現(xiàn)代生物技術理論與實驗：藥物發(fā)現(xiàn)中的ADMET方法

1、III -藥物發(fā)現(xiàn)中的ADMET方法,什么是ADMET,Absorption 吸收 Distribution 分布 Metabolism 代謝 Excretion 排出 Toxicity 毒性 ADME是藥物動力學(Pharmacokinetics, PK)的內容,成功藥物是個平衡體,藥物活性,藥物毒性,藥物必備性質,藥物必備性質 -藥物開發(fā)的前提條件,物理化學性質 溶解性 化學穩(wěn)定性 生物學性質 生物屏障滲透能力 藥物代謝性質（生物穩(wěn)定性） 藥物排出性質 蛋白質和器官組織的結合力,藥物研發(fā)的并行策略,合成化合物 或 分離天然產物,生物活性 生物選擇性 物理化學性質 藥物吸收 藥物代謝 大分子

2、結合 細胞毒性 ,優(yōu)化的 先導化合物,候選藥物,現(xiàn)代ADMET研究方法的特點,基于細胞或生物大分子的分析方法 人源材料的應用 小樣品、高內涵和高通量分析能力 能夠闡明藥物性質的分子機理、建立結構-藥物性質定量構效關系,合理藥物運輸/制劑系統(tǒng),以往的研究表明：藥物運輸系統(tǒng)只能輔助而不能根本性的改變藥物的口服吸收能力 合理的藥物運輸/制劑系統(tǒng)(rational drug delivery)必須依據(jù)藥物本身的穿越消化腸道屏障的滲透能力,BCS系統(tǒng),FDA制定了BCS的評價指南。BCS的評價主要包括下列三個方面： 藥物的生物滲透能力（permeability） 藥物的溶解能力（Solubility）

3、制劑的快速溶出能力（Immediate Release） 上述性質符合要求的藥物/制劑可以在藥審時得到生物豁免。,藥物吸收,吸收屏障結構,底側（Basolateral）,頂側（Apical）,經細胞連接 的被動擴散 Paracellular diffusion,穿細胞 被動擴散 Transcellular diffusion,代謝轉化 A B,外流Efflux,藥物轉運 transport,A,C,D,藥物消化道吸收的基本機制,體外單層腸上皮細胞藥物吸收模型,腸上皮細胞/細胞系,組織/細胞培養(yǎng),多空膜基底,吸收細胞單層,Transwell細胞培養(yǎng)板,已被認證的用于藥物吸收的細胞系,Caco-2

4、 人結腸腺癌細胞 具有分化的腸上皮細胞特征和重要的藥物轉運與代謝酶 MDCK 狗腎上皮細胞系,Caco-2藥物吸收模型的創(chuàng)建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究團隊,Caco-2模型的制備過程,細胞培養(yǎng),Transwell接種,細胞匯合,細胞分化完備,細胞收集,2-3天,2-3天,23星期,藥物吸收 測試,試驗結果-滲透能力,吸收較好的藥物： Papp 210-6 Testosterone：1.010-5 cm/s Propranolol: 2.8610-5cm/s 吸收差藥物： Papp 10-6 Mannitol：1.010-7 cm/s Atenolol: Papp= 4

5、.5510-7 cm/s,Brain Blood Barrier（BBB）,BBB結構,內皮細胞和星形膠質細胞的相互作用,星形膠質細胞毛細血管內皮細胞 促進細胞緊密連接 誘導一些酶和分子轉運蛋白 調節(jié)內皮細胞生長 毛細血管內皮細胞星形膠質細胞 趨化現(xiàn)象 表型的調節(jié),BBB滲透機理,influx,efflux,緊密連接（tight junction）的結構,AP端：血液,BL端：腦實質,毛細血管內皮細胞,膠質細胞,神經膠質細胞,毛細血管內皮細胞,基底膜,多孔聚碳酯膜,藥物排出,藥物清除 = 代謝 + 排出,腎排出：超濾機制,游離小分子藥物 及其代謝物,腎小球,腎小管,藥物重吸收,大分子化合物 大

6、分子結合藥物,腎排出因素：PPB 和 Papp,(Absorption fraction 0.9),(PPB0.05),膽汁分泌和腸肝循環(huán),Drug,Binding to cytoplasmic proteins,肝臟處置藥物的基本途徑,膽汁,NTCP,OATPs,OAT2,OATP2,MRPs,MDR1,BCRP,BSEP/SPGP,腸道,藥物,藥物,代謝物,Basal （blood）,Apical （bile）,OATP2,MDCKII,(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277(8), 6497-6593 (2002),藥物經膽汁

7、排出的細胞模型- OATP2/MRP2 雙轉染 MDCK細胞單層,MRP2/cMOAT,藥物的肝臟代謝,藥物代謝的基本過程,藥物 R,氧化產物 R-OH,結合產物 R-O-X,排出物,I相代謝,II相代謝,II+相代謝：藥物外流,II相代謝,水解產物,X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione,I相代謝關鍵酶-細胞色素P450,細胞色素P450 (CYP)家族 CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 NADPH依賴的氧化酶 CYP3A4 是藥物的主要代謝酶

