體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新、分化及其調(diào)控相關(guān)組織干細(xì)胞的機(jī)制研究[共16頁(yè)]

1、項(xiàng)目名稱：體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新、分化及其調(diào)控相關(guān)組織干細(xì)胞的機(jī)制研究首席科學(xué)家：李保界 上海交通大學(xué)起止年限：2012.1至2016.8依托部門(mén)：上海市科委一、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題及研究?jī)?nèi)容擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題基于MSC廣譜的疾病治療應(yīng)用前景，針對(duì)目前對(duì)MSC的微環(huán)境、自我更新、分化機(jī)理等缺乏系統(tǒng)研究的現(xiàn)狀, 本課題擬解決以下關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題:1. 通過(guò)建立脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨髓HSC 缺乏及血管再生受阻的動(dòng)物模型，探討這幾種細(xì)胞是否作為骨髓MSC 的微環(huán)境調(diào)節(jié)MSC 的干性維持、自我更新與分化，尋找這些細(xì)胞旁分泌的活性分子在其中的作用，并探討這些活性分子在抵抗組織衰老、促進(jìn)組織再生與損傷修復(fù)中的作

2、用。 2. 通過(guò)在體研究PTHrP-Bmi1、BMP-MAPK、p16 和p53 通路等在調(diào)控MSC 自我更新與分化中的作用機(jī)制，闡釋MSC 自我更新與分化的關(guān)鍵信號(hào)分子在抵抗組織衰老，促進(jìn)組織再生及損傷修復(fù)中的作用，并與微環(huán)境中的信號(hào)分子建立聯(lián)系。 3. 通過(guò)系統(tǒng)地分析MSC 自我更新、分化過(guò)程中表觀遺傳學(xué)的改變，尋找受DNA甲基化、組蛋白修飾、non-coding RNA 調(diào)控的目標(biāo)基因。結(jié)合基因表達(dá)圖譜，闡釋在 MSC 的維持、自我更新及分化中的新表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)。利用基因敲除小鼠，研究若干關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控基因在 MSC 自我更新與分化中的作用及機(jī)制，并研究其與信號(hào)通路的關(guān)系。 4. 通過(guò)

3、對(duì)骨折愈合、HSC 造血和神經(jīng)損傷修復(fù)的在體研究，闡釋 MSC 及其分化細(xì)胞在這些過(guò)程中的作用和機(jī)制，以期為 MSC 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。探討兩種活性分子通過(guò)促進(jìn) MSC 增殖及向成骨細(xì)胞分化，加速骨形成和骨折愈合以及促進(jìn)HSC 造血和神經(jīng)再生與修復(fù)的應(yīng)用前景。主要研究?jī)?nèi)容1 建立可識(shí)別和分離體內(nèi)骨髓MSC的基因工程小鼠體系擬建立Gt(ROSA)26Sor-YFP；Nestin-Cre小鼠、Gt(ROSA)26Sor-YFP；PrxI-Cre小鼠、Gt(ROSA)26Sor-YFP；Dermo-Cre小鼠，用于觀察體內(nèi)MSC的狀況以及通過(guò)流式分選這些細(xì)胞。2 建立可特異性殺死MSC、

4、成骨細(xì)胞或者其他細(xì)胞的基因工程小鼠體系利用細(xì)胞特異性的CreER(T)和iDTR小鼠，注射白喉毒素特異性殺死Cre表達(dá)的細(xì)胞。3 MSC的骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞成分和活性分子鑒定特異性地的殺死脂肪細(xì)胞/成骨細(xì)胞，利用生物活性分子促進(jìn)HSC從骨髓遷徙到外周血或者抑制血管再生，觀察其對(duì)MSC增殖和分化的影響；建立并利用細(xì)胞共培養(yǎng)體系探討脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及HSC對(duì)MSC的自我更新和分化的影響。利用液體芯片技術(shù)分析脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、HSC以及成骨細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子及活性分子，并研究它們對(duì)體內(nèi)MSC的調(diào)控作用。4 MSC在組織再生與損傷修復(fù)中的作用特異性殺死MSC或成骨細(xì)胞，比較MS

