色葡聚糖2000混合液0.3毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動(dòng)層析柱床表面。打開下端出口，使樣品溶液進(jìn)入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液

9、。當(dāng)樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應(yīng)完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再進(jìn)行下一次洗滌。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為34cm。 4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升，進(jìn)行洗脫。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管(試管預(yù)先編號(hào))，收集約20管左右，樣品即可完全被洗脫下來(lái)。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定其光密度。 5.凝膠回收處理方法：將樣品完全洗脫下來(lái)后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將

10、上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因?yàn)槟z過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留強(qiáng)，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20對(duì)化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來(lái)分離。 3 Sephadex LH20 洗脫溶劑?？赐甑?點(diǎn)后，就應(yīng)該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類：反

11、相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿甲醇最為常見，先用50氯仿甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用100甲醇沖柱。 4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇水），樣品用最少體積的甲醇水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿甲醇），樣品用最少體積的氯仿甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。 5 Sephade

12、x LH-20的步驟。(1) 選擇條件：梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。(2) 飽和層析柱：用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打開開關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。(3) 樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。(5) 洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時(shí)更改極

13、性（很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。6 分離的技巧，最后說說我的使用心得（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達(dá)。（2）柱子盡可能長(zhǎng)， Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢(shì)兵力，打擊敵人。（3） 餾分一定要接的細(xì)，可110，或120 個(gè)保留體積接成一餾分。（4） 洗脫體積一般為2-3個(gè)保留體積，對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫5個(gè)保留體積。（5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質(zhì)（6）Sephadex LH20 對(duì)黃酮類成分

14、的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。（7）填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái)，待用。 Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同時(shí)適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分離。 1.裝柱裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于Sepha

15、dex LH-20而言，25100m的粒徑范圍相對(duì)于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對(duì)容易得到均一的柱床。這對(duì)于長(zhǎng)柱（最高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲(chǔ)槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。Sephadex LH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分?jǐn)嚢?，否則會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請(qǐng)參考后頁(yè)之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。 2.平衡 上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為