糖化曲的制備及其酶活力的測定

1、發(fā)酵食品工藝學理論課教學大綱學時：36學分：2制訂者：陳曉紅審核者：徐幸蓮一、 課程性質：食品科學與工程本科專業(yè)必修課二、教學目的與要求：發(fā)酵食品工藝學是一門綜合性及實踐性很強的課程，內容既以微生物生理及其發(fā)酵的生化機制、微生物遺傳育種、代謝調節(jié)等理論為基礎，又以化工原理、發(fā)酵動力學、發(fā)酵技術及設備等工科內容為支撐，要求學生通過本課程的學習，深入探討發(fā)酵食品的微生物作用機制、發(fā)酵與釀造的調控等理論，了解發(fā)酵食品生產的工藝原理、產品的形態(tài)、種類及其衛(wèi)生與安全等方面的基本知識，掌握發(fā)酵食品生產的工藝設計和品控措施、發(fā)酵生產的一般工程計算、新產品開發(fā)思路等技能。以適應食品研究開發(fā)、生產經營管理、質量

2、控制等各行業(yè)對人才知識結構的需求。三、課程內容改革內容上刪減了部分總論內容，增加了固液態(tài)發(fā)酵的特點及調控、曲的微生物及生物化學、功能性發(fā)酵食品與食品添加劑、發(fā)酵食品的安全性、世界新型發(fā)酵食品等方面內容。理論教學采用實物投影、膠片投影、多媒體課件相結合的方法，實驗實踐教學分為三大模塊：發(fā)酵工廠參觀實習（實踐）、基本技能和技巧訓練、綜合設計模擬試驗。四、理論教學內容與學時安排第一章 緒論（2學時）1、什么是發(fā)酵、釀造2、發(fā)酵食品的淵源及其文化內涵3、發(fā)酵的微生物和工程技術發(fā)展史4、發(fā)酵食品工程及產品特點5、發(fā)酵技術的發(fā)展趨勢及研究熱點第二章 發(fā)酵與釀造食品的一般工藝和原理（3學時）第一節(jié)發(fā)酵的基本

3、要素及調控（1學時）1、發(fā)酵基質2、環(huán)境條件3、發(fā)酵微生物第二節(jié) 發(fā)酵生產一般工藝（1學時）1、發(fā)酵工藝類型2、固液態(tài)發(fā)酵的工藝過程3、固液態(tài)發(fā)酵的特點第三節(jié) 發(fā)酵食品形成的一般生化歷程（1學時）1、原料降解2、目的產物轉化3、產物再平衡第三章 發(fā)酵微生物及發(fā)酵劑（4學時）第一節(jié)通常參與發(fā)酵的微生物（第一、二節(jié)共1學時）第二節(jié) 生產用菌種的選育及保藏1、菌種選育的一般程序和方法2、生產菌種的保藏原則及措施第四節(jié) 發(fā)酵劑的類型及制備（第三、四節(jié)共3學時）1、生產發(fā)酵劑的概念及類型2、直投式發(fā)酵劑簡介3、生產用發(fā)酵劑生產及使用原則第五節(jié) 曲的微生物學及生物化學1、中國曲的特點及存在形式2、種曲和曲

4、3、曲的生產工藝第四章 發(fā)酵與釀造過程調節(jié)控制（3學時）第一節(jié)發(fā)酵過程的代謝變化1、與代謝變化有關的參數(shù)2、代謝變化和代謝曲線第二節(jié) 深層液態(tài)發(fā)酵過程調控1、基質濃度的變化及控制2、溫度變化及控制3、溶氧濃度及控制4、pH變化及控制5、泡沬的產生及消除6、發(fā)酵終點的判斷7、無菌檢查及異常發(fā)酵處理8、發(fā)酵的染菌及防止第三節(jié) 固態(tài)發(fā)酵過程調控1、固態(tài)發(fā)酵工程的特點2、固態(tài)發(fā)酵工程技術沿革3、固態(tài)發(fā)酵過程調控參數(shù)4、釀造調控第五章 酒精發(fā)酵與釀酒工藝學（10學時）第一節(jié)酒精發(fā)酵（一、二節(jié)共3學時）1、酒精發(fā)酵原料2、與酒精發(fā)酵有關的微生物3、酒精發(fā)酵生化機制4、酒精發(fā)酵工藝5、酒精蒸餾與精餾第二節(jié)