5、C和成骨細(xì)胞作為造血微環(huán)境在改善HSC造血中的作用，并探討B(tài)MPRIA和TGFb受體特異敲除對(duì)HSC造血的影響；研究MSC的減少或缺失對(duì)SSRIs （抗抑郁癥藥物）引起的NSC神經(jīng)元分化的可能作用；研究MSC的減少或缺失對(duì)LPS引起神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。5 MSC自我更新與定向分化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究Bmi1在MSC增殖、分化以及衰老中的作用；研究p53和p16在Bmi1引起的MSC衰老及分化中的作用以及與過(guò)氧化物的關(guān)系；研究BMP-BMPRIA-MAPK在調(diào)節(jié)MSC增殖和分化中的作用及分子機(jī)理。6 MSC自我更新與分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控利用基因敲除小鼠，研究表觀遺傳關(guān)鍵調(diào)控基因在MSC自我更新與分

6、化中的作用及機(jī)制；確立在MSC自我更新與分化過(guò)程中被表觀遺傳修飾的靶基因譜以及與上述關(guān)鍵調(diào)控基因的關(guān)系；搜尋MSC自我更新與分化過(guò)程中新的lncRNA和microRNA分子，并闡釋其調(diào)控成骨分化的功能；建立調(diào)控MSC自我更新與分化的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)，并與其信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因表達(dá)圖譜建立聯(lián)系。7 篩選可調(diào)節(jié)體內(nèi)MSC更新、定向分化以及促進(jìn)組織損傷修復(fù)的活性分子改造BMP蛋白分子以及篩選BMPs的小分子激動(dòng)劑，在體研究BMPs激動(dòng)劑在體內(nèi)MSC自我更新、分化、骨再生/骨折愈合以及造血和神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用；探討B(tài)MP是否通過(guò)MSC或成骨細(xì)胞促進(jìn)造血。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)： 利用多種動(dòng)物模型，通過(guò)研究正

7、常生理狀況下、衰老、骨折愈合、造血、神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中MSC的活動(dòng)與功能，在理論方面，闡釋MSC的維持、自我更新、分化的調(diào)控機(jī)制，深入地了解MSC的生物學(xué)本質(zhì)；在應(yīng)用方面，探討活性蛋白或小分子化合物通過(guò)調(diào)節(jié)MSC的增殖與分化，在促進(jìn)骨再生、HSC造血和神經(jīng)再生修復(fù)中的應(yīng)用，為MSC廣泛的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。最終促使我國(guó)在MSC相關(guān)領(lǐng)域形成自己的特色，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。同時(shí)，以本項(xiàng)目為紐帶，促進(jìn)多學(xué)科、多院校的合作和交流，培養(yǎng)一批優(yōu)秀的干細(xì)胞研究人才。五年預(yù)期目標(biāo)：1利用本團(tuán)隊(duì)已建立的小鼠模型，通過(guò)降低骨髓HSC、成骨細(xì)胞或者脂肪細(xì)胞的數(shù)量以及抑制血管再生，研究 MSC 骨髓微環(huán)境中起作

8、用的細(xì)胞組成，并利用體外共培養(yǎng)的方法，研究這些細(xì)胞分泌的因子對(duì) MSC 增殖與分化的調(diào)控作用以及機(jī)制。以骨骼代謝的重要調(diào)節(jié)分子 BMPs 入手，闡釋 BMPs 在MSC 的維持、自我更新以及衰老中的作用。 2利用Bmi1、p53、p16、p38、Tak1 等基因敲除小鼠模型，研究 MSC 體內(nèi)自我更新與分化的信號(hào)通路調(diào)控。揭示 MSC 自我更新信號(hào)的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，以及協(xié)調(diào) MSC 分化為成骨或者脂肪細(xì)胞的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，尋找延遲MSC 衰老、抑制MSC 脂肪分化、促進(jìn)其成骨分化的關(guān)鍵信號(hào)分子，為延緩骨骼衰老、促進(jìn)骨再生及損傷修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。 3通過(guò)研究分離出的 MSC、培養(yǎng)的 MS

