臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理方法及檢測(cè)

1、臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理、分析方法及檢測(cè)技術(shù)中國(guó)中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院臨床檢測(cè)中心 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是把化學(xué)(分析技術(shù))和生物化學(xué)(實(shí)驗(yàn)反應(yīng)原理)的方法應(yīng)用于疾病的診斷、治療、監(jiān)控的實(shí)驗(yàn)分支。一個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的最后測(cè)定結(jié)果應(yīng)包括四大部分來(lái)完成。一、 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)原理及分析方法（理論依據(jù)）二、 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)（手段）生化儀的分析技術(shù)。三、 質(zhì)量控制程序（質(zhì)量保證）室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)、儀器、試劑、人員五要素。四、 臨床意義（目的）咨詢服務(wù)、異常結(jié)果的解釋。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)原理及分析方法(理論依據(jù))一個(gè)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)原理設(shè)計(jì)，首先要找出所檢測(cè)的化學(xué)特性，如測(cè)定體液（首先是血液）中酶的含量血液中除少數(shù)酶（如凝血溶血酶、銅氧化

2、酶及假性膽堿脂酶等）含量較多外，血液正常生理狀況下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接測(cè)定如此微量物質(zhì)是相當(dāng)困難的。用免疫化學(xué)方法可測(cè)定全部酶蛋白分子含量（不論其有無(wú)活性）而用化學(xué)方法測(cè)定只能測(cè)定酶的催化活性，間接計(jì)算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性這一特性，在臨床上已普遍應(yīng)用測(cè)定酶蛋白，同時(shí)還可以測(cè)定三大代謝的產(chǎn)物，如糖、脂類、蛋白質(zhì)、這樣也就建立起利用酶促反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)測(cè)定代謝物的方法。一級(jí)反應(yīng)反應(yīng)速度與底物濃度成正比，因此只有當(dāng)酶反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)時(shí)，才能準(zhǔn)確測(cè)定底物含量，（如測(cè)定血糖、總甘油三脂、總膽固醇等）。從此在臨床試劑盒的方法中出現(xiàn)了以酶為試劑測(cè)定各種代謝產(chǎn)物。臨床

3、化學(xué)方法的分類特別是自動(dòng)生化儀方法的特點(diǎn)以往臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)都采用比色法進(jìn)行各個(gè)項(xiàng)目的測(cè)定，這是因?yàn)楸壬ň哂形⒘俊⒀杆?、?zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，特別適合于微量的生物體體液中各項(xiàng)物質(zhì)測(cè)定。在一般比色法中，手工使用比色計(jì)或分光光度計(jì)可以測(cè)定各種反應(yīng)溶液的吸光度，但由于很難控制測(cè)定時(shí)間和反應(yīng)溫度，很難準(zhǔn)確記錄反應(yīng)過(guò)程中吸光度變化，因此，毫不奇怪在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)我們所使用的方法，都是在呈色反應(yīng)達(dá)到完全或者反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，吸光度達(dá)到穩(wěn)定時(shí)才進(jìn)行測(cè)定。即所謂平衡法或終點(diǎn)法。但自從自動(dòng)生化儀出現(xiàn)后，從根本上改變了上述情況。通過(guò)各項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)，人們可以精確測(cè)定反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。并可以準(zhǔn)確計(jì)算任何一段反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率，這樣大

4、大開(kāi)闊了臨床化學(xué)家對(duì)方法選擇。除經(jīng)典的終點(diǎn)法外還可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定。這樣不僅縮短了操作時(shí)間，大大提高了工作效率，還可進(jìn)行一些用常規(guī)比色方法不能進(jìn)行的測(cè)定。如測(cè)定酶反應(yīng)的初速度（Vo）等等。測(cè)酶初速度（Vo）只能用分光光度法。因此，用好自動(dòng)生化儀一個(gè)重要前提必須對(duì)自動(dòng)生化儀可以提供的測(cè)試方法類型有所了解。生化自動(dòng)分析儀特點(diǎn)：1 精確測(cè)定反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程；2 準(zhǔn)確計(jì)算任何一段反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率；3 除經(jīng)典的終點(diǎn)法外還可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定。分析方法的分類臨床化學(xué)常用方法按表1分類：表1 分析方法分類分析方法中的測(cè)定步驟 物理化學(xué)方法 物理方法平衡法 動(dòng)態(tài)法 平衡法 動(dòng)態(tài)法 可變信號(hào)法 固定信號(hào)法 在臨床化

