分子生物學李世杰-第三章有機體、染色體和基因

1、第三章 有機體、染色體和基因 (3、12),第一節(jié) 生命有機體 第二節(jié) 原核生物染色體和基因 第三節(jié) 真核生物的染色體 第四節(jié) 真核生物的基因,第一節(jié) 生命有機體,一、生命有機體的劃分,按照細胞的結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的分布，生命有機體可 大致劃分為： 原核生物（ Prokaryotes ） 真核生物（ Eukaryotes ）, 原核生物（ Prokaryotes ）,遺傳物質(zhì)類核或擬核 習慣上也稱為染色體,類核或擬核, 真核生物（ Eukaryotes ）,遺傳物質(zhì)集中存 在于核膜包圍的 細胞核中,并與 特殊的蛋白質(zhì)結(jié) 合為核蛋白 染色體, 超分子的亞細胞生命形式,病毒（寄主為動、植物）

2、使用真核生物的遺傳法則 噬菌體(細菌或病毒) 適應(yīng)了原核生物的遺傳策略,繁殖必須在寄主體內(nèi)進行，因而遺傳機制與寄主密切相關(guān),如：病毒（virus） 噬菌體(phage ）,真核細胞和原核細胞的區(qū)別：,第二節(jié) 原核生物染色體和基因,一、大腸桿菌（Escherichia coli E.coli ）,1、大腸桿菌在實際工作中 的重要性,1885 Theodor Escherich (德國) 原命名為 Bacterium coli 將其屬名改為 Escherichia 是為了紀念發(fā)現(xiàn)者,經(jīng)常被當作是所有生物的 原型（archetype）,b、生長迅速，要求營養(yǎng)物質(zhì)簡單，能進行很多生理生化過程,c、有性

3、生殖，可進行遺傳學的研究 (如遺傳雜交及遺傳性狀 的分析 ）,d、能夠供應(yīng)病毒的生長，進行病毒擴增的研究,a、在實驗室中容易操作,因為:, 類核中，染色體DNA成分占80，其余為RNA和蛋白質(zhì), 4.6 x 106bp的基因組DNA 與多種DNA結(jié)合蛋白質(zhì)組裝成 E.coli的染色體, 基因組DNA為雙鏈環(huán)狀， 總長度為1.3mm，1400 以上的基因（共30004000個）都已定位,（1） 染色體DNA,2、大腸桿菌的遺傳物質(zhì),包括染色體DNA和質(zhì)粒DNA, E.coli的基因結(jié)構(gòu)的特點,a、功能相關(guān)的幾個結(jié)構(gòu)基因以操縱元（operon）的形式存在 其中包括共同的調(diào)節(jié)基因、啟動子（promo

4、ter）、操作子 （operator）, 它們在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作,E.coli 染色體的基因圖,b、功能相關(guān)的RNA基因也串聯(lián)在一起(rrn 操縱元)， 如：16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA基因轉(zhuǎn)錄在同一個 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,d、RNA基因多拷貝 大多數(shù)的E.coli菌株都含 有七個rrn （其中六個分布在 E.coliDNA的雙向復(fù)制 起點附近）,c、蛋白質(zhì)基因通常以單拷貝的形式存在,3、大腸桿菌的酶類,細胞中含有核酸代謝所需的各種酶類 多種限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）,只在特異順序堿基的位點上（迴文序列）與DNA結(jié)合，并沿 固定的位點切割,

5、如：E.coli的 EcoR的識別序列,5.G-A-A-T-T-C3 3.C-T-T-A-A-G.5,限制性內(nèi)切酶最基本的工具酶， 在DNA測序、片段分離、克隆DNA的環(huán)節(jié)都要用到,二、噬菌體（phage ）,1、X174噬菌體 很小的E.coli噬菌體 DNA為單鏈環(huán)狀，有5386個核苷酸（Frederick Sanger 于1977分析測定，為此榮獲第二次諾貝爾獎 ）,2、X174噬菌體基因排列更加體現(xiàn) 經(jīng)濟原則,b、DNA分子絕大部分用來編 碼蛋白質(zhì)，不翻譯部分只占4 （基因之間的間隔區(qū) 控制基因表達的序列）,a、11個蛋白質(zhì)基因，只轉(zhuǎn)錄成 三個mRNA,重迭基因有以下幾種情況： * 一

