生化蛋白章節(jié)復習資料

1、 蛋白質的結構與功能1) 蛋白質的生物學作用：功能蛋白、結構蛋白具有以下幾種主要功能：1、 生物催化作用2、 代謝調節(jié)作用3、 免疫保護作用4、 物質的轉運和儲存5、 運動與支持作用6、 生長、繁殖、遺傳和變異作用7、 生物膜的功能和受體8、 另外，外源蛋白質有營養(yǎng)功能，可作為生產加工的對象2) 蛋白質的組成（元素組成、化學組成）及蛋白質含量的測定一、蛋白質的元素組成 蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質中的組成百分比約為：碳50，氫 7，氧 23，氮 16%，硫 03，其他 微量二、蛋

2、白質的含量測定 蛋白質中的氮占生物組織中所有含氮物質的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量。這是凱氏（Kjadehl） 定氮法的理論基礎。 蛋白質的含量=蛋白質含氮量100/16 =蛋白質含氮量6.25 3) 二十種氨基酸的結構、分類及名稱（三字縮寫符、單字縮寫符） 根據(jù)R側鏈基團解離性質的不同，可將氨基酸進行分類： 1.酸性氨基酸Glu，Asp；側鏈基團在中性溶液中解離后帶負電荷的氨基酸。 2.堿性氨基酸His，Arg，Lys；側鏈基團在中性溶液中解離后帶正電荷的氨基酸。

3、3.中性氨基酸 側鏈基團在中性溶液中不發(fā)生解離，因而不帶電荷的氨基酸?？煞譃椋?4、極性氨基酸： Ser，Tyr，Thr，Asn， Gln，Cys，Gly； 5、非極性氨基酸： Phe， Pro， Trp， Ala， Val， Leu，Ile，Met。 6、人體必需氨基酸有八種： Thr Ile Trp Leu Phe Met Val Lys 蘇 異 色 亮 苯 蛋 纈 賴 7、幾種重要的不常見的氨基酸 在少數(shù)蛋白質中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸

4、等。氨基酸的縮寫符號名稱三字符號單字符號丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE組氨酸HisH異亮氨酸IleI甘氨酸GlyG天冬酰胺AsnN名稱三字符號單字符號亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV4) 氨基酸的重要理化性質：兩性解離、茚三酮顯色、與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應、與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應1、 氨基酸的光吸收 組成天然蛋白質分子的20種氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對近紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm

5、左右，以色氨酸吸收最強。可利用此性質采用紫外分分光度法測定蛋白質的含量。2、 氨基酸的解離性質與等電點 氨基酸在結晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。 在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。 PH 1 7 10 凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子 負離子 等電點PI側鏈不含離解基團的中性氨基酸， pI = (pK1 + pK2 )/2 對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK值的算術平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 +

6、 pKR-COO- )/2 堿性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 三、茚三酮反應：氨基酸與茚三酮加熱反應產生藍紫色物質，其最大吸收峰在570nm波長處，因此可利用該性質進行比色可測定氨基酸的含量。脯、羥氨酸與之反應呈黃色，天冬酰胺與之反應呈棕色。5) 蛋白質的一級結構：肽、肽鍵、活性多肽及一級結構的測定 蛋白質的一級結構是構成蛋白質的氨基酸種類、數(shù)量和排列順序。一級結構中包含的共價鍵指肽鍵（peptide bond）和二硫鍵（disulfide bond）。 一、肽鍵與肽鏈一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。氨基酸通過肽鍵相連的化合物稱為肽。

7、 二、多肽 在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。 通常在多肽鏈的一端含有一個游離的a-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的a-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。 蛋白質是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結合而成的生物大分子。 蛋白質與多肽并無嚴格的界線，凡氨基酸殘基數(shù)目在50個以上，且具有特定空間結構的肽稱蛋白質；凡氨基酸殘基數(shù)目在50個以下，且無特定空間結構者稱多肽。 三、谷胱甘肽（GSH） 谷胱甘肽是由谷氨酸-Glu、半胱氨酸Cys、甘氨酸Gly組成的，是

8、體內重要的還原劑。2分子GSH（還原型谷胱甘肽）脫2H生成一分子GSSC（氧化型谷胱甘肽）。 四、催產素和升壓素 均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產和促使乳腺排乳作用。升壓素促進血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。（作了解） 五、蛋白質一級結構的測定原理1 測定蛋白質的一級結構的要求 A.樣品必需純（97%以上）； B.知道蛋白質的分子量； C.知道蛋白質由幾個亞基組成； D.測定蛋白質的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。 E.測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。2 N末端氨基酸的分析：二硝基氟苯（DNFBA）法、Edman降解法、氨肽酶法3