5、白酒釀造1、中國名酒簡介2、白酒的種類、風味物質成分和品質評價3、白酒釀造工藝4、酒類陳釀的機理及催陳方法第三節(jié) 葡萄酒釀造（3學時）1、世界名酒及其歷史簡介2、葡萄酒的分類方法3、葡萄原料及制汁調整4、參與發(fā)酵的微生物及發(fā)酵機制5、葡萄酒發(fā)酵工藝第四節(jié) 啤酒釀造（3學時）1、啤酒種類及其品質2、啤酒釀造原料3、麥芽制造4、麥汁制備5、發(fā)酵工藝6、過濾和灌裝第五節(jié) 黃酒釀造（1學時）1、黃酒的種類2、黃酒原料及曲3、黃酒工藝第六章 醋酸發(fā)酵與釀醋工藝學（4學時）第一節(jié) 醋酸發(fā)酵工藝1、參與的微生物2、醋酸發(fā)酵的工藝類型3、醋酸的提取及后加工第二節(jié) 食醋生產工藝1、食醋的成分和功能性2、生產用原

6、料及預處理3、食醋的固態(tài)發(fā)酵工藝4、食醋的液態(tài)深層發(fā)酵工藝第七章 醬油及豆制品發(fā)酵工藝學（6學時）第一節(jié)醬類與醬油釀造（第一、二節(jié)共4學時）1、醬類與醬油釀造原料2、醬類與醬油釀造的微生物及菌群演替3、釀造理論4、醬油釀造工藝及新技術應用5、制醬工藝第二節(jié)腐乳制造工藝1、腐乳制造技術沿革2、腐乳類型及產品特點3、腐乳的原料及處理4、腐乳發(fā)酵5、腐乳生產中常見問題及解決措施第三節(jié)豆豉及納豆（1學時）1、豆豉的產品特性2、傳統(tǒng)豆豉生產過程及微生物菌群演替3、納豆的產品特性4、納豆菌及納豆生產第六節(jié) 丹貝生產工藝（1學時）1、生產原料及預處理2、丹貝生產工藝3、丹貝發(fā)酵過程控制4、丹貝及其衍生產品的

7、功能性第八章 微生物性功能食品與食品添加劑（2學時）第一節(jié)功能性發(fā)酵制品1、微生物多糖2、活性肽3、功能性發(fā)酵乳制品和肉制品第三節(jié) 微生物性食品添加劑1、黃原膠2、紅曲及食用微生物色素3、乳酸菌素及生物防腐劑4、細菌纖維素5、微生物性風味物質第九章 發(fā)酵食品的安全性（2學時）第一節(jié)發(fā)酵食品安全性問題起源第二節(jié)微生物代謝產物安全性1、霉菌發(fā)酵產品安全性2、細菌發(fā)酵產品安全性3、微生物發(fā)酵的旁路代謝產物安全性發(fā)酵食品工藝學實驗教學大綱學時：18學分：1制訂者：陳曉紅審核者：徐幸蓮一、面向專業(yè)：食品科學與工程二、實驗內容和學時分配：本實驗課共有9個實驗，其中驗證性實驗3個，設計性實驗2個，綜合性實驗

8、4個。三、具體實驗內容：實驗一 小曲中霉菌、酵母菌的分離及純化（3學時）目的要求：1、了解酒藥中主要的霉菌及酵母菌2、掌握根霉菌、酵母菌的生長特點及分離技巧3、掌握霉菌的菌種轉接及純化方法實驗二孢子懸浮液的制備及孢子發(fā)芽力的測定（3學時）目的要求：1、掌握孢子懸浮液制備及孢子發(fā)芽力測定的基本原理2、學會判斷孢子質量的方法3、掌握孢子發(fā)芽力的測定方法實驗三菌種保藏（3學時）目的要求：1、了解不同菌種保藏的基本原則2、掌握細菌的凍干及甘油管保藏、孢子的砂土管保藏、酵母菌的低溫斜面保藏方法實驗四市售活性干酵母發(fā)酵力的測定及發(fā)酵過程中菌體形態(tài)觀察（3學時）目的要求：1、了解常用的酵母發(fā)酵力測定方法2、

