在酵母菌酰胺型生物溶劑中的培養(yǎng)特性研究演示課件

1、酵母菌在酰胺型生物溶劑中的培養(yǎng)特性研究,答 辯 人：高忠添 班 級(jí)：生物0711 學(xué) 號(hào)：2007221026 指導(dǎo)老師：歐光南博士,1,目錄,研究背景 研究?jī)?nèi)容與意義 生物溶劑的設(shè)計(jì) 微生物培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析 結(jié)論,2,一、研究背景,生物工程學(xué)家對(duì)微生物和酶在有機(jī)溶劑諸多方面展開研究，發(fā)現(xiàn)許多具有商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的化合物能通過酶或微生物轉(zhuǎn)化得到，但是大多數(shù)化合物的水溶性差，影響了在水相中的轉(zhuǎn)化效率。而在有機(jī)介質(zhì)中的生物催化已發(fā)展成為解決此類問題的一個(gè)有效手段。 1984 年以來, 美國(guó)麻省理工學(xué)院Zaks 和Klibanov 教授為首的研究小組,一直從事非水系統(tǒng)的酶反應(yīng)研究, 取得了引人注目的

2、成果, 并由此產(chǎn)生了一個(gè)全新的分支學(xué)科! 非水酶學(xué)。多年的研究表明, 用有機(jī)溶劑代替水溶劑作為有些酶的反應(yīng)介質(zhì)是可行的,3,二、研究?jī)?nèi)容與意義,本論文通過釀酒酵母菌在含新型有機(jī)溶劑N-羥甲基甲酰胺（HOF）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)特性的研究，希望開發(fā)新型生物溶(Biosolvent)，進(jìn)一步推動(dòng)非水相催化工藝的廣泛應(yīng)用和深入發(fā)展，為微生物非水培養(yǎng)和藥物非水制劑開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義,4,三、生物溶劑的設(shè)計(jì),1、生物溶劑設(shè)計(jì)基本原則 A生物溶劑母體結(jié)構(gòu)應(yīng)具有強(qiáng)解離能力，即有高介電常數(shù)，以保證電解質(zhì)電離后能形成自由離子，而不產(chǎn)生離子對(duì)。 B電解質(zhì)的電離決定于溶劑的電離能力，要求溶劑既有較

3、大的AN值（Lewis酸），又有較大的DN值（Lewis堿），即為兩性溶劑。 根據(jù)上述設(shè)計(jì)原則，在甲酰胺溶液( = 111.0)母體結(jié)構(gòu)上引入羥基（有大的AN和DN）形成HOF(90.0,5,三、生物溶劑的設(shè)計(jì),2、HOF合成 合成路線,甲酰胺20 mL ，堿催化劑NaOH 0.12 g、水25 mL，攪拌溶解，冰浴，緩慢滴加37 %甲醛溶液44 mL ，pH=9，反應(yīng)24h,6,三、生物溶劑的設(shè)計(jì),4、HOF的表征 核磁共振確定HOF是較純物質(zhì),3、HOF純化 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去非反應(yīng)的甲醛和水等物質(zhì) 離子交換去除離子 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除水分,7,三、生物溶劑的設(shè)計(jì),HOF的油水分配系數(shù)測(cè)定 三氯乙酸電

4、離常數(shù)測(cè)定 介電常數(shù)測(cè)定,5、HOF物化性質(zhì)的測(cè)定,8,四、微生物培養(yǎng),釀酒酵母菌菌種活化 抑菌實(shí)驗(yàn) HOF對(duì)釀酒酵母最低的抑菌濃度 制作生長(zhǎng)曲線 釀酒酵母核酸釋放量的測(cè)定,9,五、結(jié)果,1.HOF表征,圖1 HOF的 HNMR譜圖,10,五、結(jié)果,圖2 HOF溶液的CNMR,1.HOF表征,由圖和圖2可知，HOF是較純物質(zhì),11,五、結(jié)果,表1 HOF溶液物化參數(shù),1、HOF log P=-1.2說明HOF溶液是一種親水型有機(jī)溶劑； 2、HOF的介電常數(shù)為98，與水的介電常數(shù)81.0相近，說明HOF的解離能力與水相近； 3、TCA在HOF中的pKa為0.85，在水中則是0.7，說明HOF溶液