5、學(xué)中絕大多數(shù)方法都是所謂物理化學(xué)方法。也就是將所測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行一些化學(xué)轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行測(cè)定。例如在實(shí)際工作中測(cè)膽紅質(zhì)，不是直接在n m測(cè)定，而是先進(jìn)行重氮化反應(yīng)后比色定量測(cè)定生成的有色偶氮化合物。絕大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)都經(jīng)歷一個(gè)類似圖1的反應(yīng)過(guò)程。圖中虛線明顯將反應(yīng)分為二個(gè)截然不同時(shí)期，左面期中所測(cè)的產(chǎn)物濃度在不斷變化之中，由傳感（Sensor）所得到的信號(hào)也在相應(yīng)改變之中。如所用的方法主要是根據(jù)這期間所獲得的信號(hào)進(jìn)行計(jì)算，這稱之為動(dòng)態(tài)法。相應(yīng)在圖中虛線右邊時(shí)期，傳感器所得到信號(hào)相對(duì)不變，如根據(jù) 這些信號(hào)計(jì)算的方法稱之為平衡法。從科學(xué)上說(shuō)此術(shù)語(yǔ)顯然比終點(diǎn)法更為確切，因?yàn)樾盘?hào)無(wú)變化，不一定意味著反應(yīng)完全達(dá)到

6、終點(diǎn)。正因?yàn)樵谶@期內(nèi)傳感器所得到信息變化不大，因此對(duì)測(cè)定的條件如時(shí)間，濃度，PH要求遠(yuǎn)沒(méi)有動(dòng)態(tài)法那樣嚴(yán)格，所以不要求特殊儀器，而且精密度較高，非常適宜于一般儀器和實(shí)驗(yàn)室使用。圖1也同樣適用于酶催化的反應(yīng)，在動(dòng)態(tài)期酶所催化產(chǎn)化的物質(zhì)處在一個(gè)動(dòng)態(tài)變化之中，在酶作用一段時(shí)間后，由于基質(zhì)消耗逆反應(yīng)出現(xiàn)，底物的抑制作用等，反應(yīng)速率愈來(lái)愈慢，最后達(dá)到平衡期。此時(shí)基質(zhì)和產(chǎn)物濃度不出現(xiàn)變化，因此很清楚如要測(cè)酶活性，只能在動(dòng)態(tài)期測(cè)定酶所催化反應(yīng)的速率。所以嚴(yán)格說(shuō)測(cè)酶方法不論用自動(dòng)生化儀，記錄或分光光度計(jì)或普通比色計(jì)都包括在動(dòng)態(tài)法的范圍內(nèi)。平衡法（終點(diǎn)法） 這是目前我國(guó)生化實(shí)驗(yàn)室常用也是大家所熟悉的方法。其特點(diǎn)是

7、對(duì)測(cè)定條件尤其是測(cè)定時(shí)間和溫度要求不嚴(yán)格，所以容易掌握，計(jì)算結(jié)果方便，精密度好，但由于反應(yīng)達(dá)到平衡需要一定時(shí)間，一般都需十分鐘以上，因此整個(gè)操作時(shí)間長(zhǎng)，工作效率低，目前不少自動(dòng)生化儀特別是離心式分析儀改用動(dòng)態(tài)法。即使采用平衡法時(shí)也對(duì)方法進(jìn)行修改，設(shè)法縮短動(dòng)態(tài)期。例如同是糖激酶葡萄糖6磷酸脫氫酶法測(cè)血糖，手工法往往需15分鐘后比色，但在自動(dòng)生化儀中由于加大工具酶用量，在3分鐘內(nèi)就達(dá)到終點(diǎn)。另外應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)在每一個(gè)標(biāo)本達(dá)到平衡時(shí)就可分別進(jìn)行終點(diǎn)測(cè)定。近年來(lái)有一種傾向就是將特異性較差的化學(xué)法改為特異性酶法。即以酶作為試劑來(lái)測(cè)定血中各種代謝物質(zhì)。這類方法和經(jīng)典的平衡法有所區(qū)別，下面做一個(gè)簡(jiǎn)單敘述：這