9、C、以及分化出的成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等的表觀遺傳學(xué)差異，和相應(yīng)細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜進(jìn)行比較，闡釋調(diào)控MSC的維持、增殖及分化為不同細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，尋找在此過(guò)程中起重要作用的新調(diào)節(jié)基因。從而通過(guò)控制基因表達(dá)延緩 MSC 衰老，促進(jìn)其增殖及向成骨分化。 4探討內(nèi)源性 MSC 及其分化的細(xì)胞對(duì) HSC、神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。研究在此過(guò)程中正常或者BMP/TGFB信號(hào)受阻的MSC 和成骨細(xì)胞等對(duì)HSC 微環(huán)境的貢獻(xiàn)以及對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。改造BMP 蛋白分子以及篩選BMPs 的小分子激動(dòng)劑，研究它們對(duì)體內(nèi)MSC 的維持、自我更新和分化、以及HSC 造血、骨及神經(jīng)再生與修復(fù)中的作用。 5取得具有國(guó)際影

10、響的原創(chuàng)性成果,預(yù)期在國(guó)內(nèi)外專業(yè)期刊上發(fā)表一批高水平論文。其中在國(guó)際一流學(xué)術(shù)刊物（IF10）上發(fā)表論文10 篇以上，在有影響力的雜志（IF5）上發(fā)表論文50 篇以上。另外，申請(qǐng)專利5 項(xiàng)以上。 6預(yù)計(jì)培養(yǎng)博士后25-35 人，博士研究生50-80 人及一批學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強(qiáng)的中青年學(xué)術(shù)骨干,為 MSC 研究打造一支具有國(guó)際影響力的高水平研究隊(duì)伍。三、研究方案學(xué)術(shù)思路：間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究最活躍的成體干細(xì)胞，在骨骼的發(fā)育與再生中起重要的作用，同時(shí)還具有其它干細(xì)胞不具有的廣闊的應(yīng)用前景。目前，對(duì)MSC的穩(wěn)態(tài)維持、自我更新與分化的調(diào)控機(jī)制知之甚少，因此無(wú)法精細(xì)地控制MSC的活動(dòng)與功能，以達(dá)到預(yù)期

11、的治療效果，嚴(yán)重阻礙了MSC的臨床應(yīng)用。此外，人們尚不清楚骨骼以外的修復(fù)功能是否也是內(nèi)源性MSC固有的。在綜合本團(tuán)隊(duì)及國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，我們將以MSC的微環(huán)境、體內(nèi)自我更新與分化的遺傳和表觀遺傳學(xué)機(jī)制、MSC支持其它組織（造血和神經(jīng)）再生與修復(fù)的機(jī)制為研究主線，以多種基因敲除小鼠為工具，對(duì)正常及病理狀態(tài)下調(diào)控MSC命運(yùn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)特別是關(guān)鍵分子靶點(diǎn)及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。通過(guò)以上幾個(gè)方面的系統(tǒng)研究，我們將對(duì)MSC的體內(nèi)自我更新與分化有一個(gè)全面的了解，從而指導(dǎo)MSC的臨床應(yīng)用。探討活性蛋白PTH改變骨髓微環(huán)境中的MSC成骨分化促進(jìn)造血的機(jī)制和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)重組BMP以及BMP小分子激動(dòng)

12、劑的篩選，尋找可通過(guò)調(diào)節(jié)MSC自我更新與定向分化，對(duì)抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折愈合以及其它組織修復(fù)的小分子藥物，提升中國(guó)藥物研發(fā)的能力，創(chuàng)造具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的新技術(shù)、新產(chǎn)品，服務(wù)于我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與人民健康。 創(chuàng)新點(diǎn)與特色1. 首次利用多種基因工程小鼠（團(tuán)隊(duì)擁有幾十種基因工程小鼠的資源）對(duì)MSC的微環(huán)境中各類細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的分析；并通過(guò)液體芯片技術(shù)對(duì)這些細(xì)胞所分泌的活性生物分子進(jìn)行系統(tǒng)而全面的分析以及功能驗(yàn)證，對(duì)骨髓 MSC 的微環(huán)境提供一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)。本項(xiàng)目研究的是科學(xué)前沿問(wèn)題、具體目標(biāo)明確，有很強(qiáng)的創(chuàng)新性。 2. 利用Prx1-CreER(T)和Dermo-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠和iDT

