蛋白質(zhì)的定量分析方法

1、蛋白質(zhì)的定量分析方法1 蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測方法1.1 凱氏定氮法一種最經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測方法。原理：樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產(chǎn)生氨，氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸吸收，再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點：范圍廣泛、測定結(jié)果準確、重現(xiàn)性好。缺點：操作復(fù)雜費時、試劑消耗量大。1.2 雙縮脲法 常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)檢測。原理：雙縮脲是三分子的脲經(jīng)180左右加熱，放出一份子氨后得到的產(chǎn)物，在強堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡(luò)合物（肽鏈中的氮原子和銅離子配價結(jié)合），稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色

2、的深淺和蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用來測定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點：較快速、干擾物質(zhì)少、不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。缺點：靈敏度差、三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應(yīng)。1.3 Folin酚試劑法原理：與雙縮法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵和銅離子結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)。同時也由于Folin酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色的鉬藍和鎢藍的混合物。在一定條件下，藍色深度與蛋白的量成正比，由此可測定蛋白質(zhì)的含量。優(yōu)點：靈敏度高、對水溶性的蛋白質(zhì)含量的測定很有效。缺點：費時，要精確控制操作時間；Folin酚試劑的配制比較繁瑣，且酚類和檸檬酸、硫酸銨、Tris

3、緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑（二硫代蘇糖醇、巰基乙醇）、EDTA和尿素均會干擾反應(yīng)。1.4 紫外吸收法 原理：蛋白質(zhì)中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm處具有紫外吸收，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下蛋白質(zhì)溶液的吸光值與蛋白質(zhì)含量的正比關(guān)系可以測定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點：簡便、靈敏、快速、不消耗樣品，測定后能回收。缺點：測定蛋白質(zhì)含量的精確度差、專一性差；干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物質(zhì)會出現(xiàn)較大的干擾。1.5 考馬斯亮藍法（Bradford法）原理：考馬斯亮藍G250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿

4、性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合（蛋白質(zhì)與染料間的疏水作用也很重要），使染料最大吸收峰的位置從465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也有棕黑色變?yōu)樗{色，在595nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)溶度成正比。優(yōu)點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣品的測定。缺點：由于各蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。Bradford法一般注意事項：1.不要用石英杯做比色（染料會與之結(jié)合），使用玻璃或塑料為佳，使用后用甲醇或去污劑來洗掉結(jié)合的痕量染料；2.若用同一比色杯，應(yīng)先測定低濃度樣品避免誤差；3.

5、選擇570-610nm波長；4使用不同公司生產(chǎn)的染料可能得到不同結(jié)果；5.使用高質(zhì)量試劑和水；6.要使樣品濃度落在標準曲線線性范圍內(nèi)；7.最好用球蛋白或卵清蛋白，因為BSA會比其他多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合多一倍的染料，所以用BSA時會低估蛋白質(zhì)含量，但是測定血清蛋白時使用BSA更準確。一般實驗步驟：1.染色液配制：取100g考馬斯亮藍G250溶于50ml95乙醇中，再與100ml85磷酸混合，用蒸餾水補足至1L。使用Whatman1號濾紙過濾后置于棕色瓶中室溫保存即可，若有沉淀產(chǎn)生用前應(yīng)過濾。2.酶標板（96孔）測定：取0、2、4、6、10、15、20ul的BSA標準蛋白質(zhì)溶液（1mg/ml）到酶標板孔

6、中；取最多20ul蛋白質(zhì)樣品到單獨孔中；加入40ulBradford試劑到所有孔；加水補足到200ul；測定595nm處吸光值。一種改良的Bradford法：盡管Bradford法抗干擾能力較強，但是一些堿性試劑（尿素、堿性載體兩性電解質(zhì)）還是會影響G250與蛋白質(zhì)結(jié)合。所以在加入染料之前使用酸來中和樣品能夠改善效果。由于有未與蛋白質(zhì)結(jié)合的自由染料存在，所以測定的標準曲線不是線性的（做標準曲線要準確些）。據(jù)報道，使用595nm和450nm雙波長測定可以有效解決這一問題（水做空白組），在增加準確度的同時，還能夠?qū)㈧`敏度提高十倍。（注意：樣品中含有SDS時不使用該方法）實驗步驟：準備階段：染色液：

7、按照常規(guī)配制，4保存；裂解液：9mol/L尿素、4（體積分數(shù)）NP-40、20g/L的兩性電解質(zhì)、2巰基乙醇；蛋白質(zhì)標準品：用樣品溶液（裂解液）配成5mg/L，分裝-20凍存以保證重復(fù)性（-20保存6-8個月、-80保存1年）實驗操作： 從-20冰箱中取出標準品和裂解溶液，充分溶解；標準品12000rpm,3min；樣品12000rpm,20min使之澄清；新鮮配制0.1mol/LHCI（10ul/管）并加入純水（80ul每管）；按下表數(shù)值分別配好標準品、樣品溶液，輕輕混勻（振蕩儀）：標品含量ug510152025304050標品體積ul123456810樣品體積ul98765420鹽酸ul1

8、010101010101010水ul8080808080808080過濾染色液后每管加取3.5ml，用振蕩器輕微搖勻5min；595nm檢測。用一次性比色杯（反應(yīng)5min可充分顯色，但10-15min沉淀開始出現(xiàn)，尤其高溶度蛋白在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀）；做標準曲線計算分析。2 蛋白質(zhì)的電化學檢測方法2.1 蛋白芯片技術(shù) 原理：將各種蛋白質(zhì)固定于載玻片等各種載體介質(zhì)上成為檢測的芯片，然后用標記特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應(yīng)蛋白質(zhì)及其表達數(shù)量。優(yōu)點：快速、低成本2.2 電化學免疫傳感器原理：電化學免疫傳感器是基于抗體抗原反應(yīng)，可進行特異性定量分析的自給式的集成