8、類方法特點(diǎn)是被測(cè)物質(zhì)（酶反應(yīng)的基質(zhì)）在酶反應(yīng)過(guò)程中完全被轉(zhuǎn)化或消耗掉（即達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)），通常這類方法操作簡(jiǎn)單，一般不需要作標(biāo)準(zhǔn)管，通過(guò)一些已知的理化常數(shù)例如克分子吸光系數(shù)等不難將結(jié)果計(jì)算出來(lái)，其缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，特別不適合于離心式自動(dòng)分析儀。另有少數(shù)酶反應(yīng)，基質(zhì)并未完全消耗掉，只是達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)往往需要同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)管。動(dòng)態(tài)法(連續(xù)監(jiān)測(cè)法)動(dòng)態(tài)法即根據(jù)某一物質(zhì)對(duì)一個(gè)反應(yīng)的催化或延緩作用來(lái)測(cè)定期含量，這是通過(guò)秒表測(cè)量反應(yīng)延緩時(shí)間而達(dá)到此點(diǎn)。從六十年代開(kāi)始，動(dòng)態(tài)法得到迅速發(fā)展，這是由于一系列高技術(shù)發(fā)展的結(jié)果：出現(xiàn)了高質(zhì)量的電化學(xué)和比色傳感器，溫度控制的比色杯，迅速混勻技術(shù)，以及自動(dòng)數(shù)據(jù)處理系

9、統(tǒng)等，人們避免了繁雜的計(jì)算，可以迅速直接得到測(cè)定結(jié)果，滿足了臨床醫(yī)學(xué)大量生化標(biāo)本的要求。反之動(dòng)態(tài)法的使用也大大推動(dòng)臨床化學(xué)發(fā)展，僅用有限人力可以測(cè)定成十倍原來(lái)的工作量。如測(cè)酶活性全部使用此方法。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)（生化分析儀的分析原理）人體的供能、合成與代謝是由、糖（碳水化合物）、蛋白質(zhì)、脂肪來(lái)完成的。臨床上蛋白質(zhì)的檢測(cè)是測(cè)定蛋白質(zhì)的20多種氨基酸，采用的是吸收光譜和分光光度法。生化分析儀的組成：分析系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（計(jì)算機(jī)、顯示器、打印機(jī)）附件等。全自動(dòng)生化分析儀還配有電解質(zhì)系統(tǒng)（ISE）。生化分析儀適用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室血液中物質(zhì)含量的測(cè)定，也可測(cè)定體液中小分子量的物質(zhì)。生化分析儀最簡(jiǎn)單的測(cè)定原理單

10、色光測(cè)定反應(yīng)物濃度的吸光度OD值。比色分析的基本原理許多化學(xué)物質(zhì)的溶液具有顏色（無(wú)色的化合物也可以加顯色劑經(jīng)反應(yīng)生成有色物質(zhì)），當(dāng)有色溶液的溶度改變時(shí)，顏色的深淺也隨之改變，濃度愈大，顏色愈深。因此，可以用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度。這種方法叫做比色分析法。一、 朗伯比爾定律當(dāng)一束單色光通過(guò)有色溶液時(shí)，入射光線的一部分被器皿反射回來(lái)，一部分被溶液吸收，另一部分則透過(guò)溶液，如圖所示。他們之間有以下關(guān)系：波長(zhǎng)的選擇：由于在實(shí)際測(cè)定時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液都要加以稀釋，而且在報(bào)告結(jié)果時(shí)，多以100毫升（或1000毫升）中的含量來(lái)表示。因此，在實(shí)際計(jì)算時(shí)，就需要在上式中乘上稀釋因數(shù)。求待

11、測(cè)溶液濃度的方法有：直接比較法（計(jì)算法）、因數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法三種。這些方法在“生物化學(xué)及生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)”課程中有介紹。波長(zhǎng)的選擇：由于有色溶液對(duì)光的吸收具有選擇性，因此進(jìn)行比色測(cè)定時(shí)，濾光片必須加以選擇，否則靈敏度很低，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。選擇濾光的一般原則是：濾光片最大透過(guò)的光線應(yīng)該是溶液最大吸收的光線。從顏色上看，濾光片的顏色與待測(cè)溶液的顏色應(yīng)為“互補(bǔ)色”。什么叫做互補(bǔ)色呢？凡是兩種顏色相加后能得到白色，則此兩種顏色就稱為“互補(bǔ)色”，圖中直接相對(duì)的兩種顏色，均為互補(bǔ)色。 綠 黃 青青藍(lán) 白橙 藍(lán) 紅 蘭 紫為什么選擇濾光片時(shí)，要使濾光片的顏色與待測(cè)溶液的顏色為互補(bǔ)色呢？這是因?yàn)闉V光片和有