13、R 小鼠，在注射小鼠白喉毒素的情況下，特異的殺死體內(nèi)的MSC，研究?jī)?nèi)源的MSC 在骨折愈合、造血以及神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。該研究對(duì)MSC 的臨床應(yīng)用具有重要的意義。這有別于以往的MSC 的局部注射或者靜脈注射，所用的MSC 未經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增，因此可以探討MSC 真正的體內(nèi)功能。 3. 率先利用 MSC 特異性 Bmi1 或 Sirt1 高表達(dá)，研究它們是否能夠通過(guò)促進(jìn)MSC 自我更新和向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用；率先揭示PTHrP 經(jīng)Bmi1 介導(dǎo)抑制p53 和p16 通路活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激 BM-MSC 自我更新，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分

14、化而發(fā)揮抗衰老和抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。 4. 率先研究若干關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控基因在 MSC 自我更新與分化中的作用及其機(jī)制分析；確立在 MSC 分化過(guò)程中被表觀遺傳修飾的靶基因譜及搜尋新的lncRNA 和microRN A 分子并闡釋其調(diào)控成骨分化的功能。 5. 本項(xiàng)目對(duì)貫穿于四個(gè)課題的骨形態(tài)蛋白進(jìn)行了較為全面的研究，篩選可以替代BMPs 的小分子激動(dòng)劑，并取得了很大的進(jìn)展，將為骨質(zhì)疏松以及骨損傷修復(fù)的治療提供一種新的途徑。 6. 參加人員已在相關(guān)領(lǐng)域取得國(guó)際認(rèn)可或領(lǐng)先的前期研究結(jié)果。本研究課題所涉及的各個(gè)方面內(nèi)容大多是前期工作基礎(chǔ)上的延伸或拓展。因此，本項(xiàng)目具有很高的研究起點(diǎn)和可行性，預(yù)期結(jié)果

15、必將在國(guó)際 MSC 研究領(lǐng)域中占領(lǐng)新高地，促進(jìn)我國(guó)干細(xì)胞研究整體水平和地位的進(jìn)一步提升。 課題設(shè)置課題一：成體MSC的骨髓微環(huán)境研究目標(biāo):1. 明確脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、HSC及血管內(nèi)皮細(xì)胞是否作為骨髓MSC的微環(huán)境調(diào)節(jié)MSC的干性維持、自我更新與分化。2. 鑒定骨髓MSC微環(huán)境的旁分泌活性分子在調(diào)節(jié)MSC的干性維持、自我更新與分化中的作用。3. 明確BMPs是否作為MSC微環(huán)境中的重要活性因子。研究?jī)?nèi)容:1. 利用脂肪特異的Adipoq-CreER(T)（Cre和tamoxifen-responsive estrogen receptor）；iDTR小鼠（2個(gè)月和12個(gè)月），注射白喉毒素特異性

16、殺死脂肪細(xì)胞，觀察脂肪細(xì)胞缺乏對(duì)Nestin+細(xì)胞、PDGFRa+及CAR細(xì)胞數(shù)目及其增殖和分化的影響。2. 利用Osx-CreER(T)；iDTR小鼠（2個(gè)月和12個(gè)月），特異性殺死成骨細(xì)胞，觀察成骨細(xì)胞缺乏對(duì)Nestin+細(xì)胞、PDGFRa+及CAR細(xì)胞數(shù)目及其增殖和分化的影響。3. 利用生物活性分子促進(jìn)HSC從骨髓遷徙到外周血，觀察HSC缺乏對(duì)Nestin+細(xì)胞、PDGFRa+及CAR細(xì)胞數(shù)目及其增殖和分化的影響。4. 利用bevacizumab 和carboxyamidotriazole抑制血管再生，觀察血管再生損傷對(duì)Nestin+細(xì)胞、PDGFRa+及CAR細(xì)胞數(shù)目及其增殖和分化的影