6、個基因完全在另一個基因內(nèi)部 如：B和A E和D 其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同,c、 最顯著的特點是有重疊基因 （overlapping genes 或 嵌套基因 nested genes）,* 部分重疊 K和C,* 兩個基因共用少數(shù)堿基對 如：A*和C D和J,-ATGA-,C,Start codon,-TAATG-,A*,Stop codon,D,Stop codon,J,Start codon,2、噬菌體 雙鏈DNA 長度48502bp(48Kb),* 其DNA分子有三種存在形式,a、兩個粘性末端分 離的線性分子 COS位點 (cohesive-end site),c、閉合環(huán)狀分子（粘性末端 互補，

7、DNA連接酶連接）,b、帶有切刻的環(huán)狀分子（開環(huán)的 粘性末端互補后未連接的）,* 其基因均是按功能相近的聚集成簇的（兩個正調(diào)節(jié)基因N 和Q除外）,* 存在形式 在寄主體內(nèi)有溶源生長周期（原噬菌體）和溶菌生長周期兩種生活途徑,第三節(jié) 真核生物的染色體,一、概述：,* 大部分細胞生活周期里以染色質(zhì)的形式存在（彌散狀） M期染色體形式,* 染色質(zhì)有兩種型 a、常染色質(zhì)：密度較低，能被表達 b、異染色質(zhì)：密度較高，不被表達（著絲粒、端粒）,Cell cycle,Interphase 間期: G1 + S + G2 M phase (mitosis 有絲分裂):,二、組蛋白（Histone）,與Euk.

8、的DNA結(jié)合的一類堿性蛋白質(zhì),* 染色體的主要蛋白質(zhì)組分,* 富含Lys、Arg等堿性氨基酸，11KD 23KD,* 核心組蛋白有H2A、H2B、H3和H4，另一種為H1,* 與DNA緊密結(jié)合,* 保守性強，但H1的保守性較弱,* 組蛋白八聚體（Histone octamer ） H2A與H2B、H3與H4的親和力強， 通過C端的疏水氨基酸結(jié)合,二、核小體（Nuclearsome）,* 染色體結(jié)構(gòu)的第一個層次，構(gòu)成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位,* 足量的微球菌核酸酶處理染色質(zhì)可得到, 146bpDNA 組蛋白 八聚體核小體的核 心顆粒 直徑約10nm,1、核小體的組成,146bp的核心DNA在組蛋白八

9、聚體上盤繞1.8圈,Mononucleosomes typically have 200 bp DNA. End-trimming reduces the length of DNA first to 165 bp, and then generates core particles with 146 bp., 微球菌酶處理所得核小體DNA長度的變化,Chromatosome 166 bp, 2 superhelical turn,* 組蛋白H1把核小體 “封鎖”起來,其中，166bp核小體DAN的堆積比為10 56nm線性長度5.6nm螺線管,連接 DNA 100 bp 平均 55 bp,N

10、ucleosome,Histone H1,Nucleosome repeat: Core + linker DNA 200 bp,2、染色體結(jié)構(gòu)的形成,（1） 首先若干個核小體形成念珠狀結(jié)構(gòu),The 10 nm fiber is a continuous strong of nucleosomes.,每個核小體單位包括：200bp左右的DNA、一個組蛋白八聚體、一分子H1,高度有序 左手螺旋 每圈包括六個核小體,30 nm fiber (直徑30nm) Solenoid (螺線管）,（2） 30nm纖絲的構(gòu)成 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的第二層次,a、組成,30 nm fiber,300 nm,b、體內(nèi)存在狀

