分子遺傳學(xué)部分重點

1、典型的真核基因的結(jié)構(gòu)斷裂基因（Interrupted gene）包括外顯子序列、轉(zhuǎn)錄區(qū)前后對于基因表達(dá)具有調(diào)控功能的序列和外顯子間的間隔序列(內(nèi)含子)將基因組DNA在介質(zhì)氯化銫（CsCl）中作密度梯度離心可以看到在一條主帶以外還有一個或多個小的衛(wèi)星帶，這些在衛(wèi)星帶中的DNA即被稱為衛(wèi)星DNA，這種DNA的GC含量一般少于主帶中的DNA，浮力密度也低。高度可變小衛(wèi)星DNA（可變數(shù)目串連重復(fù)序列，variable number of tandem repeat，VNTR），呈高度多態(tài)性，可作遺傳標(biāo)記微衛(wèi)星DNA（短串聯(lián)重復(fù)，short tandem repeat，STR呈高度多態(tài)性，可作遺傳標(biāo)記

2、串聯(lián)重復(fù)序列長度多態(tài)性（VNTR、STR）在人群中以孟德爾共顯性的方式遺傳 可用于標(biāo)記遺傳物質(zhì)（染色體）的在世代間傳遞基因簇與串聯(lián)重復(fù)拷貝基因的區(qū)別：基因簇（gene cluster）：由一個祖先基因的復(fù)制和趨異形成，基因簇中每個基因成員間相似但不完全相同（DNA序列或表達(dá)譜），基因簇中可能存在假基因。串聯(lián)重復(fù)拷貝基因（如rRNA基因）每個拷貝轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物完全相同，其產(chǎn)物如同由一個基因轉(zhuǎn)錄而來?；蚣易澹╣ene family）：一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。 同一家族中的成員排列在一起基因簇 更多時候分散在染色體的不同部位，具有各自的表達(dá)調(diào)控模式基因超家族（gene super-fa

3、mily） ：一組由序列的同源性定義，通過序列比對可以彼此匹配而相關(guān)的基因。 決定同源的主要標(biāo)準(zhǔn)是核苷酸（氨基酸）殘基的保守性 不同成員間功能可以相關(guān)也可以不相關(guān)在進(jìn)化過程中失去功能的基因成為假基因。假基因特點：不能轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄后不能產(chǎn)生有功能蛋白產(chǎn)物兩類假基因（pseudogene）基因復(fù)制產(chǎn)生假基因；反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座產(chǎn)生假基因（加工過的假基因，processed pseudogene）重組與轉(zhuǎn)座是基因與基因組進(jìn)化的主要動力，自然選擇決定進(jìn)化方向。轉(zhuǎn)座子（Transposon）：存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位?；蚪M中存在的兩類轉(zhuǎn)座子：DNA轉(zhuǎn)座子；反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子人類基因組中存在三種主

4、要的遺傳變異1.簡單重復(fù)序列長度多態(tài)性（simple sequence repeat，SSR） 高度可變小衛(wèi)星DNA（variable number of tandem repeat，VNTR） 微衛(wèi)星DNA（短串聯(lián)重復(fù)，short tandem repeat，STR） 在基因組中散在分布，平均每100-200kb有一個SSR 多態(tài)性表現(xiàn)為串連重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)可變，即重復(fù)單元的拷貝數(shù)不同2.單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）定義：出現(xiàn)在基因組DNA分子的特定位置的單個核苷酸置換3.低頻率核苷酸置換和微小DNA序列變異（即突變，通常呈散發(fā)，絕

5、大多數(shù)有害）遺傳標(biāo)記（Genetic Markers）：指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段、某個等位基因（allele）在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性。STR與SNP是最常用的遺傳多態(tài)性標(biāo)記。可做標(biāo)記的有：VNTR，STR，SNP。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）：研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因功能的可逆的、可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。也指生物發(fā)育過程中包含的程序的研究?；蛘叨x為：基因表達(dá)通過有絲分裂或減數(shù)分裂發(fā)生了可遺傳的改變 , 而 DNA 序列不發(fā)生改變。染色質(zhì)由：DNA、蛋白質(zhì)(組蛋白、非組蛋白)、cRNA組成，DNA、組