17、響。5. 建立并利用細(xì)胞共培養(yǎng)體系探討脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及HSC對(duì)MSC的自我更新和分化的影響。利用液體芯片技術(shù)（Bio-Plex系統(tǒng)）分析脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、HSC以及成骨細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子及活性分子，并研究它們對(duì)體內(nèi)MSC的調(diào)控作用。6. 研究微環(huán)境中活性分子在年輕和衰老小鼠的MSC 更新與分化中的作用經(jīng)費(fèi)比例： 30% 承擔(dān)單位： 上海交通大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 李保界 學(xué)術(shù)骨干： 李旌、賈德永、樂(lè)黃鶯課題二：MSC自我更新與分化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo):1. 明確Bmi-1在調(diào)節(jié)BM-MSC自我更新和分化中的作用及機(jī)制。2. 明確p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1

18、調(diào)節(jié)BM-MSC自我更新和分化中的作用及機(jī)制。3. 明確Bmi1是否通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激BM-MSC自我更新，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化而發(fā)揮在抗衰老和骨質(zhì)疏松中的作用。4. 明確BMP-MAPK信號(hào)通路在MSC自我更新、衰老、成骨細(xì)胞的定向分化中的作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容：1. 通過(guò)在Bmi1缺失小鼠MSC特異性高表達(dá)Bmi1或Sirt1，研究MSC特異性高表達(dá)Bmi1或Sirt1能否通過(guò)促進(jìn)BM-MSC自我更新，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化，而糾正Bmi1基因敲除引起的成熟前骨質(zhì)疏松的表型。2. 通過(guò)在PTHrP KI或Bmi1-/-小鼠敲除p53或p16基因

19、，經(jīng)表型差異分析，研究53和p16通路在PTHrP-Bmi1調(diào)節(jié)BM-MSC自我更新和分化中的作用及機(jī)制。3. 通過(guò)飲水中添加抗氧化劑NAC喂養(yǎng)Bmi1-/-小鼠，研究Bmi1是否經(jīng)過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激BM-MSC自我更新，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化而發(fā)揮它們?cè)诳顾ダ虾凸琴|(zhì)疏松中的作用。4. 將利用MSC特異性敲除Tak1或p38 MAPK小鼠模型，研究BMP-MAPK通路在調(diào)節(jié)MSC增殖和分化中的相互作用及分子機(jī)理。5. 以上通路與課題一鑒定的微環(huán)境中信號(hào)分子的聯(lián)系。經(jīng)費(fèi)比例： 22.5% 承擔(dān)單位： 南京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院、同濟(jì)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 苗

20、登順 學(xué)術(shù)骨干： 陳寧、楊帆、張磊課題三：MSC自我更新與分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究目標(biāo):1. 驗(yàn)證若干表觀遺傳關(guān)鍵調(diào)控基因在MSC自我更新與分化中的作用及其機(jī)制2. 確立在MSC自我更新與分化過(guò)程中被表觀遺傳修飾的靶基因譜，包括DNA甲基化模式和組蛋白修飾模式等，并研究其與（1）關(guān)鍵基因的關(guān)系。3. 搜尋MSC自我更新與分化過(guò)程中新的lncRNA和microRNA分子，并闡釋其調(diào)控成骨分化的功能。4. 建立調(diào)控MSC自我更新與分化的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)，并與其信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因表達(dá)圖譜建立聯(lián)系。研究?jī)?nèi)容:1. 利用DNA加氧酶1-3，methyl CpG結(jié)合蛋白Mbd5，PcG復(fù)合物組分MPc2及Ch