11、態(tài),從DNA到染色體的過程,Compaction ratio = 8000,Centromere 著絲粒,Telomere,有絲分裂中期的染色體,姊妹染色單體,3、著絲粒（centromere 或中心粒) 和端粒(telomere),（1）著絲粒( centromere),Yeast centromere,富含AT,兩側(cè)有高度重復(fù)的衛(wèi)星DNA,屬異染色質(zhì)區(qū),a、真核染色體線性DNA末端的特殊DNA序列 b、有數(shù)百個拷貝的短的正向重復(fù)序列 ,且總是3端富含G 如：人體內(nèi) 5-TTAGGG-3 c、復(fù)制靠端粒酶（ telomerase 核蛋白)來完成 ，不同于正常DNA的復(fù)制 d、端粒DNA形成特

12、殊的二級結(jié)構(gòu)（G四聯(lián)體形成四鏈結(jié)構(gòu)）以使染色體末端免遭降解,（2） 端粒(Telomere ),第四節(jié) 真核生物的基因,Genome & genes (基因組和基因的關(guān)系）,Genome: all DNA sequences in a cell Genes: 編碼某一蛋白質(zhì)或RNA的一段DNA序列（a stretch of continuous DNA sequence encoding a protein or RNA）,C-value is the quantity of DNA in the genome (per haploid set of chromosomes). C-value

13、 paradox (C值矛盾) refers to the lack of a correlation between genome size and genetic complexity,一、相關(guān)概念,基因組（genome）：是指細胞或生物體的全套遺傳物 質(zhì)，即生物體維持配子或配子體正常功能的全套染色體 所含的全部基因（DNA）。all DNA sequences in a cell,比如人基因組的全長為大約3 X 109對堿基，編碼 3-4萬個基因,基因（Genes）：編碼某一蛋白質(zhì)或RNA的一段DNA序 列。（a stretch of continuous DNA sequence en

14、coding a protein or RNA）, 基因組和基因,C值（C-value）：一種生物體的單倍體基因組DNA的總量。 the quantity of DNA in the genome (per haploid set of chromosomes)., C值反常理論（ C-value paradox),從編碼每類生物所需要的DNA的量的最低值看，生物細胞中的C值具有從低等生物到高等生物逐漸增加的趨勢,植物 鳥類 哺乳動物 爬行動物 兩棲動物 硬骨魚 軟骨魚 棘皮動物 甲殼動物 昆蟲 軟體動物 蠕蟲 霉菌 藻類 真菌 格蘭氏陽性菌 格蘭氏陰性菌 支原體,陰影部分為一個門內(nèi)C-值的范

15、圍,低等動物的C值大于高等動物 如：兩棲類的C值大于哺乳類 肺魚的C值比哺乳動物大1015倍,同一門中的動物C值變化很大 如：兩棲類中的C值變化很大，可相差100倍 家蠅的比果蠅的大6倍,C值反常（ C-value paradox)：基因組的大小與基因組的復(fù)雜性之間缺乏一定的聯(lián)系。（ the lack of a correlation between genome size and genome complexity）,許多的DNA序列不編碼蛋白質(zhì),表現(xiàn)：,二、真核生物DNA的復(fù)性動力學 (重新結(jié)合動力學 Reassociation kinetics）, 基因組DNA的提取 超聲處理或剪切到一

16、定的長度(x 100-1000 bp) 溫度變性 退火（ Re-annealing） 測量并捕捉退火過程得出復(fù)性動力學曲線 CC01（1kC0t） (紫外吸收法、羥基磷灰石柱層析法), 真核生物復(fù)性動力學研究,三、真核生物基因組的DNA類型,高度重復(fù)序列、 中度重復(fù)序列 單一序列,復(fù)性反應(yīng)分為三相，每相代表不同復(fù)雜長度的序列類型,1、高度重復(fù)序列（Highly repetitive sequence）,分布于著絲點, 端粒區(qū)（原位雜交）, 結(jié)構(gòu)基因兩側(cè),往往沒有轉(zhuǎn)錄功能，（著絲粒 紡錘體）,占基因組的10-60%,長度2 10bp(6 100bp) ，重復(fù)數(shù)以 百萬次 106,許多富含AT高度