9、器件，抗體、抗原是分子識別原件且與電化學傳感元件直接接觸，并通過傳感元件把某種化學物質(zhì)濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號。3 蛋白質(zhì)的分子生物學檢測方法3.1 鄰位連接技術(shù)3.2 核酸適體3.3 電泳法3.4 二甲酸奎林（BCA)法最初由Smith等建立，同Lowry法類似，也是在堿性條件下有銅離子被還原形成亞銅離子（還原劑、金屬離子螯合劑會產(chǎn)生干擾），亞銅離子通過與BCA反應(yīng)而被檢測，。Lowry法和BCA法靈敏度相似，但是BCA法在堿性條件下穩(wěn)定，可以一步完成反應(yīng)且抗干擾能力強，形成的深紫色反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長是562nm，在一定條件下，此復(fù)合物吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點：購買方便、檢測速度快

10、、靈敏度高、對大多數(shù)表面活性劑不敏感；且由于反應(yīng)在堿性條件下進行，故絕大多數(shù)蛋白質(zhì)保持在溶解狀態(tài)。缺點：對還原劑、金屬離子螯合劑等很敏感，在裂解液中對該方法干擾最大的成分是DTT，測定時樣品需要充分稀釋。標準方法（0.1-1mg/ml樣品）：試劑A（100ml）：BCA-Na2 1g、Na2CO3H2O 2g、C4H4O6Na22H2O 0.16g、NaOH 0.4g、NaHCO3 0.95g，用少量的固體NaHCO3或50NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.25；試劑B（20ml）：CuSO45H2O 0.8g；工作液配制：試劑A：試劑B=50：1（體積比）混合，該蘋果綠溶液可室溫穩(wěn)定一周；試劑A、

11、試劑B在室溫下很穩(wěn)定，可以長期存放；取100ul含有10-100ug蛋白質(zhì)的樣品溶液加入2ml工作液，60孵育30min；冷卻至室溫測定562nm(595nm)處吸光度；使用1mg/ml的BSA蛋白質(zhì)標準液稀釋作標準曲線。具體實驗操作步驟：1. （將蛋白質(zhì)樣品從-20轉(zhuǎn)移至4溶解待用）計算工作液配置量=（樣品數(shù)+8+1）200ul=C ml2. 樣品稀釋與濃縮：實驗用BSA溶液為2mg/ml，而樣品樣品測定時濃度應(yīng)稀釋或濃縮至標準曲線限行范圍內(nèi)（以最終OD值落在標準曲線中值為優(yōu)）。稀釋：樣品濃度過高時需進行稀釋，根據(jù)要求用雙蒸水稀釋相應(yīng)倍數(shù)，操作在向酶標板孔中加樣時體現(xiàn)；濃縮：樣品濃度過低時需

12、進行濃縮，a.將超濾管固定在EP管內(nèi)，加入400ul樣品，11000rpm、5min，轉(zhuǎn)移EP管底廢液；b.以離心結(jié)果（超濾管內(nèi)剩余液面高低）加樣品溶液進行二次、三次.離心至樣品完全濃縮（最后一次離心留取400ul左右溶液與超濾管內(nèi)）；c.將超濾管內(nèi)液體進行反復(fù)抽打后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)。3. 按下表將各溶液、試劑加取至酶標板孔內(nèi)：12345678樣品ddH2O05101517.51919.520aBSA(2mg/ml)20151052.510.50b工作液200200200200200200200200200單位：ula+b=20；a、b值根據(jù)稀釋倍數(shù)而定。4. 振蕩儀振蕩5min，37水浴30m

13、in，用干凈的細針頭扎去大氣泡；5. 打開軟件設(shè)定程序和參數(shù)，將酶標儀扳進儀器內(nèi)進行測定595nm處吸光值，導出數(shù)據(jù)進行計算。4 免疫法4.1 免疫擴散法蛋白質(zhì)定量的一般注意事項：1. 采用同標準曲線比較的方法只能用來確定與標準蛋白濃度相近、性質(zhì)類似的蛋白質(zhì)樣品；2. 定量時一定要是樣品濃度在標準曲線限行范圍內(nèi)；3. 使用溶解蛋白質(zhì)樣品的溶液來溶解標準蛋白；4. 蛋白質(zhì)電泳前精確定量目的：保證不同樣品之間的可比性以及電泳所適合的上樣量；5. 標準蛋白應(yīng)盡量選擇與所測定的大多數(shù)蛋白質(zhì)性質(zhì)更接近的蛋白質(zhì)（例如：測定免疫球蛋白IgG做標準；測定血清蛋白BSA），常用的標準蛋白有球蛋白和BSA。6. 蛋白質(zhì)定量方法的選用(BCA法和Bradford法)6.1 Bradford法特點：a.靈敏度高（與Lowry法相比）；b.測定快速簡便，且只需加一種試劑（5分鐘）；c.干擾物質(zhì)少；d.蛋白質(zhì)中精氨酸和芳香族氨基酸含量不同，因此該方法用于不同蛋白質(zhì)樣品測定時有較大差異；e.相關(guān)干擾物：去污劑、X