9、掌握簡單的酵母發(fā)酵力測定方法3、學會觀察發(fā)酵液中酵母菌的發(fā)芽繁殖過程及發(fā)酵液中酵母菌死活細胞的區(qū)分方法（美蘭染色）實驗五發(fā)酵劑的制備及不同菌種比例對酸奶產品品質的影響（3學時）目的要求：1、掌握乳酸菌的菌種活化及其活力判斷方法2、掌握酸奶發(fā)酵劑常用的菌種比例及其對產品品質影響的機理3、掌握乳酸菌發(fā)酵酸奶的工藝綜合模擬試驗（共3至4天）：實驗六谷氨酸生產種子制備及種子質量檢查目的要求：1、掌握谷氨酸生產一級、二級種子制備的程序2、了解發(fā)酵種子質量指標并學會判斷3、掌握生產種子制備的一般原則實驗七谷氨酸發(fā)酵罐發(fā)酵目的要求：1、掌握谷氨酸發(fā)酵的基本操作流程2、掌握發(fā)酵罐的四大系統(tǒng)及空消、實消的注意事

10、項3、了解發(fā)酵罐壓差接種步驟、掌握火圈接種方法4、學會發(fā)酵罐發(fā)酵的過程管理實驗八無菌檢查目的要求：1、觀察谷氨酸發(fā)酵菌種的基本形態(tài)2、掌握平板劃線、直接鏡檢法進行無菌檢查3、判斷發(fā)酵過程是否染菌實驗九發(fā)酵過程代謝曲線測定目的要求2、掌握發(fā)酵液中菌體生物量、總糖、谷氨酸量、pH的測定方法3、繪制發(fā)酵過程代謝曲線實驗十發(fā)酵終點判斷及發(fā)酵液后處理目的要求：1、了解谷氨酸發(fā)酵終點判斷的主要指標2、掌握終止發(fā)酵的方法3、學會進行發(fā)酵液的后處理四、成績考核：考核方式為實驗過程中操作技能抽檢，并結合實驗報告質量打分。發(fā)酵食品工藝學實踐教學大綱學時：9學分：制訂者：陳曉紅審核者：徐幸蓮一、目的要求：通過參觀實

11、習，讓學生了解發(fā)酵工廠的基本格局、發(fā)酵產品的品控措施及檢測方法、CIP設備及流程、發(fā)酵罐構造及工藝設計理念。二、基本內容及時間地點：1、南京機輪調味品有限公司參觀實習（半天）內容：了解固態(tài)發(fā)酵調味品的現(xiàn)代化工藝流程、圓盤制曲機械構造、醬油的品控措施及主要技術指標、了解發(fā)酵工廠的廢水處理措施。2、南京金陵啤酒有限公司參觀實習（半天）內容：了解啤酒的種類及不同品種的工藝差別，認識酒花、麥芽及其類型，觀察糖化車間的布局特點，了解發(fā)酵車間罐體、管道的在線清洗和滅菌的現(xiàn)代方法，認識啤酒后加工的設備等。3、南京奶業(yè)集團發(fā)酵乳車間實習（半天）內容：了解發(fā)酵乳的原料要求及原料乳的品控方法（快速檢測），認知大規(guī)

12、模發(fā)酵乳生產的工藝及關鍵控制點，建立無菌空間及管道的設計理念。三、成績考核：考核方式為以課堂交流的形式考察學生的認知程度。實驗一小曲中根霉菌的分離純化及酒釀制作一、實驗目的：1、了解小曲的多種形態(tài)、其中的主要微生物及其在米酒發(fā)酵中的作用2、根據(jù)根霉菌生長特性設計特有的分離及形態(tài)觀察方法3、掌握酒釀制作的基本原理、實驗方法及品質控制和評定方法二、實驗原理：小曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌，還有一些特有的酶類，在米酒釀造中根霉菌通常起雙邊發(fā)酵的作用，因此根霉種類、發(fā)酵特性對于產品的特性品質具有非常重要的意義。根霉在人工培養(yǎng)基或自然基物上生長時，菌絲體向空間延伸，遇光滑平面后營養(yǎng)菌絲體形成葡蔔枝，節(jié)