6、蛋白為修飾位點。表觀遺傳修飾的位點1.DNA甲基化（胞嘧啶5-甲基胞嘧啶，大部分發(fā)生在CpG島（CpG island，基因組中CpG序列高頻出現(xiàn)的區(qū)域），通常引起轉(zhuǎn)錄抑制）2.核心組蛋白的共價修飾 甲基化（methylation） 乙?；╝cetylation） 磷酸化（phosphorylation）DNA與核心組蛋白的共價修飾是表觀遺傳學(xué)的分子基礎(chǔ)常染色質(zhì)（euchromatin）；異染色質(zhì)（heterochromatin）活性染色質(zhì)（active chromatin）：具有轉(zhuǎn)錄等功能活性的常染色質(zhì) 。非活性染色質(zhì)（inactive chromatin）：不具有轉(zhuǎn)錄等功能活性的染色質(zhì)，包

7、括異染色質(zhì)和部分常染色質(zhì)。表觀遺傳學(xué)修飾與染色質(zhì)活性狀態(tài)：1.活性染色質(zhì)：DNA無甲基化修飾；組蛋白乙?；揎?；結(jié)合的非組蛋白(組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、RNA聚合酶復(fù)合體)2.非活性染色質(zhì)：DNA甲基化修飾（CpG島）；組蛋白去乙?；揎?；組蛋白甲基化修飾；結(jié)合的非組蛋白（組蛋白去乙?；浮⒔M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、異染色質(zhì)結(jié)合蛋白）染色質(zhì)的基本組成單位核小體（nucleosome）核心組蛋白與核小體組裝，基本組裝單位：H3-H4四聚體絕緣子（insulator）：能阻斷基因激活或失活效應(yīng)的DNA元件，通過結(jié)合特異蛋白發(fā)揮功能?；蚪M印跡（genomic imprinting

8、）：兩個親本等位基因的差異性甲基化導(dǎo)致遺傳自雙親的等位基因間表達(dá)行為存在差異（一個親本等位基因沉默，另一個親本等位基因保持單等位基因活性）。通過表觀遺傳修飾機制異常而發(fā)病的遺傳疾病舉例脆性X染色體綜合癥（fragile X syndrome）病因：FMR-1（fragile X mental retardation 1）基因5端(CGG)n重復(fù)序列動態(tài)突變致基因表達(dá)沉默 (CGG)n重復(fù)650次正常人； (CGG)n重復(fù)52200次前突變（premutation）； (CGG)n重復(fù)2002000次(CGG)n中的CpG甲基化基因轉(zhuǎn)錄失活患者智力低下。真核細(xì)胞RNA種類 結(jié)構(gòu)性RNA（占細(xì)胞總

9、RNA的95%） 核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA） 轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA） 核小RNA （small nuclear RNA，snRNA） 核仁小RNA （small nucleolar RNA，snoRNA） 功能性RNA（不均一RNA，占細(xì)胞總RNA的5% ） 信使RNA（messenger RNA，mRNA）及其前體 非編碼RNA（non-coding RNA）及其前體 microRNA lncRNA （long non-coding RNA）真核生物含有三種RNA聚合酶 RNA polymerase轉(zhuǎn)錄45S rRNA前體（結(jié)構(gòu)性RNA）

10、RNA polymerase轉(zhuǎn)錄mRNA、pri-microRNA、lncRNA（不均一RNA，功能性RNA），snRNA（U1U5）、snoRNA RNA polymerase轉(zhuǎn)錄tRNA、5S rRNA、snRNA（U6）RNA轉(zhuǎn)錄過程與調(diào)控： 啟動RNA轉(zhuǎn)錄的必要條件 染色質(zhì)重構(gòu)產(chǎn)生活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)【染色質(zhì)表觀修飾形成活性染色質(zhì)】 反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子、輔激活子）識別并結(jié)合啟動子/增強子上的順式作用元件【染色質(zhì)重構(gòu)暴露順式作用位點反式作用因子特異識別并結(jié)合順式作用元件】 募集特定RNA聚合酶到轉(zhuǎn)錄起始點 轉(zhuǎn)錄過程 起始（initiation） 延伸（elongation） 終止（term

