細胞培養(yǎng)技術實用篇

1、細胞生物學技術,第三章 細胞培養(yǎng)基本技術 王 云 動脈粥樣硬化研究所,細胞培養(yǎng)的優(yōu)點,活細胞：長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結構和生命活動 可控制： 選擇特定的細胞種類、性質、階段 可控制調節(jié)條件：物理、化學、生物等 可采用各種研究技術、記錄方法 樣品均一性：來源于同一組織同一種細胞 經(jīng)濟、規(guī)模,局限性,人工模擬的條件和體內(nèi)實際情況仍不完全相同 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調節(jié)和細胞相互間的影響 體外培養(yǎng)的細胞生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。,本章主要內(nèi)容,細胞培養(yǎng)的基本操作技術 原代培養(yǎng)(primary culture) 傳代培養(yǎng)(subculture) 體外培養(yǎng)細

2、胞的影響因素 細胞培養(yǎng)污染及對策 培養(yǎng)細胞的生長測定方法 細胞凍存和復蘇,細胞培養(yǎng)中的常用術語,組織培養(yǎng)(Tissue Culture)： 指的是從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。 器官培養(yǎng)（Organ Culture）： 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。 細胞培養(yǎng)(Cell Culture)： 培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群。,細胞培養(yǎng)中的常用術語,原代培養(yǎng)（primary culture）：從體內(nèi)取出細胞或組織的第一次培養(yǎng)。 傳代（passage）也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移或移植到

3、另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。 細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系,細胞培養(yǎng)中的常用術語,細胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養(yǎng)物稱細胞株。 匯合（confluent）：細胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。 接觸抑制（contact inhibition）：細胞匯合相互接觸后失去運動的現(xiàn)象,一、細胞培養(yǎng)基本操作技術,由于體外培養(yǎng)的 細胞沒有抗感染能力， 因此防污染是決定培 養(yǎng)成功的首要條件。 一切操作需要保證 無菌和有條不紊。,培養(yǎng)前準備,制定好實驗計劃和操作程序 有關數(shù)據(jù)的計算

4、要事先做好。 準備各種所需器材和物品，清點無誤后將其放置在操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。 避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。,消毒,地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min 超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。 消毒時工作臺面上用品布局合理，不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。 一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。,洗手和著裝,原則上和外科手術相同。 僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作

5、服 在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75酒精消毒手。 進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 專用鞋或帶鞋套,火焰消毒,在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。 按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。 如實驗用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細胞，以防燒死細胞。,操作,進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷 不能太快，否則空氣流動增加污染機會。 不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。,組織細胞取材及培養(yǎng)的基本要求,取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4運送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。 取材時應嚴格無菌操作，

6、避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。 原代培養(yǎng)，特別是正常細胞的培養(yǎng)，應采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。 一般來講,胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng);分化低的較分化高的組織容易生長;腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時應盡量選用易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)。 為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。,組織材料的分離,機械法：適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結、胸腺等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)。 化學法：胰蛋白酶、

7、膠原酶、EDTA法 細胞懸液的分離方法：低速離心法、密度梯度離心法,細胞懸液的分離方法,低速離心法： 血液和體液等細胞懸液500-1000rpm離心5-10min。離心速度過大、時間過長，會造成細胞損傷和死亡。 密度梯度離心法： 用離心法將細胞分到不同密度的梯度介質中，再分別吸出各層細胞。適于分離密度不等的細胞。常用介質有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。,胰蛋白酶（Trypsin）,對細胞間的蛋白質水解，使細胞離散。 消化效果與PH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關。 適于消化細胞間質較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐

8、富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效但若與膠原酶合用能增加其對組織的分離作用 。 鈣鎂離子和血清抑制其活性。 常用劑量為0.25%，PH8，溫度37,膠原酶法（collagenase）,水解結締組織中膠原蛋白成分，對上皮細胞影響不大。 產(chǎn)品有 等型，分別適用于分離肝細胞、胰島、脂肪細胞及纖維組織。 鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6.5-7 常用劑量為200U/ml,EDTA法,EDTA能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成整合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。 缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，可與胰蛋白酶混合使用

