高效液相色譜法測定維生素C

1、.高效液相色譜法測定維生素C的含量【摘要】高效液相色譜法已經(jīng)成為解決生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)發(fā)展中各種難題的重要手段，在實驗室中也廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的定性定量分析。本實驗中利用高效液相色譜法對維生素C進(jìn)行定量分析，所采用的定量分析方法為外標(biāo)法，通過做出標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)而對樣品中的維生素C進(jìn)行定量檢測?！娟P(guān)鍵詞】高效液相色譜法、維生素C、含量1、 引言維生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗壞血酸，是一種水溶性維生素。Vc 在體內(nèi)參與多種反應(yīng)，如氧化還原過程，在生物氧化和還原作用以及細(xì)胞呼吸中起重要作用。人體內(nèi)缺乏 Vc 時容易導(dǎo)致壞血病。同時，由于 Vc 是一種水溶性的強(qiáng)有力抗氧化劑

2、并參與膠原蛋白的合成， 它同時還具有防癌、 預(yù)防動脈硬化、 治療貧血、抗氧化和提高人體免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔類水果中含量較高。 櫻桃、 番石榴、 辣椒、 獼猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。溶于流動相 （mobile phase）中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相（stationary phase）發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。高效液相色譜法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于

3、60 年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、 自動進(jìn)樣器、 預(yù)柱或保護(hù)柱、 柱溫控制器等，現(xiàn)代 HPLC 儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。 制備型 HPLC 儀還備有自動餾分收集裝置。2、 HPLC測定維生素C的含量2

4、.1、儀器試劑2.1.1、儀器高效液相色譜儀（Agilent1260），色譜柱：C18 柱 (250 mm4.6 mm, I.D.5 m)；平頭進(jìn)樣器。2.1.2、試劑乙腈（色譜純），冰乙酸，維生素 C，磷酸二氫鉀等均為分析純，實驗用水為超純水。Vc 標(biāo)準(zhǔn)溶液：快速準(zhǔn)確稱取 0.025 g Vc，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，得到 100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.1.3、色譜條件流動相： 3%的乙腈-0.05 mol/LKH2PO4水溶液 （v/v）； 流速 1 mL/min； 柱溫 30，紫外檢測波長 26

5、5 nm；進(jìn)樣量 10 L。2.2、實驗步驟2.2.1、樣品處理1、按操作說明開啟液相色譜儀，設(shè)定方法參數(shù)。2、樣品準(zhǔn)備：取 10 片維生素 C 片，研勻。準(zhǔn)確稱取 0.02g，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量轉(zhuǎn)移至 50 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，用 0.45m濾膜過濾。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 樣品溶液，待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析，平行測定 3 次。以 Vc 色譜峰面積對濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、定量分析：供試品溶液經(jīng) 0.45 m 微孔濾膜過濾后進(jìn)行 HPLC 分析。平行測定 2 次，記錄其 Vc 的色譜峰

6、面積，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計算維生素片中 Vc 的含量。5、實驗結(jié)束后，按要求清理好儀器。3、數(shù)據(jù)處理不同Vc 濃度對應(yīng)色譜峰面積圖表濃度mg/L5205080100峰面積mAU*S146.73135592.211431509.601812428.493903050.15918y=30.58x-14.146 R2=1y(sample)=1892.33813代入上式有x=62.34mg/L4、實驗結(jié)果討論本實驗中所采用的定量分析方法為外標(biāo)法，即標(biāo)準(zhǔn)校正法。該法直接，易于操作，計算簡單。但是標(biāo)樣與測定組分為統(tǒng)一化合物，分離、檢測條件的穩(wěn)定性對定量結(jié)果影響較大。除此方法外，常用的定量分析方法還有內(nèi)標(biāo)法、峰面

7、積歸一化法。至于定性分析，常用的方法為保留值定性，與已知物對照定性，還有安保柳枝經(jīng)驗規(guī)律定性。此外還有選擇性檢測響應(yīng)定性，色譜-結(jié)構(gòu)分析儀器聯(lián)用等方法。在分析未知物時，首先要知道這個化合物化學(xué)物理常數(shù)，然后選擇合適的樣品處理方法，使樣品有較好的萃提回收率和較少的干擾成分存在；而對于分離分析，如果使用紫外檢測器，在這之前應(yīng)先做個化合物的吸收波長掃描，以找出其最大吸收波長，流動相先用純水和乙腈或甲醇在不同比例時進(jìn)行調(diào)節(jié)，保證出峰時無干擾和一定的分離度，然后依據(jù)峰形和化合物的pKa值進(jìn)行水相的pH值調(diào)節(jié)，以找到最佳的流動相體系。氣相色譜儀具有分離選擇性好、柱效高、速度快、檢測靈敏度高、試樣用量少、應(yīng)用廣泛等特點。但氣相色譜儀也具有一點局限性，在沒有純標(biāo)樣的條件下，對試樣中未知物的定性定量較為困難，往往需要與紅外光譜、質(zhì)譜等結(jié)構(gòu)分析儀器聯(lián)用，對于飛沸點高、熱穩(wěn)定性差、腐蝕性和反應(yīng)活性強(qiáng)的物質(zhì)，氣