12、色溶液具有相似的透光特性，與它們本身顏色相同的色光，能夠最大限度地透過(guò)。而與它們本身顏色成互補(bǔ)的色光都能被最大地吸收。待測(cè)溶液和濾光片的顏色待測(cè)溶液顏色濾光片波長(zhǎng)范圍（nm）顏色綠紫300-400黃 綠 青 紫430-440黃蘭440-450橙 紅蘭 綠450-480紅綠 蘭490-530青 紫黃 綠540-560蘭黃570-600 蘭 綠 橙 紅600-630綠 蘭紅630-780質(zhì)量控制程序（質(zhì)量保證） 室內(nèi)質(zhì)控IQC包括精密度，一般用CV%。 室間質(zhì)評(píng)EQC包括準(zhǔn)確度，一般用偏差。 參考系統(tǒng)的選擇及溯源性包括儀器自身校準(zhǔn)溯源及國(guó)家的溯源系統(tǒng)。 檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及儀器的校準(zhǔn)。自動(dòng)生化分析

13、儀使用中的校準(zhǔn) 對(duì)自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)系統(tǒng)精密度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證。儀器、試劑、校準(zhǔn)品、操作程序等的組合為檢測(cè)系統(tǒng)。生化室自定了檢測(cè)系統(tǒng)并使用了帶溯源性的儀器、試劑、校準(zhǔn)品、操作程序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠的溯源性。檢測(cè)系統(tǒng)包括四部分外，手工操作還必須包括具體操作人員。所以我們認(rèn)為在檢測(cè)系統(tǒng)中任何一個(gè)組分的改變，都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。在確定儀器、試劑等的性能其實(shí)都是組合的檢測(cè)系統(tǒng)的共有性能。建立校準(zhǔn)方法，選擇合適的校（標(biāo)）準(zhǔn)品，包括校（標(biāo)）準(zhǔn)品的樹(shù)木、類型和濃度；如有可能，校（標(biāo)）準(zhǔn)品應(yīng)溯源到參考方法和/或參考物質(zhì)；確立校準(zhǔn)的頻度。校準(zhǔn)驗(yàn)證：有可能，方法應(yīng)追溯到參考方法或已知值的參考品；確定校（標(biāo)）準(zhǔn)品的數(shù)目

14、，類型和濃度，校準(zhǔn)驗(yàn)證的接受限，以及校準(zhǔn)驗(yàn)證的頻度；確定檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告范圍，確定時(shí)必須包括一個(gè)最小值（或零），和此范圍上限的最大值。至少每六個(gè)月以及有下列情況發(fā)生時(shí)，進(jìn)行一次校準(zhǔn)：改變?cè)噭┑姆N類，或者批號(hào)。但如實(shí)驗(yàn)室能說(shuō)明改變?cè)噭┡?hào)并不影響結(jié)果的準(zhǔn)確，則可以不進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器或者檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行過(guò)一次大的預(yù)防性維護(hù)或者更換了重要部件，這些都有可能影響檢測(cè)性能。質(zhì)控反映出異常的趨勢(shì)或偏移；或者超出了實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的接受限、采取一般性糾正措施后，不能識(shí)別出和糾正問(wèn)題時(shí)。所有進(jìn)行過(guò)的校準(zhǔn)和校準(zhǔn)驗(yàn)證工作都必須記錄并寫成文件。1. 酶活力單位的計(jì)算。國(guó)際單位規(guī)定一個(gè)國(guó)際單位為在實(shí)驗(yàn)室規(guī)定條件下（如37C、最適合

15、的PH、最適底物濃度時(shí)（每分鐘催化一個(gè)微摩爾底物變化所需要的酶量。2. 什么是法定計(jì)量單位。一般采用摩爾單位，凡分子量已知的物質(zhì)算出相對(duì)分子量（Mr）或相對(duì)原子量（Ar）。mg/dl與mmol/L的換算，求出系數(shù)。3. 實(shí)驗(yàn)中盡量避免基質(zhì)效應(yīng)。體外診斷試劑盒性能指標(biāo)以O(shè)LYMPUS生產(chǎn)的甘油三脂試劑盒為例。分析批內(nèi)CV3%，總精密度CV5%，30天定標(biāo)一次原廠家定標(biāo)液，溯源追蹤到CAP的血清脂類RMO16#2，更換試劑批號(hào)，質(zhì)控出現(xiàn)漂移，儀器做保養(yǎng)后重要零件更換時(shí)作定標(biāo)。線性范圍10至1000mg/dl，用mmol/L報(bào)告時(shí) x 0.0113。干擾性 乳糜達(dá)到500mg/dl影響7% 膽紅素達(dá)