9、(1：1或2：1)，既利于細胞脫壁又利于細胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔谩?EDTA工作液的濃度為0.02，用不含鈣、鎂PBS配制。,二、原代培養(yǎng)(primary culture),從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。,原代培養(yǎng)細胞,組織和細胞剛剛離體，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，是藥物測試、細胞分化等實驗的很好對象； 原代細胞培養(yǎng)也是建立各種細胞系（cell line)

10、或細胞株（cell strain）必須經(jīng)過的階段。 原代細胞培養(yǎng)多由各種細胞成分組成，比較復雜，即使是經(jīng)過處理后的細胞，也仍具有異質性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細胞形態(tài)和大小不一,原代培養(yǎng)的方法,懸浮細胞培養(yǎng)法 器官培養(yǎng)法 組織塊培養(yǎng)法 細胞培養(yǎng)法,懸浮細胞培養(yǎng)法,對于懸浮生長的細胞如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無須消化，可采用低速離心分離,直接培養(yǎng)。,器官培養(yǎng)(organ culture),指組織、器官原基，以至整個器官或其一部分在體外的維持或生長，它們可以分化與保持原來的結構與功能。,細胞培養(yǎng)法方法與步驟,1) 動物處死：將出生23d乳鼠，

11、 用脫頸方法處死。用酒精棉球 擦拭解剖部位。 2) 取材及剪切：在無菌條件下將 組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中， 剪去多余的組織（脂肪等）， 用PBS液洗滌1-2次；放入另一 培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm3大 小的塊。,細胞培養(yǎng)法方法與步驟,3) 消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入56倍量的0.25胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37水浴中消化20 40min，每隔10min搖動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹埂Ｈ〕鲈嚬?，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復吹打組織塊，使其分散成細胞懸液，將細胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。,細胞培養(yǎng)法方法與步驟,4)計數(shù)

12、與稀釋:從過濾的細胞懸液中取出適量滴于血細胞計數(shù)板上，按白細胞計數(shù)法進行計數(shù)；計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3 5105個細胞為宜。 5)分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細胞懸液分裝于細胞培養(yǎng)瓶 or 培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標記，置于37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 6)觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細胞生長情況。待細胞已基本長成致密單層時，即可進行傳代培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)法注意事項,取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或40C冰箱。若組織塊很大，應先將其切成1cm2以下的小塊再低溫保存，但時間不能超過24小時，因放置時間長或組織塊太大都易造成細胞的死亡； 取

13、材時嚴格無菌操作。用預先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學試劑及有害藥物如碘、汞等。 3. 取材時要細心去除組織中的血液、結締組織、脂肪及壞死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中；,組織塊培養(yǎng)法,組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)(tissue culture)。,組織塊培養(yǎng)法,(1) 取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小 塊。 (2)將 剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培 養(yǎng) 瓶內(nèi)。25ml培養(yǎng)瓶(底面積約為17.5cm2）以20一30小塊為宜

14、。 (3) 放置24h待組織小塊貼附后將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放、靜止培養(yǎng),注意事項,組織塊接種后l-3天，游出細胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢固。觀察、移動過程中要注意動作輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂起。 在原代培養(yǎng)的1-2d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細胞帶來污染。 原代培養(yǎng)3-5d需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細胞，以免影響原代細胞的生長。,幾種細胞的原代培養(yǎng)圖示,1.細胞種類：人肺 部 成 纖 維 細 胞 ；2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d - 4d - 7d;3.放大倍數(shù)： 200倍 ；4.培養(yǎng)基種類：1640+1