5、與水的電離能力相近。 結(jié)論：HOF的性質(zhì)與水相似，是一種潛在的生物溶劑,2、HOF物化性質(zhì),12,五、結(jié)果,3、釀酒酵母菌種活化,右圖3 可知，活化后的菌種是純正的酵母菌,13,五、結(jié)果,4、抑菌實(shí)驗(yàn),a,b,圖4 A,I-蒸餾水 C-甲酰胺 B, G,H-生理鹽水 D-異丙醇 E,F-HOF 圖4 甲酰胺、異丙醇和HOF對(duì)釀酒酵母菌均出現(xiàn)抑菌圈，蒸餾水和 生理鹽水沒有抑菌圈,14,五、結(jié)果,表2 釀酒酵母菌在不同HOF濃度下測(cè)出的A600值,5、HOF對(duì)釀酒酵母菌的最低抑菌濃度,15,五、結(jié)果,5、HOF對(duì)釀酒酵母菌的最低抑菌濃度,圖5：酵母菌在不同濃度 HOF生長(zhǎng)情況,由表2可知HOF對(duì)釀

6、酒酵母菌的最低抑菌濃度，在0.8%-1%之間,16,五、結(jié)果,4、制作生長(zhǎng)曲線,圖6 酵母菌在30攝氏度的生長(zhǎng)曲線,從圖6可知酵母菌生長(zhǎng)延滯期的時(shí)間為3h，對(duì)數(shù)期的時(shí)間為11h，酵母菌對(duì)數(shù)后期為14h,17,五、結(jié)果,5、釀酒酵母菌核酸釋放量的測(cè)定,表3 酵母菌在不同液體里面，不同時(shí)間的A260值,18,五、結(jié)果,6、釀酒酵母菌核酸釋放量的測(cè)定,表3和圖7可知： 1、說明核酸有在增殖 2、異丙醇能使核酸變性 3、HOF會(huì)影響酵母菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使核酸釋放變大，抑制釀酒酵母菌生長(zhǎng),圖7 不同溶劑酵母菌溶液,19,六、分析討論,1、HOF溶液的似水性 log P=-1.2說明HOF溶液是一種親水

7、型有機(jī)溶劑 HOF溶液的介電常數(shù)為98，與水的介電常數(shù)81.0相近，說明HOF溶液與水的解離能力相近 TCA在HOF中的pKa為0.85，在水中則是0.7，說明HOF溶液與水的電離能力相近。 綜上，HOF的物化性質(zhì)與水非常相似，具有強(qiáng)電離和解離能力，有利于生物催化劑的活性，是一種很有開發(fā)潛質(zhì)的新型生物溶劑,20,六、分析討論,破壁的釀酒酵母菌核酸釋放量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變大，因此，釀酒酵母菌核酸有不同量的增殖。 在異丙醇中破壁核酸量明顯比其他三者低，說明異丙醇能使核酸變性。 在HOF中，24 h的核酸釋放量明顯比其他三者大，可以推測(cè)HOF對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作用，使釀酒酵母菌核酸大量外泄而抑制

8、其生長(zhǎng)。24h破壁的核酸釋放量和生理鹽水，相差不多，說明HOF不會(huì)讓核酸變性,2、釀酒酵母菌核酸釋放量的測(cè)定,21,七、結(jié)論,HOF是一種親水型有機(jī)溶劑。 HOF具有強(qiáng)電離和解離能力，是一種很有開發(fā)潛質(zhì)的新型生物溶劑。 HOF具有抑菌作用。 酵母菌在30下，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期為14h。 HOF對(duì)釀酒酵母菌最低的抑制濃度為0.8%-1% HOF影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使釀酒酵母菌核酸大量外泄而抑制其生長(zhǎng),22,致謝,本論文是在導(dǎo)師歐光南老師的精心指導(dǎo)下完成的。導(dǎo)師無(wú)論在工作中還是在生活上都給予了無(wú)微不至的關(guān)懷，在論文的書寫方面，他總會(huì)以“專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”嚴(yán)格要求我，始終認(rèn)真負(fù)責(zé)地給予指導(dǎo)，幫助我開拓思路，提高研究分析能力。正是歐老師的無(wú)私幫助與熱忱鼓勵(lì)，我的畢業(yè)論文才能夠得以順利完成。在此我表示最誠(chéng)摯的感謝！ 同時(shí)我還要感謝畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)小組的張玲嬌、雷建輝、李雪晶等同學(xué)的幫助在