21、romobox蛋白Cbx6等基因敲除小鼠，研究這些表觀遺傳關(guān)鍵調(diào)控基因在MSC自我更新與分化中的作用及機(jī)制。2. 確立在MSC自我更新與分化過(guò)程中被表觀遺傳修飾的靶基因譜，包括DNA甲基化模式和組蛋白修飾模式等，以及與上述關(guān)鍵調(diào)控基因的關(guān)系。3. 搜尋MSC自我更新與分化過(guò)程中新的lncRNA和microRNA分子，并闡釋其調(diào)控成骨分化的功能。4. 建立調(diào)控MSC自我更新與分化的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)，并與其信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和基因表達(dá)圖譜建立聯(lián)系。經(jīng)費(fèi)比例： 22.5% 承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、同濟(jì)大學(xué)、上海交通大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 徐國(guó)良 學(xué)術(shù)骨干： 郭熙志、劉海亮、李明發(fā)課題四：MSC在

22、組織（造血、神經(jīng)）再生以及損傷修復(fù)中的作用研究目標(biāo)：1. 明確MSC、成骨細(xì)胞、及其BMP/TGFb信號(hào)通路是否作為微環(huán)境改善HSC的造血。 2. 明確PTH能否通過(guò)調(diào)節(jié)MSC及其分化的成骨細(xì)胞，改善造血微環(huán)境，激活Notch通路，發(fā)揮糾正Bmi1缺失引起的造血障礙。3. 利用基因工程小鼠模型，明確內(nèi)源性MSC在神經(jīng)組織再生以及損傷修復(fù)中的作用。4. 明確BMP小分子激動(dòng)劑在骨/HSC造血/神經(jīng)再生與修復(fù)中的作用。研究?jī)?nèi)容：1. 利用Prx1-CreER(T)；iDTR、Osx-CreER(T)；iDTR小鼠，特異性殺死MSC或成骨細(xì)胞，比較MSC和成骨細(xì)胞作為造血微環(huán)境在改善HSC造血中的作

23、用； 利用Prx1-CreER(T) 以及Dermo-Cre小鼠特異敲除BMPRIA和TGFb受體，研究MSC中這兩個(gè)通路對(duì)HSC造血的影響。2. 通過(guò)PTH給藥，研究其能否通過(guò)改善造血微環(huán)境，抑制氧化應(yīng)激，激活Notch通路，發(fā)揮糾正Bmi1缺失引起的造血障礙的作用。并利用Prx1-CreER(T)；iDTR、Osx-CreER(T)；iDTR小鼠驗(yàn)證這兩種細(xì)胞對(duì)PTH促造血的影響。3. 利用Prx1-CreER(T);iDTR小鼠以及Dermo-Cre;iDTR小鼠研究MSC的減少或缺失對(duì)SSRIs （看抑郁癥藥物）引起的NSC神經(jīng)元分化的可能作用；我們將利用Prx1-CreER(T);i

24、DTR小鼠以及Dermo-Cre;iDTR小鼠研究MSC的減少或缺失對(duì)LPS引起神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。4. 改造BMP蛋白分子以及篩選BMPs的小分子激動(dòng)劑，利用2個(gè)月和12個(gè)月小鼠，研究BMPs激動(dòng)劑在體內(nèi)MSC自我更新、分化、骨再生/骨折愈合以及造血和神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。經(jīng)費(fèi)比例： 25% 承擔(dān)單位： 同濟(jì)大學(xué)、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 課題負(fù)責(zé)人： 孫奮勇 學(xué)術(shù)骨干： 劉兵、張玲、楊冠各課題間相互關(guān)系基于擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展以及研究團(tuán)隊(duì)的大量前期工作，本項(xiàng)目設(shè)置4個(gè)課題：1、MSC的骨髓微環(huán)境；2. MSC自我更新與分化的信號(hào)調(diào)控機(jī)制；3、MSC自我更新與分化