15、0%胎牛血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述:細胞呈梭形，貼壁生長;,幾種細胞的原代培養(yǎng)圖示,1. 細胞種類：小鼠胚胎成纖維細胞 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：4d； 3. 放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 ； 4. 培養(yǎng)基種類：1640+10%X小牛血清； 5. 細胞狀態(tài)與特征簡述:細胞呈長梭形，貼壁生長,幾種細胞的原代培養(yǎng)圖示,神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細胞,在體外培養(yǎng)條件下難以增殖.因此,目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng).神經(jīng)元胞體呈圓形或長桿狀,核大而圓,核仁明顯.可見有細小突起從胞體長出.培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖,以利于神經(jīng)元的生長.,三、傳代培養(yǎng)(passage or subculture),細胞在培

16、養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，將細胞以一個培養(yǎng)瓶轉移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)。,細胞的傳代培養(yǎng),根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有2種。 懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l223，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。,細胞的傳代培養(yǎng),貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。在傳代時，需要用胰蛋白酶將細胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTA溶液與胰蛋白酶按1：1或2：1比例

17、混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%,too low, cells will be in lag phase and wont proliferate,Too high and cells may undergo unfavorable changes and will be difficult to remove from plate,貼壁生長細胞傳代方法,酶消化過程,酶消化過程,注意問題,操作全過程注意無菌操作 胰酶消化時間要適度 吹打細胞時用力要適度，盡

18、量減少氣泡,貼壁生長細胞的生長過程,游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 停止期（平臺期）,游離期,細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期 細胞質回縮，胞質呈圓球形 10分鐘-4小時,貼壁期,細胞附著于底物上，游離期結束。 底物：膠原、玻璃、塑料等 細胞株平均在10分鐘-4小時貼壁 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。 進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）,潛伏期、對數(shù)生長期、停止期,潛伏期：細胞有生長活動，而無細胞分裂，細胞株潛伏期一般為6-24小時。 對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。 停止期：細胞長滿瓶壁，雖有活力但不再

19、分裂，機制為接觸抑制、密度依賴性。,四、影響體外培養(yǎng)細胞的因素,組織和細胞供體年齡 培養(yǎng)條件 細胞的粘附 培養(yǎng)技術方法 促生長因子,組織和細胞供體年齡,幼年個體比老年者易于培養(yǎng)，所有動物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對象。 來自同一個體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。,培養(yǎng)條件,不同的細胞對培養(yǎng)基需求不同，當前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應選擇相應的培養(yǎng)基。應了解所培養(yǎng)細胞的生物學性狀和特殊需求成分。 細胞在體外進行培養(yǎng)，失去了機體的調節(jié)和控制。因此，除滿足營養(yǎng)的要求外，還必須使細胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PH值等均能影響細胞的生長。,細胞貼附的過程,影

20、響細胞貼附的因素,細胞類型 (附著最強)巨噬細胞一成纖維細胞上皮細胞血細胞(最弱) 生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機械，物理等其他因素 離心：促進附著 流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著 低溫：可抑制附著,促生長因子,現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進細胞生長作用。胰島素能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為110U/ml。氫化可的松可促進表皮細胞和乳腺上皮細胞生長，并能提高膠質細胞和成纖維細胞的克隆形成率，用量為10-8 10-7mol/L。 人表皮生長因子（hEGF)對大鼠宮頸鱗狀上皮細胞(RCEC)有促進增殖的作用。 表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等

21、生長調節(jié)因子都能促進細胞的生長和增殖。,五、細胞培養(yǎng)污染及對策,培養(yǎng)細胞生長狀況常規(guī)檢查 培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化 細胞生長狀況。 細胞形態(tài)變化。 微生物污染,培養(yǎng)液PH值（顏色變化）,變黃，表示PH值下降，細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導致。 變紅或紫紅色，表示PH值上升，細胞生長停滯、死亡。 一般生長穩(wěn)定的細胞需要2-3天換液1次，生長慢的細胞需要3-4天換液一次。,細胞換液,原代細胞經(jīng)24小時培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細胞代謝好。少量換液可刺激細胞生長。 通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/3量。原代細胞第1次換液時，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。 細胞株（系）：條件合適時生長迅