9、 C末端氨基酸的分析：肼解法、羧肽酶法6) 蛋白質的空間結構：二級結構單元（ -螺旋、-折疊、-轉角、自由回轉）、三級與四級結構（超二級結構、結構域、亞基）及結構與功能的關系（1） 維持蛋白質構象的化學鍵 維系蛋白質分子的一級結構：肽鍵、二硫鍵 維系蛋白質分子的二級結構：氫鍵 維系蛋白質分子的三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵 維系蛋白質分子的四級結構：范德華力、鹽鍵（二）蛋白質的二級結構蛋白質的二級結構(secondary structure)是指多肽鏈的主鏈骨架中若干肽單位，各自沿一定的軸盤旋或折疊，并以氫鍵為主要次級鍵而形成有規(guī)則的構象。主要有a-螺旋、-折疊、-轉角。蛋白質

10、的二級結構一般不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。1.肽單位：肽鍵與相鄰的兩個a碳原子所組成的基團，稱為肽單位或肽平面(peptide unit)。 O （1）肽鍵具有部分雙鍵的性質，不能自由旋轉。 CC NC （2）肽單位是剛性平面結構。 H （3）肽單位中與CN相連的H和O原子與碳原子呈反向分布。 （4）多肽鏈的盤旋或折疊是由肽鏈中許多碳原子的旋轉所決定的。2. -螺旋（-helix）：蛋白質分子中多個肽鍵平面通過氨基酸-碳原子的旋轉，使多肽鏈的主骨架沿中心軸盤曲成穩(wěn)定的-螺旋構象。a-螺旋有以下特征：（1）螺旋的方向為右手螺旋，每3.6個氨基酸旋轉一周，螺距為0.54 nm，每個氨基酸殘基的的高

11、度為0.15 nm，肽鍵平面與螺旋長軸平行。（2）氫鍵是 -螺旋穩(wěn)定的主要次級鍵。相鄰的螺旋之間形成鏈內氫鍵，即一個肽單位的N上氫原子與第四的肽單位羧基上的氧原子生成氫鍵。（3）肽鏈中氨基酸殘基的R基側鏈分布在螺旋的外測，其形狀、大小和電荷等均影響 -螺旋的形成和穩(wěn)定性。3.b-折疊(b-pleated sheet) b-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊的構象。-折疊有以下特征：a. 肽鏈的伸展使肽鍵平面之間一般折疊成鋸齒狀；b. 肽鏈平行排列，相鄰肽鏈之間的肽鍵相互交替形成氫鍵，是維持這種結構的主要次級鍵；c. 肽鏈平行的走向有

12、順式和反式兩種；d. 肽鏈的氨基酸殘基的R鍵分布在片層的上下。4. b-轉角(b-bend)-轉角是多肽鏈180回折部分所形成的一種二級結構，其結構特征為： 主鏈骨架本身以大約180回折; 回折部分通常由四個氨基酸殘基構成; 構象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來維系。 (4)這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。5. 無規(guī)線圈(random coil) 無規(guī)線圈是指多肽鏈主鏈部分形成的無規(guī)律的卷曲構象。 沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結構，通過主鏈間及主鏈與側鏈間氫鍵維持其構象(3) 超二級結構（基序） 是指在多肽內順序上相鄰的二級結構常常在空間折疊中靠近

13、,彼此相互作用,形成有規(guī)則的的二級結構聚集體。超二級結構的基本形式：； ；。超二級結構在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結構域。（4） 結構域(domain) 結構域：是位于超二級結構和三級結構間的一個層次。在較大的蛋白質分子中,由于多肽鏈上相鄰的超二級結構緊密聯(lián)系,進一步折疊形成一個或多個相對獨立的致密的三維實體,即結構域。有的蛋白質分子有一個結構域,有的有多個。(5） 蛋白質的三級結構(tertiary structure)具有二級結構、超二級結構或結構域的一條多肽鏈, 由于其序列上相隔較遠的氨基酸殘基側鏈的相互作用, 而進行范圍更廣泛的盤曲和折疊, 形成包括主、側鏈在內的空