17、重復(fù)序列可以用密度梯度離心法分離出來,衛(wèi)星DNA（Satellite DNA）：將DNA切成數(shù)百個堿基對的片 段進行超速離心時，由于富含AT的簡單高度重復(fù)序 列區(qū)段浮力密度較小，因而很容易和總體DNA分開， 即常會在主要的DNA帶的上面有一個次要的帶相伴隨,Mouse genome DNA,30% GC in satellite DNA,CsCl 離心,ACAAACT, 1.1x107 拷貝, 衛(wèi)星 25% genome ATAAACT, 3.6x106 拷貝, 衛(wèi)星 8% genome ACAAATT, 3.6x106 拷貝, 衛(wèi)星 8% genome Satellites comprise

18、 more than 40% of the genome,果蠅（Drosophila）衛(wèi)星DNA,（根據(jù)重復(fù)頻率和大小又可分為衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA）, 數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)或小衛(wèi)星 ( Variable number tandem repeats . VNTR ),短的串聯(lián)重復(fù) 5-50 copies 有共同的核心序列， 同一群體中個體間重復(fù)次數(shù)變動很大，所以個體間長度變化很大（DNA長度多態(tài)性） 可利用其得到DNA指紋圖（DNA finger printing）,DNA指紋圖的制作,DNA指紋圖在法醫(yī)上得到廣泛應(yīng)用,微衛(wèi)星（Microsatellite) 又稱簡單序列重復(fù)（simple

19、Sequence Repeat, SSR) 一般以16個堿基為核心序列 存在于基因組的廣泛區(qū)域：基因的間隔區(qū)，內(nèi)含子，外顯子，調(diào)控區(qū) 不同物種，微衛(wèi)星含量不同：真核生物平均50150kb一 個微衛(wèi)星 不同微衛(wèi)星在不同物種中豐度不同：哺乳動物基因組，(AC)n最豐富，植物基因組， (AT)n最豐富 真核生物基因組中，二核苷酸微衛(wèi)星最豐富，三核苷酸微衛(wèi)星比二核苷酸微衛(wèi)星低10倍，四核苷酸微衛(wèi)星更少 作為DNA分子標記，構(gòu)建遺傳圖譜,2、中度重復(fù)序列 ( middle repetitive sequence ),100-幾千bp / copy,10-104 copies / genome,占基因組的

20、1040（小鼠占20，果蠅中占15）,分散在不重復(fù)序列之間,無編碼功能的中度重復(fù)序列 如： Alu 家族,有編碼功能的中度重復(fù)序列 如： rDNA tDNA Histone gene,a、 以Alu序列為代表的不編碼序列 Alu family（Alu 家族）：在長約300bp的片段中，大多數(shù) 片段含有一個限制性內(nèi)切酶Alu的酶切位點 （AGCT） 均勻分散在整個genome中的非重復(fù)序列間 在人類genome中占1 3,Alu序列顯然是一個編碼7SL RNA的基因衍生來的 7SL RNA-一種信號識別顆粒的組分,b、 有編碼基因產(chǎn)物的中等重復(fù)序列 rDNA tDNA Histone gene

21、cluster 往往以基因家族的形式組織,多為結(jié)構(gòu)基因 (蛋白質(zhì)基因),3、 單拷貝序列 (single copy sequence, 1-3 copies),大部分結(jié)構(gòu)基因位于非重復(fù)的DNA序列內(nèi),四、基因簇與基因家族 （Gene cluster、Gene family）,基因家族（Gene family）:真核生物的基因組中許多來源相同， 結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的一組基因, 簡單多基因家族：5SrRNA基因家族,復(fù)雜多基因家族：各個成員并不都是相同的 組蛋白基因家族，rRNA、tRNA基因家族,目前基因家族可分為三類：,基因簇（gene cluster）：基因家族的各成員緊密成簇，排列 成大段

22、的串聯(lián)重復(fù)單位，定位于染色體的特殊區(qū)域, 由發(fā)育階段控制的多基因家族：人類珠蛋白的基因家族,串聯(lián)重復(fù)基因簇的特點：,各成員之間有高度的序列一致性,拷貝數(shù)高 幾十 幾百,非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)短而一致,正好滿足組蛋白基因、rRNA 基因和 tRNA的 基因產(chǎn)物被細胞大量需要,組蛋白基因、rRNA 基因和 tRNA往往以串聯(lián)重復(fù)基因簇的形式出現(xiàn),a、組蛋白基因家族（Histone gene family）,一個重復(fù)單位(基因簇 gene cluster)的組織情況,組織方式因不同生物而異： 基因次序、轉(zhuǎn)錄方向、間隔區(qū)的長短、重復(fù)頻率,不轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),參見 P359頁圖1220,不算是典型的串聯(lián)重復(fù)基因簇 (

