大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

1、一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法：堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。2、37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。4、加0.lml溶液I(1葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1 SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于

2、冰浴5 min 。6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等體積的異戊醇，混勻后于?0靜置10min。9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。10、用70乙醇05ml洗滌一次，抽干所有液體。11、待沉淀干燥后，溶于005mlTE緩沖液中煮沸法 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4下12000離心30秒。 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 4、加入10m

3、l新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量離心機(jī)4下12000g離心10分鐘。7、用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。 8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。 注意 1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。 3. 提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。質(zhì)粒DNA的大量提取和純化 在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高

4、純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。（一）、堿法 1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。 2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。 3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。 4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。 5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。 6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物

5、,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。7、4下5000g離心15分鐘。 8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37水浴20分鐘。 9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。 12、4下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4下12000g離心5分鐘。 13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。 注意 1. 提取過(guò)程中應(yīng)盡

6、量保持低溫。 2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。 3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(80 1小時(shí)),使DNA酶失活。 二、質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定 瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物，應(yīng)選用電泳純的，瓊脂糖此級(jí)產(chǎn)品篩除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙錠染色后熒光背景最小。(1)瓊脂糖凝膠電泳裝置 由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應(yīng)性又強(qiáng)，在過(guò)去15年里已成功地設(shè)計(jì)了形形色色及大大小小的電泳槽。對(duì)這些裝置的選擇主要是依據(jù)個(gè)人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠。 水

7、平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺(tái)的玻璃板或塑料盤(pán)上灌制。在有些裝置中，則可將凝膠直接鋪在平臺(tái)上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進(jìn)行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有相當(dāng)一部分的電流將通過(guò)凝膠的全長(zhǎng)。（2）瓊脂糖凝膠的制備 瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電場(chǎng)接通后，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移。（3）瓊脂糖凝膠的染色 電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含EB的染液中，染色10分鐘，取出紫外燈下觀察。 三、大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 感受態(tài)的細(xì)胞可以

8、攝入外部溶液中的DNA，而常態(tài)的細(xì)胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。 1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜 2、取0.1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3 3、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。 4、在4下以4000rpm離心5min，去上清液 5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 6、然后再在4下以4000rpm離心10min，去上清液 7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-

9、12hr備用。 四、質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌 制備好感受態(tài)細(xì)胞后，接下來(lái)就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞的過(guò)程。但要注意的是感受態(tài)細(xì)胞最好是新制備的，因?yàn)楸４嬉欢〞r(shí)間的感受態(tài)細(xì)胞會(huì)使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。1、取新制備的一管感受態(tài)細(xì)胞。2、取003ml感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)和4ng質(zhì)粒DNA混勻，置冰浴30min3、將 Ep管置于42水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。4、在 Ep管中加70u1 LB培養(yǎng)基混勻，37培養(yǎng)30min5、涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上。6、37培養(yǎng)過(guò)夜，長(zhǎng)出的菌斑既為陽(yáng)性克隆。 五、線形質(zhì)粒DNA 5-粘性末端去磷酸 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒

10、DNA 5端均帶有磷酸集團(tuán)，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此一般酶切的質(zhì)粒DNA要經(jīng)脫磷，使用堿性磷酸酶(CIAP)去除5端磷酸集團(tuán)。方法如下：1、質(zhì)粒DNA和CIAP以及BUFFER 37水浴30min2、補(bǔ)充CIAP 再37水浴30min3、加入50mM EDTA至終濃度5mM 75加熱10min 失活CIAP4、冷卻至室溫，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮。5、抽干溶液，加適量TE溶解。 六、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù) PCR是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。其特異性是由兩個(gè)人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴(kuò)增DNA片段兩翼互補(bǔ)

11、的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA片段。待擴(kuò)增DNA模版加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復(fù)性。此時(shí)，兩引物的3端相對(duì)，5向背。在合適的條件下，由Taq DNA聚合酶催化引物引導(dǎo)的DNA合成，既引物的延伸。上述過(guò)程是由溫度控制。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。理論上擴(kuò)增產(chǎn)物量成指數(shù)上升，既n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。典型的PCR操作過(guò)程如下：1、 反應(yīng)體系：體積成分工作液濃度終濃度14.0 l PCR Water 2.5 l 10X Taq Buffer 10X 1X 1.5 l MgCl2 25 mM 1.5 mM 4.0 l *dNTP Mix 1.25 mM each dNTP 0.2 mM each dNTP 0.25 l Primer 1 100 pmoles/l 1 M 0.25 l Primer 2 100 pmoles/l 1 M 0.25 l Taq D