25、的表觀遺傳學(xué)調(diào)控; 4. MSC在組織再生與修復(fù)中的作用。本項(xiàng)目的四個(gè)課題圍繞MSC的體內(nèi)自我更新、定向分化以及組織修復(fù)功能的體內(nèi)外調(diào)控機(jī)制這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行研究，各課題組既有相對(duì)獨(dú)立的明確的研究方向，又有密切的聯(lián)系。而且課題組成員已在上述領(lǐng)域進(jìn)行了長(zhǎng)期的原創(chuàng)性研究，相互間已有多年合作研究的基礎(chǔ)。 課題一、二、三圍繞調(diào)節(jié)MSC的體內(nèi)外信號(hào)、基因表達(dá)以及表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，旨在闡明體內(nèi)MSC的維持、自我更新與分化的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。課題四研究MSC在幾種組織的再生（生理狀態(tài)）以及損傷修復(fù)（病理狀態(tài)下）中的作用及其作用機(jī)制，為MSC在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。該課題不僅是課題一三基礎(chǔ)研究的補(bǔ)充，而

26、且滿足國(guó)家轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)的重大需求，體現(xiàn)本課題的臨床應(yīng)用價(jià)值以及潛在的經(jīng)濟(jì)效益。課題一至三，共同為課題四提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而課題四是在其它課題研究基礎(chǔ)上，將研究成果服務(wù)于延緩骨衰老、促進(jìn)骨再生以及其它組織再生與修復(fù)的整體目標(biāo)，為課題一至三提供調(diào)控臨床應(yīng)用的最終落腳點(diǎn)。四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年l 基因工程小鼠的建立：包括多種Cre；iDTR小鼠可在體殺死CRE特異表達(dá)的細(xì)胞。l 基因工程小鼠的建立：包括多種Cre；Gt(ROSA)26SorYFP。 可用于觀察體內(nèi)MSC，也可流式分選這些細(xì)胞。l 構(gòu)建MSC特異性Bmi1或Sirt1高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并分別與Bmi1-/-小鼠交

27、配。 l 在PTHrP KI和Bmi1-/-小鼠中敲除p53以及p16基因。l 建立MSC特異性敲除Tak1、p38 MAPK、BMPRIA和TGFb受體的小鼠模型。l 利用若干重要表觀遺傳調(diào)控基因敲除小鼠，研究這些基因缺失對(duì)骨代謝的影響。l 研究MSC更新和成骨分化中ncRNA表達(dá)圖譜的改變。l 骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP的產(chǎn)業(yè)化研究工作。l 建立基于Osterix 的basal啟動(dòng)子以及8個(gè)Smad1重復(fù)結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)luciferase的DNA載體，并在在MSC細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)。l 建立小鼠模型為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)，用于研究MSC微環(huán)境中的細(xì)胞成分、影響MSC衰老以及分化的重要信號(hào)通路以及M

28、SC在相關(guān)組織損傷修復(fù)中的作用。l 確定若干重要表觀遺傳調(diào)控基因是否調(diào)節(jié)骨的發(fā)育及代謝。l 分析ncRNA的表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)與MSC更新和成骨分化相關(guān)的ncRNA。l 建立篩選BMP激動(dòng)劑的體系。第二年l 利用建立的工程小鼠（2個(gè)月），研究微環(huán)境中調(diào)節(jié)MSC更新與分化的細(xì)胞成分。l 通過(guò)促進(jìn)小鼠（2個(gè)月）HSC從骨髓遷徙到外周血以及抑制血管再生，研究HSC缺乏以及血管再生對(duì)MSC更新和分化的影響。l 利用細(xì)胞共培養(yǎng)體系和液體芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中細(xì)胞所分泌的可調(diào)節(jié)MSC的自我更新、分化及衰老的活性分子。l 探討B(tài)MPs對(duì)骨髓中MSC的自我更新、分化及衰老的影響。l 研究Bmi和Sirt1在骨代謝中

