實(shí)驗(yàn)一菠蘿蛋白酶的初級純化及鑒定(陳)

1、實(shí)驗(yàn)一菠蘿蛋白酶的初級純化及鑒定一、 目的：系統(tǒng)地學(xué)習(xí)和掌握蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)。熟練掌握飽和硫酸銨沉淀法、透析法、測定蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活性檢測等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、 原理：要研究某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，生產(chǎn)高生物活性的蛋白類激素、酶等，第一步工作就是從復(fù)雜的混合體系中分離（Separation）出蛋白質(zhì)并且進(jìn)行純化（Purification）分析。1 蛋白質(zhì)分離純化的一般程序：? 選擇一種目的蛋白質(zhì)含量豐富、穩(wěn)定性好的樣品材料。? 將蛋白質(zhì)從樣品中抽提出來。? 確定分離純化的方法，使粗品的純度達(dá)到預(yù)定要求。? 建立靈敏、特異、精確的檢測手段，分步測定蛋白質(zhì)的含量，檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的純度。

2、? 在操作、分析過程中注意保護(hù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，防止變性。2 蛋白質(zhì)的分離純化方法：利用溶解度不同的分離純化方法有：鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱為鹽溶（ Salting in ）。但當(dāng)鹽濃度增加到一定量時，其溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時便從溶液中沉出，即為鹽析。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子吸附某種鹽離子后，其帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度提高。但當(dāng)大量中性鹽加入，使水的活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破

3、壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。用于鹽析的中性鹽通常有硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂等，而以硫酸銨為最佳，它在水中溶解度大而溫度系數(shù)小（在 25 時，溶解度為 767g/L ；在 0 時，溶解度為 697g/L ） , 分離效果好，能保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，且價廉可得。不同蛋白質(zhì)鹽析時所需鹽濃度不同，故調(diào)節(jié)鹽濃度可適當(dāng)?shù)貙⒌鞍踪|(zhì)分開。如雞蛋清中的球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀，清蛋白在飽和硫酸銨中沉淀。對于含有多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采取分段鹽析的方法進(jìn)行純化。添加硫酸銨到所需濃度的方法有：（ 1）加飽和硫酸銨溶液，公式如下：V=V0（ S 2 S1 /1-S 1）式中， V：為需加入

4、飽和硫酸銨的體積（ml）；V0：為原來溶液的體積（ml） ;S2：為需達(dá)到的硫酸銨飽和度；1S ：為原來溶液的硫酸銨飽和度。1（ 2）將固體硫酸銨直接加入到原蛋白質(zhì)溶液中，可從有關(guān)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)書附錄中查“硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表”，獲得所需要添加的硫酸銨的量。3透析和超濾透析（ Dialysis）和超濾（Utrafiltration，超過濾）就是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜（ Semipermeable membrane） ,而小分子可以自由透過的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分開。透析是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，扎緊袋口放在蒸餾水或緩沖液中進(jìn)行的。透析時，不斷更換透析外液，直到口袋

5、內(nèi)小分子物質(zhì)降低到最小值為止。超濾是利用壓力和離心力，借助于超濾膜將不同分子量的物質(zhì)分離的技術(shù)。超濾膜是由丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素和尼龍等高分子聚合物制成的多孔薄膜，截留的顆粒直徑從2-20nm，相當(dāng)于分子量1000-5x 105。超濾技術(shù)不僅使蛋白質(zhì)得以分離純化，還達(dá)到濃縮的目的。超濾、濃縮、去熱源、脫鹽及富集病毒、細(xì)胞等工藝。4 菠蘿蛋白酶活性測定酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被菠蘿蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū)275nm 處有吸收峰，根據(jù)測定275nm 處的吸收值，可以判定菠蘿蛋白酶的酶活力。吸收值的大小與酪氨酸含量的多少有關(guān)，吸收值大說明酪氨酸含量高，也就是說菠蘿蛋白酶分解的酪蛋白多，

6、酶活力高。三. 實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠蘿（1 個約 500g）四. 儀器設(shè)備（ 1 ） 電力攪拌器（或家庭用的電力攪拌器）（ 2 ）離心機(jī) 4000-1000rpm （冷凍式或非冷凍式）（ 3 ） 752 紫外分光光度計(jì)（石英比色杯）（ 4 ） 722 分光光度計(jì) ( 玻璃比色杯 )（ 5 ） 磁力攪拌器（ 6 ） 水浴箱（ 7 ） 電子天平；臺式天平（離心平衡用）（ 8 ） 剪刀（ 9 ）冰箱（ 10 ）蒸餾水瓶（ 25L 或 50L ）。2五. 玻璃器皿1 以組為單位試管 （ 15 個）， 100 mL 燒杯（ 2 個）， 200 mL 燒杯（ 1 個），吸管（ 2 個）、玻棒（ 1 個），移液管