23、有些以散在形式出現(xiàn)),海膽,組蛋白基因表達特點： 沒有內(nèi)元 沒有多聚A尾巴 P359頁,b、rRNA 基因家族 （rDNA gene family）,重復(fù)單位的組織,c、tRNA基因,tRNA約長 70 80 bp，其基因約長140 bp (內(nèi)元),串聯(lián)重復(fù)排列，但各重復(fù)單位內(nèi)的各tRNA基因可以不同,c、5SrRNA基因,簡單多基因家族 成簇排列、102 103、104拷貝,3 不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū),1 5S rRNA,2 假基因,重復(fù)單位間由重 度重復(fù)序列隔開,假基因（ Pseudogenes ）：,與正?；蚪Y(jié)構(gòu)相似，但沒有正常 功能的DNA序列 P363頁,d、由發(fā)育階段控制的多基因家族,人

24、類珠蛋白基因家族典型的,血紅蛋白,在基因組中可形成穩(wěn)定的無活性的拷貝,珠蛋白,血紅素,22 不同的亞基由各自 的基因編碼, 發(fā)育過程中的珠蛋白（血紅蛋白）的亞基組成,兩種亞基的編碼基因分別形成兩個不同的基因簇,并存在于不同的染色體上,每個基因簇中的基因按其在發(fā)育過程中的表達次序從53 排列在編碼鏈上(其中包括有功能的基因和假基因),Each of the a-like and b-like globin gene families is organized into a single cluster that includes functional genes and pseudogenes.

25、,四、割裂基因（splitting gene） 不連續(xù)基因（discontinuous gene ）、 斷裂基因（interrupted gene）,概念：編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟 的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的 序列隔開,P360頁的表述有一定的片面性,1、割裂基因的發(fā)現(xiàn), 通過成熟mRNA（或cDNA）與編碼基因的DNA雜交試 驗而發(fā)現(xiàn),7 introns,8 exons,雞的卵清蛋白基因DNA與其mRNA雜交圖,1978 Gilbert 真核生物基因的新概念,Exon (外顯子、外元),DNA 與成熟RNA間的對應(yīng)區(qū)域,氨基酸的編碼區(qū)（amino a

26、cid coding region）,非間隔區(qū)（unspacer）,is any segment of an interrupted gene that is represented in the mature RNA product,原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而保留于成熟RNA中的 序列或基因中與成熟RNA序列相對應(yīng)的DNA序列,Intron (內(nèi)含子、內(nèi)元),is a segment of DNA that is transcribed, but removed from within the transcript by splicing together the sequences

27、(exons) on either side of it.,DNA 與成熟RNA間的非對應(yīng)區(qū)域,氨基酸的非編碼區(qū)（uncoding region）,間隔區(qū)（spacer） 但被轉(zhuǎn)錄,原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列或基因中與這種RNA序列相對應(yīng)的DNA序列,R環(huán)（R-loop）：mRNA與編碼單鏈DNA雜交時，不互補的 intron部分形成的環(huán),割裂基因,前體mRNA,Introns 去除 Exons 連接,所以真核生物基因又稱為,Splitting gene Interrupted gene,由于真核生物的絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因都含有內(nèi)元,2、 Splitting Gene 的普遍性,b) 原核生物 （Prokaryots）中,SV40 大T 抗原gene,小t 抗原 gene,1984 Dr. Chu,T4 phage 的胸苷合成酶 gene,1017 dNt intron,Splitting gene 并非真核生物所特有,酵母Maturase 合成受 Cyt. b intron II 的自動控制,maturase 過剩,利用intron II 編碼成熟酶,maturase 減少,提前剪切 intron II,3、 Splitting gene 概念的相對性,a) Intron 并非“含而不露”,Yeast 細胞色素