11、ination） RNA轉(zhuǎn)錄后需進(jìn)行加工與轉(zhuǎn)運mRNA前體（不均一RNA）內(nèi)含子邊界序列遵守GU-AG規(guī)則擺動學(xué)說：密碼子與反密碼子的配對原則配對時前兩位的堿基是按常規(guī)堿基配對原則配對（G-C，A-U），而第三位堿基配對發(fā)生擺動現(xiàn)象（G-U，I-U/C/A配對）microRNA對RNA翻譯調(diào)控機制： microRNA與靶mRNA的3非翻譯區(qū)不完全互補配對，通過RISC復(fù)合物抑制mRNA翻譯 核心配對區(qū)：microRNA 5端2-8位核苷酸，通常全部配對 microRNA與靶mRNA完全互補配對導(dǎo)致mRNA降解（高等動物不常見）真核細(xì)胞mRNA翻譯機制： 翻譯的起始（initiation） 起始

12、密碼子AUG，起始子tRNAiMet不同于普通tRNAMet 起始過程需特異起始因子（eIFs）參與 40S小亞基結(jié)合mRNA5端，掃描mRNA直至找到翻譯起始點 翻譯的延伸（elongation） 延伸過程需特異延伸因子（eEFs）參與 延伸過程中：氨酰tRNA A site P site E site轉(zhuǎn)位，新生肽鏈P site A site轉(zhuǎn)位 60S大亞基rRNA提供肽基轉(zhuǎn)移酶活性 翻譯的終止（termination） 終止密碼子：UAA、UAG、UGA 釋放因子（eRF）識別A位點終止密碼子，解體翻譯復(fù)合物，釋放新生肽鏈核糖體：原核生物：蛋白少，RNA：30s, 50s, 70s 真核

13、生物：蛋白多，RNA：40s, 60s, 80s細(xì)胞通訊（cell communication）：多細(xì)胞生物的細(xì)胞社會中, 細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息交流（一部分細(xì)胞發(fā)出信號，另一部分細(xì)胞接收信號并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞功能變化的過程）。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）：針對外源信息所發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的全過程（代謝改變、增殖、凋亡等，一個細(xì)胞內(nèi)部的反應(yīng)）。 細(xì)胞通訊的三種類型 間隙連接通訊（gap junction）6個連接蛋白（connexin）構(gòu)成貫通兩個細(xì)胞之間的親水性孔道 接觸通訊 化學(xué)通訊（分泌的信號分子介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊）：神經(jīng)遞質(zhì)；激素、局部介質(zhì)配體與受體配體（ligand）

14、：信號分子 小分子【例：乙酰膽堿、腎上腺素】 多肽【例：胰島素】 膜表面分子【例：Delta/Jagged分子】 細(xì)胞外基質(zhì)【例：層粘連蛋白（Laminin）】受體（receptor）：信號分子的接收分子，本質(zhì)是蛋白質(zhì) 細(xì)胞表面受體 細(xì)胞內(nèi)受體（核受體）第二信使（second messenger）定義：細(xì)胞表面受體接受細(xì)胞外信號后，最早在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)或胞漿中出現(xiàn)的由胞外信號轉(zhuǎn)換而來的信號分子。特點： 第二信使都是小的分子或離子 第二信使是僅在細(xì)胞內(nèi)部起作用的信號分子細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使: cAMP（環(huán)腺苷酸，cyclic AMP） cGMP （環(huán)鳥苷酸，cyclic GMP） IP3（1,4,5