8、50%已知藥物通過CYP3A4代謝,II 相代謝關鍵酶,UDP-依賴葡糖醛酸基轉移酶(UGT) 苯酚磺基轉移酶 (PST) 雌激素磺基轉移酶 (EST) 谷胱甘肽-S-轉移酶 (GST) 一些細胞抗氧化酶,三種肝細胞制品及代謝分析,全肝細胞代謝分析,肝微粒體代謝分析,S-9 肝勻漿液 代謝分析,藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析過程,藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析結果,% 原藥消失率 =,（1 - ）100%,原始藥物濃度c0,代謝反應后藥物濃度ct,全肝細胞(),肝微粒體(),僅包括I相代謝酶 易于保存 分析操作容易、費用低,包括所有代謝酶和轉運蛋白 費用高，細胞保存不易,S9肝勻漿液(),包括主要I、II相代

9、謝酶 分析操作容易、費用低 勻漿液保存不穩(wěn)定,藥物毒性,藥物毒性評價的基本方式-細胞活力分析,細胞生長 細胞能荷 線粒體活性-MTT分析 細胞氧化還原狀態(tài)-谷胱甘肽含量分析 細胞特征性功能 蛋白質合成 核酸合成 吞噬、排除外來分子能力等 細胞膜完整性-胞漿酶活性分析,MTT細胞活力分析,原理： 線粒體酶將探針分子MTT*還原成為一種藍色脂溶性染料formazan（吸收波長550nm） 線粒體活性越高，轉化能力越強 實驗方法：將MTT加入到細胞培養(yǎng)液中，反應一段時間后，用有機溶劑溶解產生的formazan，然后用酶標儀測定 550 nm吸光度. 特點：方法簡單可靠，費用低，高通量,* MTT：3

10、-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,藥物毒性分析過程,LD50，IC50，EC50,線粒體毒性模型,Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological Development World Pharmaceutical Congress, June, 2010,ROS,ATP synthesis,Cyt c,Djm,關于藥物毒性分析數(shù)據(jù),毒性分析的結果是LD50或IC50或EC50，表示藥物導致細胞活力降低一半時需要的濃度 LD50或IC50或EC5

11、0越小，藥物毒性越大 每種細胞活力分析方法都具有片面性，多種方法測定一種化合物毒性是有益的 進行藥物毒性分析時，推薦使用人源的原代完整肝細胞，數(shù)據(jù)可靠性高 當使用永生化細胞和腫瘤細胞時，由于這些細胞(特別是腫瘤細胞)的藥物代謝能力較差，因此得到的細胞毒性數(shù)據(jù)是一種“本征毒性(intrinsic toxicity)”。將實驗數(shù)據(jù)推廣應用時，注意補償不同組織細胞的代謝能力。,藥物毒性和藥物-藥物相互作用,排出抑制型相互作用： 藥物1抑制藥物2的排出，導致藥物2濃度過高產生毒性 代謝抑制型相互作用 藥物1抑制藥物2的代謝，導致藥物2濃度過高產生毒性 代謝誘導型相互作用 藥物2誘導藥物2的代謝，導致

12、藥物2被過度活化，使代謝毒性產物濃度增加 藥物2因代謝失效,小結：ADMET研究諸方面,ADME：生物利用率,藥物間 相互作用,藥物分布,血漿蛋白 結合力,血腦屏障 滲透能力,藥物清除,藥物吸收,消化道穩(wěn)定性,腎排出,肝臟清除,代謝穩(wěn)定性,膽汁排出,溶解性,滲透能力,代謝誘導,代謝抑制,藥物毒性T,細胞活力 抑制分析,排出抑制,擴散能力,藥物外流載體,藥物吸收載體,代謝酶亞型,一個例子- 食物中的黃酮類化合物,食物成分黃酮類化合物及其作用,雌激素樣作用 弱類雌激素活性 防治一些和激素水平下降有關的疾病，如衰老、更年期綜合癥、骨質疏松、血脂升高等 抗雌激素活性 預防激素依賴型腫瘤及心血管疾病的發(fā)

13、生。 抗氧化作用 抑制腫瘤作用 降低膽固醇、調節(jié)血脂，預防心血管疾病和老年性癡呆癥,黃酮通式,異黃酮通式,黃酮苷和黃酮苷元,大豆異黃酮苷元,大豆異黃酮葡萄糖甙,水解,b-葡萄糖苷酶（腸道微生物）,腸道乳糖-根皮素水解酶,O,黃酮類化合物的吸收代謝機制,黃酮苷,黃酮苷元,水解,CYPs 代謝分解,MRP2,BCRP,UGT,SulT,緊密連接,MRP3,酶水解,酶水解,肝、腎排出,黃酮類化合物吸收的關鍵因素,黃酮苷的水解-利于吸收因素 腸道正常細菌群 黃酮苷元的代謝穩(wěn)定性-不利于吸收因素 II相代謝和II+向外排出 I相氧化分解 解決方法： 混合黃酮制劑 苷元羥基甲基化,思考題,什么是ADMET研究，在藥物發(fā)現(xiàn)中的作用是什么？ 現(xiàn)代ADMET方法有什么特點？ 什么是BCS？ 藥物消化道吸收的分子機制有那些？ 什么是Caco-2模型？如何從Pa