7、或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 個），濾紙（ 8cm ）， 100mL 量筒（ 1 個）。2 全班共用1000 mL 試劑瓶（ 7 個）， 250 mL 試劑瓶（ 3 個）， 1000mL 燒杯（ 4 個）， 2000 mL 朔料燒杯（ 2 個）， 500mL 量筒（ 2 個）。六. 實(shí)驗(yàn)試劑1 鹽析粗提酶液（ 1 ） PBS. 0.1moL/L. 2000mL mL pH7.2.（ 2 ） PBS. 25mmoL/L. 1000mL mL pH7.2.（ 3 ） 固體硫酸銨 500g2 測酶活試劑（ 1）酪蛋白 1% （ pI4.8） 100

8、mL用 0.1 mol/L PBS pH7.2配 ,50-55 水浴溶解，不停攪拌，需1h才能溶解。2g 酪蛋白（進(jìn)口裝）+200mLPBS 0.1 mol/L pH7.2（ 2）激活劑 100mL （現(xiàn)配現(xiàn)用）半胱氨酸 -鹽酸鹽 20m mol/L 0.35g， EDTA-Na 1m mol/L，加 0.1 mol/L PBS pH7.2至 100mL（ 3） TCA （三氯乙酸）5% 200mL3 、透析袋處理及試劑用 dH 2O 含 1 mmol/L EDTA-Na或煮沸 10min;或用 2%NaHCO 3 +1 m mol/L EDTA-Na。鑷子取出，用dH2O 漂洗 1-2次，即

9、可使用。 舊的透析袋， 用洗衣粉煮沸清洗，在煮沸消毒， 反復(fù)清洗。 重復(fù)上述步驟。使用后，洗干凈，用蒸餾水浸泡，于低溫保存，或浸泡在70% 的乙醇只，于低溫保存。七 . 實(shí)驗(yàn)步驟1 粗酶提取3去皮生菠蘿（每班一個）400g+400ml PBS 0.1M pH7.2電動攪拌2-4層紗布過濾于燒杯中分裝于離心管（50ml）平衡離心4000rpm， 15min棄沉淀，取上清液，量體積倒入小燒杯 , 分 8 份，每組1 份加固體（NH 4 ）2 SO4 鹽析， 25% 飽和度（ 144g/L ），緩慢加入邊加邊攪拌至完全溶解，倒入離心管，1管 /組4 ， 1h（靜置）平衡離心，4000rpm， 15m

10、in取沉淀，再加20ml PBS 0.1M pH7.2溶解，如果不能完全溶解，平衡后離心4000rpm， 10min棄沉淀，留上清，進(jìn)行酶活測定。另取2ml 放入試管中冰箱保存，用于凝膠層析除鹽用。2 果實(shí)菠蘿蛋白酶樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定（每組）將菠蘿蛋白酶粗提液進(jìn)行1：5 稀釋，然后吸取1ml ，放入具塞刻度試管中，加入5ml 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分搖勻，放置2 分鐘后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線第一管為參比（1ml PBS 0.1M pH7.2+5ml考馬斯亮藍(lán)），同樣條件下比色，記錄吸光度，并通過查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗酶液的蛋白質(zhì)含量。粗酶液配制；4根據(jù)測得的粗酶液的蛋白質(zhì)含量，取粗酶1250ug，

11、用 25mmol/L pH7.2 PBS定容至 50ml。3 酶活測定方法（每組）試劑對照實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)二TCA(mL)3激活劑、酪蛋白（mL）1（激活劑）1 （酪蛋白）11： 5 酶液（ mL ）0.50.50.5激活劑（ mL ）0.50.50.537 10min水浴TCA(mL)33靜置 10min濾紙過濾OD 275nm 石英比色杯酶活單位：在上述條件下(37 , 酶促反應(yīng) 10min)，每 10min增加 0.01個光吸收值的酶量為一個酶活力單位（ U ）。4 透析去鹽把測酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中, 系緊 ,置于蒸餾水的1000mL的燒杯中 , 置于磁力攪拌機(jī)上 , 進(jìn)行透析。每15min 用 BaCl 檢測，直到無沉淀產(chǎn)生時，停止透析。或靜止透析2 3 天。準(zhǔn)備 8 支試管， 每 15min 從燒杯中吸取2ml 透析蒸餾水與試管中，用 BaCl 檢測沉淀產(chǎn)生的情況， 用“+”表示渾濁度。5 測透析后的蛋白質(zhì)的含量方法同 2 果實(shí)菠蘿蛋白酶樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定（每組）八 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行分析，討論實(shí)驗(yàn)結(jié)