22、速，過夜就變黃，可進行全量換液。這種情況下，最好減少細胞接種數(shù)，延長換液的時間。,細胞生長狀況,常規(guī)應特別注意細胞的生長增殖情況。 原代細胞：經(jīng)歷一個適應或潛伏期。 細胞系：多為24小時以內(nèi)。 細胞長滿瓶底80%時應及時傳代。,細胞形態(tài)變化,生長良好細胞：透明度大，折光性強，輪廓不清。 生長狀態(tài)不良時，細胞折光性變?nèi)?，輪廓增強，胞質中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質，細胞之間空隙加大。,微生物污染,培養(yǎng)液顏色與透明度： 培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細胞菌。 支原體污染，沒有明顯癥狀，但細胞生長卻明顯變緩。,細胞培養(yǎng)污染的概念,不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成份和造成細胞不純的

23、異物，因此一般包括微生物(真菌、細菌、病毒和支原體)、化學物質(影響細胞生存、非細胞所需的化學成份)及細胞(非同一種的其它細胞)。其中以微生物污染最多見。另外隨著細胞種類增多不同種細胞交叉污染也時有發(fā)生、從而造成細胞不純。,污染的途徑,空氣：空氣是微生物傳播的最主要途徑。 凈化工作臺使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進行 工作時不戴口罩或面對操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強 減少空氣流動是防止污染的重要環(huán)節(jié)。,污染的途徑,器材：各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底 洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底 CO2溫箱由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細菌

24、、霉菌孽生，而CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)如不定期消毒,可形成污染.,污染的途徑,操作 無菌觀念不強、動作不準確、使用污染的器具或封瓶時不嚴 培養(yǎng)兩種以上細胞時，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營養(yǎng)液瓶等有可能導致細胞交叉污染。,污染的途徑,血清：有些血清在生產(chǎn)時就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。 組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術時使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細胞生長。,污染對細胞的影響,支原體和病毒對細胞的形態(tài)和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的 霉菌和細菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)壓制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質殺滅細胞。 化學物質污染如重金屬或其它化學試劑混

25、入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時排出，細胞仍可存活但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導致細胞發(fā)生轉化,細菌的污染和檢測,細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌， 以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改 變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。,細菌污染,細菌污染的檢測,肉眼直接觀察法 培養(yǎng)檢查法 顯微鏡觀察法 PCR檢測,真菌污染,真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、 黑曲菌、孔

26、子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，肉眼可見；有的散在生長，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡,真菌污染,支原體污染和檢測,支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2um，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。 培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分

27、細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。,掃描電鏡法顯示支原體，附于細胞表面眾多的圓形顆粒為支原體,支原體污染的檢測,相差顯微鏡觀察法 Hayflick 培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 DNA熒光染色法（Hoechst 33258） PCR方法（即用型細胞培養(yǎng)中支原體檢測PCR試劑盒）,病毒的污染和檢測,細胞的直接觀察 動物接種檢查 電子顯微鏡觀察 PCR技術,污染的預防,防止污染，預防是關鍵，預防措施應貫穿于整個細胞培養(yǎng)的始終。 器皿準備開始操作前操作過程中其他細節(jié)方面的預防 在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml。必要時加

28、入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B等。 培養(yǎng)箱內(nèi)應經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。 購入的未滅活血清應采取56水浴滅活30min的措施以使血清中的補體和支原體滅活。,支原體污染的預防,小牛血清是造成支原體初級污染的主要來源 次級污染源，即已污染支原體的細胞在污染的傳播中更為重要 保證培養(yǎng)細胞的來源絕對干凈，同時應做好檢測，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應廢棄 嚴禁已知污染了支原體的細胞進入未污染的工作區(qū)域。 嚴格無菌操作，杜絕人為污染。 對每批小牛血清嚴格檢查，滅活、過濾有利于抑制支原體的污染。,污染的清除,培養(yǎng)的細胞一旦污染應及時處理，防止污染其他細胞。 高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉。 有價值的細