15、-三磷酸肌醇，inosositol 1,4,5-trisphosphate） DAG （ 1, 2-二酰甘油，diacylglycerol ） PIP3 NO Ca2+（第三信使）信號通路： 核受體 離子通道型受體 G蛋白偶聯(lián)受體 受體酪氨酸激酶（RTK） 受體絲氨酸/蘇氨酸激酶（TGF-/BMP-Smad）1. 核受體：受體與激素結(jié)合后構(gòu)象變化，暴露核定位信號與DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)位入核。三類核受體超家族（據(jù)配體類型分類）：類固醇激素受體：糖皮質(zhì)激素受體、鹽皮質(zhì)激素受體、雌激素受體、雄激素受體非類固醇激素受體：甲狀腺激素受體孤兒核受體：指至目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)配體的一類核受體成員2. 離子通道型受

16、體/配體門通道離子通道型受體分類 陽離子通道：如乙酰膽堿、谷氨酸和五羥色胺的受體 陰離子通道：如甘氨酸和氨基丁酸的受體 分布：主要存在于神經(jīng)、肌肉等可興奮細(xì)胞 功能：傳導(dǎo)神經(jīng)沖動（電信號） 配體：主要為神經(jīng)遞質(zhì)3. G蛋白偶聯(lián)受體 G蛋白：異源三聚體：、亞基。不同亞類亞基/亞基激活不同信號通路：Gs、Gq、Gi血管舒張信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)機制： 血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上乙酰膽堿能受體（M型）激活Gq信號途徑 胞內(nèi)Ca2+的濃度，激活一氧化氮合酶（eNOS），NO濃度 NO擴散至鄰近的血管平滑肌細(xì)胞，激活可溶型NO受體鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），胞內(nèi)cGMP濃度 cGMP通過PKG依賴與非依賴途徑發(fā)揮舒張血管平【即

17、Gq途徑受體鳥苷酸環(huán)化酶通路】DNA指紋圖譜(DNA fingerprint)：基礎(chǔ)：RFLP個體的DNA用限制酶酶切后，片段數(shù)目和長度具有高度個體差異，經(jīng)凝膠電泳或以特定探針做Sourthern雜交，會產(chǎn)生具有高度個體差異的譜帶。 特點：1.兩個人DNA指紋圖完全相同的概率為三千億分之一；兩個同胞個體具有相同指紋圖的概率為二百萬分之一2.DNA指紋圖中的條帶是可遺傳的、后代圖中的每一條帶都可以在雙親之一的圖中找到3.同一個體的不同組織產(chǎn)生的DNA指紋圖完全相同，同卵雙胞胎的DNA指紋完全相同。1、ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法）將人體細(xì)胞從體內(nèi)取出, 基因改造, 再移植到人體中。2、in

18、 vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法）直接將基因轉(zhuǎn)移到人體中, 如DNA注射,口服, 噴霧等。 有如普通治療藥物, 商業(yè)化發(fā)展方向所在。cDNA指與RNA鏈互補的單鏈DNA,以其RNA為模板,在適當(dāng)引物的存在下,由RNA與DNA進(jìn)行一定條件下合成的DNA。cDNA文庫：以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化,在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNAi:RNA 干擾區(qū)別點細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死起因生理或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生病理性刺激因子誘導(dǎo)或劇烈損傷范圍單個細(xì)胞丟失大片組織或成群細(xì)胞死亡細(xì)胞形態(tài)膜皺縮，體積變小體積膨大，變性細(xì)胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質(zhì)凝集，在核膜周圍呈新月形帽狀結(jié)構(gòu)分布不凝集，呈