29、的作用。l 研究p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1調(diào)節(jié)骨代謝中的作用。l 研究BMP-MAPK通路在骨代謝中的作用。l 分析若干重要表觀遺傳調(diào)控基因在MSC更新與分化中的作用。l 發(fā)現(xiàn)MSC更新與成骨分化過(guò)程中啟動(dòng)子被表觀遺傳修飾的靶基因譜。l 研究相關(guān)的ncRNA在MSC更新與分化中的作用l 研究MSC中BMP和TGFb信號(hào)對(duì)HSC造血的調(diào)節(jié)作用。l 篩選自然產(chǎn)物文庫(kù)，進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證。l 確定在新成年小鼠中調(diào)節(jié)MSC活動(dòng)的微環(huán)境中的細(xì)胞成分。l 發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中細(xì)胞分泌的重要活性分子。l 確定MSC中表達(dá)的Bmi在骨代謝中的作用。l 確定p53和p16在MSC自然衰老以及PTHrPKI

30、和Bmi-/-引發(fā)的早衰中的作用。l 確定MSC中BMP-MAPK通路缺失對(duì)骨代謝的影響。l 確定可調(diào)節(jié)MSC更新與分化的表觀遺傳調(diào)控基因。l 建立與MSC更新和成骨分化相關(guān)的DNA甲基化圖譜以及組蛋白修飾圖譜。l 發(fā)現(xiàn)重要的調(diào)節(jié)MSC的ncRNA。l 確定MSC調(diào)節(jié)HSC造血的新機(jī)制。l 初步鑒定BMP的激動(dòng)劑。第三年l 通過(guò)促進(jìn)小鼠（12個(gè)月）HSC從骨髓遷徙到外周血、以及抑制血管再生，研究HSC缺乏以及血管再生對(duì)MSC更新和分化的影響。l 研究微環(huán)境中活性分子在年輕和衰老小鼠的MSC更新與分化中的作用。研究鑒定的活性分子在相應(yīng)的衰老細(xì)胞中合成和分泌的狀況以及在體內(nèi)MSC中的激活情況。l

31、研究Bmi和Sirt1 對(duì)MSC更新與定向分化的調(diào)節(jié)作用。l 研究BMP-MAPK信號(hào)通路在MSC自我更新、衰老、成骨細(xì)胞的定向分化中的作用。l 建立重要表觀遺傳調(diào)控基因與調(diào)節(jié)骨代謝、MSC自我更新與分化的重要基因的關(guān)系。l 研究相關(guān)ncRNA以及受表觀遺傳學(xué)調(diào)控的基因如何調(diào)節(jié)MSC的更新與分化。l 研究MSC減少或缺失對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）分化的可能作用。l 研究MSC減少或缺失對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。l MSC激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及體外研究。l 明確衰老過(guò)程中MSC微環(huán)境的改變。l 明確p53和p16通路在PTHrP和Bmi-1調(diào)節(jié)BM-MSC自我更新和分化中的作用及機(jī)制。l 明確Bmi1是否通

32、過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激BM-MSC自我更新，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化而發(fā)揮在抗衰老和骨質(zhì)疏松中的作用。l 明確BMP-MAPK信號(hào)通路在MSC自我更新、衰老、成骨細(xì)胞的定向分化中的作用。l 明確若干表觀遺傳關(guān)鍵調(diào)控基因在MSC自我更新與分化中的作用及其機(jī)制。l 確立在MSC自我更新與分化過(guò)程中被表觀遺傳修飾的靶基因譜，包括DNA甲基化模式和組蛋白修飾模式等，以及相關(guān)的lncRNA調(diào)控MSC更新與成骨分化的機(jī)制。l 確定內(nèi)源性的MSC在神經(jīng)再生與神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。l 發(fā)現(xiàn)毒性小、功能強(qiáng)的BMP小分子激動(dòng)劑。第四年l 利用建立的工程小鼠（12個(gè)月），研究微環(huán)境調(diào)節(jié)MSC更新與分化的細(xì)胞成分。l 研究微環(huán)境細(xì)胞分泌的活性因子的作用機(jī)制。l 研究Bmi和Sirt1 調(diào)節(jié)MSC更新與分化的分子機(jī)制。