29、胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常 常用的排除微生物污染的方法有以下4種,抗生素排除法,抗生素是細胞培養(yǎng)中殺滅細菌的主要手段。 聯(lián)合應用比單用效果好，預防性應用比污染后應用好 有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細胞本身也有一定影響 盡量不用抗生素處理 一些有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用510倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用2448小時，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效,加溫除菌,根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41度作用510小時（最長可以達1

30、8小時）殺滅支原體 但是41度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應先進行預試驗，確定最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。,動物體內(nèi)接種,受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，從體內(nèi)取出再進行培養(yǎng)繁殖。,與巨噬細胞共培養(yǎng),在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細胞可以存活710天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的克隆生長。 巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。 利用96孔板將極少培養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細胞清除污染的效能。

31、與抗生素聯(lián)合應用效果更佳。,六、培養(yǎng)細胞生長的測定方法,細胞計數(shù)法 胎盤蘭染色法 MTT比色法 細胞生長曲線法 3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷）摻入法 BrdU (5-bromo-2deoxyuridine，5-溴脫氧尿嘧啶核苷 ）摻入法,細胞計數(shù)法,細胞計數(shù)法是用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度。 細胞計數(shù)結果以細胞數(shù)/毫升表示,細胞計數(shù)板,細胞計數(shù)板,細胞計數(shù)操作步驟,將血球計數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 靜置3分鐘。 鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計

32、左側和上方的,細胞計數(shù)操作步驟,按下式計算： （細胞懸液的細胞數(shù)）/ml （四個大格子細胞數(shù)/4)稀釋倍數(shù)104 /ml 公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm（長）1.0mm（寬）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 。,細胞計數(shù)注意事項,要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。 取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更應該每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確。,細胞計數(shù)注意事項,數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的

33、細胞，若細胞聚集成團時只按照一個細胞計算。 如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。,臺盼藍染色法,在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，活細胞所占總細胞中的百分比叫做細胞活力。 由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。 復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。 細胞死亡后，細胞膜通透性改變，臺盼藍大量進入細胞內(nèi)而不被排出呈藍色。活細胞選擇性強，不易著色,臺盼藍染色法,0.5ml臺盼藍0.3ml培養(yǎng)液0.2ml細胞懸液 染色515min 至少計數(shù)500

34、個細胞中著色細胞數(shù) 細胞活力=（總細胞數(shù)著色細胞)/總細胞數(shù)100,噻唑藍 （MTT）比色法,原理：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物顆粒（formazan)，并沉積在細胞中。二甲基亞砜（DMSO）或酸性異丙醇能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺（以OD值表示）與所含的formazan量成正比?？煞从郴罴毎拇x水平。而死細胞沒有這種功能 MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等,噻唑藍 （MTT）比色法,加入培養(yǎng)液量10的MTT(5g/L)，繼續(xù)34h培養(yǎng) 吸去培養(yǎng)液，加入等量異丙醇或DMSO，振蕩10min

35、490/630nm 測定OD值 細胞存活率實驗組OD值/對照組OD值100,細胞生長曲線法,觀察同一代細胞的增殖過程，根據(jù)細胞生長曲線分析細胞的增殖速度，確定具體實驗、細胞傳代、細胞凍存的最佳時間,細胞生長曲線法,計數(shù)細胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培養(yǎng)7天 以接種時間始， 每隔24h計數(shù)3孔細胞數(shù)目，取均值 以橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為細胞濃度（104 /ml) 注：1、各孔消化時間應一致。 2、計數(shù)細胞前應混勻。,3H-TdR摻入法和BrdU摻入法,3H-TdR摻入法是將用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到新合成的DNA中，通過測定3H放射性脈沖數(shù)比較不同細胞的增殖活性。 溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine ,BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物,通過競爭摻入S期細胞單鏈 DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。 BrdU被摻入到DNA復制位點，這些復制位點可用熒光劑或酶偶聯(lián)的抗體檢測。,七、細胞凍存和復蘇,細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞 凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng) 費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。,凍存和復蘇的原則：慢凍快融,當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生 大的冰晶