19、絮狀細(xì)胞器無明顯變化膨大和破碎凋亡小體有，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬無，細(xì)胞自溶，殘余碎片被巨噬細(xì)胞吞噬基因組DNA規(guī)律性降解，電泳呈梯狀隨機降解，電泳呈涂抹狀蛋白質(zhì)合成有無炎癥反應(yīng)無，不釋放細(xì)胞內(nèi)含物有，釋放細(xì)胞內(nèi)含物分子機制與蛋白酶caspases基因家族有關(guān)與蛋白激酶RIP3表達(dá)有關(guān)調(diào)往小體：凋亡會染色體固縮，染色加深，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。指細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞萎縮、碎裂，形成的有膜包圍的，內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體。，可被吞噬細(xì)胞所吞噬。cyclin:細(xì)胞周期蛋白：與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期呈模同步周期性濃度升降的蛋白質(zhì)，包括：周期蛋白質(zhì)A、B、D、E、G及H。它們與關(guān)鍵的

20、蛋白質(zhì)激酶（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，cyclin-dependent kinases,CDKs）結(jié)合，并調(diào)節(jié)它們的酶活性，從而幫助推動和協(xié)調(diào)細(xì)胞周期的進(jìn)行。 P53促凋亡機制 1. P53通過與Bcl-2基因相互作用，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。2. P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的靶蛋白表達(dá)（線粒體和死亡受體介導(dǎo)）。3. P53誘導(dǎo)線粒體內(nèi)凋亡的相關(guān)蛋白（Bax、NOXA、 PUMA）表達(dá)，并觸發(fā)細(xì)胞色素C釋放和caspase活化。4. P53誘導(dǎo)死亡受體Fas表達(dá)。5. P53能使死亡受體再定位于細(xì)胞膜上。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制酶識別位點上，酶切該DNA會產(chǎn)生長度不同的片斷，稱為限制性片段長度多態(tài)性 (

21、restrictionfragment lengthpolymorphsm, RFLP)。單鏈DNA堿基序列不同，甚至單個堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在電泳時泳動速率不同，稱單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)。PCR-ASO探針雜交法：PCR產(chǎn)物的等位基因特異寡核苷酸探針雜交法：根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成2種寡核苷酸探針：突變和正常ASO探針，變性單鏈，NC膜上，雜交。核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過程中，把不同DNA單鏈分子放在同一

22、溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可在不同的分子之間形成雜化雙鏈的這種現(xiàn)象。雜交的原理實質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程Blotting 印跡：將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固相化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。反向PCR：InversePCR：在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。兩引物3端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段。asymmetric PCR 不對稱

23、PCR：是一種二條DNA模板不等擴增的PCR，通過調(diào)整一對引物濃度（如100：1），使擴增出的產(chǎn)物大部分為濃度高引物合成的單鏈DNA。有利于測序或制備探針。RAPD（Random Amplification of Polymorphic DNA）隨機引物擴增多態(tài)DNA，或隨機引物擴增PCR（arbitrary primer PCR, AP-PCR）。 常規(guī)PCR 通常擴增一個已知DNA片段，所設(shè)計的引物也是根據(jù)相應(yīng)序列的側(cè)翼順序。擴增產(chǎn)物為一個特異片段。 RAPD包含多個PCR反應(yīng)和多個引物，引物是隨意設(shè)計的10bp片段，其擴增的是一組未知的片段，在事先不知道DNA序列的情況下，產(chǎn)生DNA指紋

24、模式，可進(jìn)行親緣關(guān)系分析、系統(tǒng)發(fā)育分子水平的鑒定。如果在二個基因組的RAPD反應(yīng)用同一組引物，則可以比較基因組間的差異。利用這種差異有可能追蹤性狀的差異。有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù), 稱為基因剔除（gene knock-out）或基因靶向滅活(gene targeting)原核生物DNA特點：1通常由環(huán)狀雙鏈DNA分子組成2操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點之一3基因密度高，編碼區(qū)比例大；重復(fù)序列少；含有同基因； GC含量變化大4非編碼區(qū)主要為調(diào)控序列5存在轉(zhuǎn)座現(xiàn)象6質(zhì)粒DNA具有自主復(fù)制能力基因診斷：遺傳性疾?。焊腥拘约膊。耗[瘤心血管疾病法醫(yī) 單向性: G1S G2 M 階段性: 各期細(xì)胞形態(tài)和代謝特點有明顯