14、間排列, 這種在一條多肽鏈中所有原子或基團在三維空間的整體排布稱為三級結構。蛋白質的三級結構是指多肽鏈中所有原子或基團的空間排列。即多肽鏈在二級結構的基礎上，由氨基酸側鏈基團的相互作用使多肽鏈進一步盤旋和折疊，導致整個分子形成不規(guī)則的特定構象。（6） 蛋白質的四級結構(Quaternary Structure) 由兩個或兩個以上的亞基之間相互作用，彼此以非共價鍵相聯(lián)而形成更復雜的構象，稱為蛋白質的四級結構。 亞基(subunit)就是指參與構成蛋白質四級結構的、每條具有三級結構的多肽鏈。7) 蛋白質的性質：大分子性質、蛋白質分子量的測定（離心法、凝膠過濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）、兩性

15、解離（等電點、電泳、離子交換）、膠體性質、蛋白質沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白質變性、紫外吸收及顏色反應1、 蛋白質分子的大小、形狀及分子量的測定1.分子篩層析法 2.SDS-PAGE 3.生物質譜 4.超速離心法二、蛋白質的變性蛋白質的高分子特性形成了復雜而特定的空間構象，從而表現(xiàn)出蛋白質特異的生物學功能。某些物理的和化學的因素使蛋白質分子的空間構象發(fā)生改變或破壞，導致其生物活性的喪失和一些理化性質的改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性(denaturation) 。1. 變性的本質 蛋白質變性作用的本質是破壞了形成與穩(wěn)定蛋白質分子空間構象的次級鍵，從而導致蛋白質分子空間構象的改變或破壞，而不

16、涉及一級結構的改變或肽鍵的斷裂。2. 變性作用的特征（1）生物活性的喪失（2）某些理化性質的改變物理性質改變，如：溶解度降低，粘度升高，失去結晶能力，旋光值改變。化學性質改變，如：蛋白質變性時，有些原來在分子內部包藏而不易與化學試劑起反應的側鏈活性基團，由于結構的伸展松散而暴露，易與化學試劑反應。（如-SH、咪唑基、-OH）。生物化學性質改變：蛋白質變性后，分子結構伸展松散，易為蛋白質水解酶所分解。生物堿試劑變性：三氯醋酸、磷鎢酸、水楊酸等。在pHpI時，蛋白質帶正電，和有 機酸根離子易結合形成沉淀，導致變性。重金屬鹽變性：在pHpI時，蛋白質帶負電，更易與重金屬離子（Hg2、Pb2+、Cu2

17、+）結合形成沉淀，導致變性。 兩性電離 三、蛋白質的兩性電離與等電點 兼性離子 PH=PI陽離子PHPI在等電點時(Isoelectric point，pI)，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis)。4、 蛋白質的膠體性質1. 蛋白質表面具有水化層2. 蛋白質表面具有同性電荷5、 蛋白質的沉淀反應鹽析法 高鹽濃度時，因破壞蛋白質水化層并中和其電荷，促使蛋白質顆粒相互聚集而沉淀，

18、這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。 低度濃度可使蛋白質溶解度增加，稱為鹽溶作用有機溶劑沉淀 與水互溶的有機溶劑（丙酮、乙醇等），這些溶劑與水的親和力大，能奪取蛋白質顆粒上的水化膜，加之有機溶劑的介電常數(shù)低，分子間引力加大，蛋白質溶解度降低而沉淀。加熱沉淀反應 加熱滅菌的原理是因加熱使細菌蛋白變性凝固而失去生物活性的結果。 重金屬鹽沉淀蛋白質 生物堿試劑沉淀蛋白質六、蛋白質的顏色反應1. 茚三酮反應：在pH57時，蛋白質與茚三酮丙酮液加熱可產生藍紫色。2. 雙縮脲反應：蛋白質在堿性溶液中可與Cu2+產生紅色反應。3.酚試劑反應：在堿性條件下，蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑生成藍色化合物8) 蛋白質的分離與純化的基本原理一. 蛋白質的提取二. 蛋白質的分離與純化1. 根據(jù)溶解度不同的分離純化方法：（1）等電點沉淀法（2）鹽析沉淀法（3）低溫有機溶劑沉淀法（4）溫度對蛋白質溶解度的影響2. 根據(jù)分子大小不同的分離純化方法：（1）透析和超濾法（2）分子篩層析 原理：利用分子量的差異（3） 密度梯度離心3. 根據(jù)電離性質不同的分離純化方法（1）電泳法（2）離子交換層析 陰離子交換樹脂含有堿性基團