16、到32mg/dl影響10% 抗壞血酸達(dá)到20mg/dl影響1%病人準(zhǔn)備：1014小時(shí)進(jìn)食，如用血漿肝素和EDTA抗凝。標(biāo)本穩(wěn)定性4度穩(wěn)定7天，20度穩(wěn)定3個(gè)月。為什么要定標(biāo)？多長(zhǎng)時(shí)間要定標(biāo)一次？定標(biāo)的意義：定標(biāo)就是要找出一個(gè)參考點(diǎn)，就是一個(gè)K值（或F值）。它是由儀器與試劑狀態(tài)確定下來(lái)的。當(dāng)我們測(cè)定一個(gè)標(biāo)本時(shí)，無(wú)論您是用手工的方法或全自動(dòng)生化分析儀，測(cè)出來(lái)的值只是一個(gè)吸光度，這個(gè)吸光度對(duì)我們沒(méi)有什么意義，我們要把這個(gè)吸光度轉(zhuǎn)化成一個(gè)濃度或是酶的活性。那就要乘上一個(gè)K值，計(jì)算并打印出來(lái)的結(jié)果對(duì)我們就有意義了。K值就是我們通過(guò)定標(biāo)找出來(lái)的。一般上最低要求是由試劑空白與標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)過(guò)儀器測(cè)定出兩個(gè)吸光度

17、。標(biāo)準(zhǔn)濃度試劑空白K=A標(biāo)準(zhǔn)A試劑空白 （試劑空白通常是0） 標(biāo)準(zhǔn)液的濃度我們是知道的，這兩個(gè)吸光度可以由儀器測(cè)出，這樣就得出一個(gè)K值。無(wú)論什么樣的標(biāo)本，用其吸光度乘以K值我們就得到了答案。因此，K值具有非常決定性的意義，可以決定標(biāo)本的準(zhǔn)確性。K值的決定因素：我們看看K值會(huì)受到什么影響呢？第一，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度一定要準(zhǔn)確（標(biāo)準(zhǔn)液最好與標(biāo)本一樣是以血清為基質(zhì)的）。第二，標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與試劑空白的吸光度一定要準(zhǔn)確。吸光度受儀器狀況、試劑狀況的影響，如果您的儀器相當(dāng)穩(wěn)定，試劑是影響K值的一個(gè)主要因素。如何確定K值是正確的？一般我們用質(zhì)控血清來(lái)檢查，最好是兩種水平的質(zhì)控來(lái)檢查，如果質(zhì)控結(jié)果很好，可以說(shuō)K值

18、是準(zhǔn)確的，用這個(gè)K值計(jì)算出來(lái)病人的結(jié)果也是準(zhǔn)確的，所以K值非常關(guān)鍵。K值的真面目：K值實(shí)際上代表了斜率，截距代表試劑空白，試劑空白每天都在變化，所以K值的穩(wěn)定性決定您的儀器與試劑，如果儀器與試劑都十分穩(wěn)定，那K值也很穩(wěn)定。多長(zhǎng)時(shí)間定一次標(biāo)合適？這要看您試劑的穩(wěn)定性，質(zhì)控結(jié)果不好，有些項(xiàng)目做試劑空白可以解決，有些項(xiàng)目要做兩點(diǎn)定標(biāo)。TV 1000酶的項(xiàng)目如何確定K值：一是計(jì)算出來(lái)的理論K值；SV L K = 二是用有酶項(xiàng)目的定標(biāo)液得出K值：目前各公司可以提供多項(xiàng)目的定標(biāo)液，不僅有底物類的項(xiàng)目，也有酶類的項(xiàng)目。測(cè)定特種蛋白為什么要用多點(diǎn)定標(biāo) 透射免疫比濁時(shí)，由于抗原與抗體結(jié)合的過(guò)程中，吸光度與濃度之間不成線性關(guān)系，一般是三次方程曲線關(guān)系。若要將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜?lái)，需要經(jīng)過(guò)三次方程擬合成近似直線化的方程，在進(jìn)行運(yùn)算，免疫比濁實(shí)際操作過(guò)程中可采用終點(diǎn)法或速率