13、間產生假根，假根處葡蔔枝上著生成群的孢子囊梗，柄頂端膨大形成孢子囊，囊內產生孢子囊孢子。進行根霉菌分離時常利用此生長和形態(tài)特性判斷是否根霉菌，再挑取單個孢子囊孢子進行純化。酒釀制作所用原料多為糥米，其主要成分為淀粉，經過蒸煮糊化后，利用小曲中根霉菌較強的液化和糖化能力將其中的淀粉降解為不可酵糖和可酵糖，由淀粉降解為葡萄糖等還原糖的過程通常稱為糖化，可酵糖供根霉菌本身的酒化酶及酵母菌利用產生酒精，不可酵糖則殘留在發(fā)酵醪中形成米酒或酒釀特有的體和甜香味。不同品牌小曲中的根霉菌菌種不同，發(fā)酵時間和其它環(huán)境條件要求也不同，通過對發(fā)酵過程中還原糖、酒精度等參數(shù)的測定，結合發(fā)酵物的感官評定，判斷是否終止發(fā)

14、酵。三、試劑和器材：安琪牌米酒酒藥，PDA培養(yǎng)基，糥米等培養(yǎng)皿，載玻片，顯微鏡，蒸飯設備，發(fā)酵器皿等四、方法與步驟：（一）根霉菌的分離和鑒定：1、分離方法本實驗直接用融化的玉脂培養(yǎng)基稀釋分離。這一方法對于在原材料中占較大數(shù)量比例的微生物尤為適用。（1）酒精洗研缽、燒灼、殺菌。將0.5g酒藥放入缽中，加無菌水5ml，研磨成粉。（2）瓊脂培養(yǎng)基融化后，冷地至45（置45水溶中）。（3）取其中的一支試管，用接種環(huán)挑取待分離材料少許。放入試管中已融化為液狀的瓊脂培養(yǎng)基中，賽回棉賽、雙手搖搓度管，使接種物混勻。（4）取第2根試管，用接種環(huán)從第一管中取12環(huán)接入第2管中，如上法混勻，再同法移入第3管中。（

15、5）依次把3支試管培養(yǎng)分別傾入3個已滅菌的培養(yǎng)皿中制成平板，置2528的恒溫箱內培養(yǎng)。操作過程圖解如下：圖1 稀釋分離法示意圖（6）培養(yǎng)1718小時后，透過平皿對光觀察，有無菌絲生長，用接種針挑挖菌絲少許。接于斜面培養(yǎng)基上，即可純化。2、鑒定方法（1）分別挑取匍枝根霉和另一根霉屬未知菌種的少量孢子，接入含有普氏培養(yǎng)液的試管中（每個菌種接6支，共接12支），每個菌種各取2支分別置28、37、45培養(yǎng)23天。（2）取任意兩分離株，分別以八字形劃線接種，在同一PDA平報的兩側見圖2。（共接2個平板）置25培養(yǎng)45天。圖2 八字形劃線接種法（3）特征觀察肉眼觀察觀察上述和分離株的菌落特征。觀察匍枝根霉

16、和根霉屬另一分離株在不同溫度的普氏fer氏培養(yǎng)液中的生長情況。鏡檢1）培養(yǎng)物直接觀察無性階段特征觀察：將長有上述菌種的平板直接置于低倍鏡下，分別觀察它的孢囊、形狀、著生位置及分枝情況，孢子囊的形狀，并注意有無假根特征。有性階段性特征觀察：用低倍或高倍顯微鏡觀察，根霉屬未和菌種是否形成接合孢子。2）培養(yǎng)物制片觀察制片：滴一滴乳酸苯酚于潔凈載玻片中央，用一無菌的解剖針挑取少量平板中的培養(yǎng)物。浸入載玻片上的乳酸苯酚液內，而后用兩根無菌的解剖針將菌絲撕開，使其全部打濕，蓋上蓋玻片。即成臨時性載片標本。無性階段特征觀察：用裝有已標定過的目鏡測微尺的低倍或高倍顯微鏡觀察孢囊梗的形狀、大小、顏色、排列、著生

17、位置和分枝情況；孢子囊和孢囊孢籽的形狀、大小、紋飾和顏色；囊軸的形狀、大小、紋飾和顏色；囊托的形狀、大小和顏色，并注意有無厚垣孢子（包括著生位置和假根，以及假根的形狀，發(fā)達程度和顏色等特征）。有性階段特征觀察：用低倍或高倍顯微鏡觀察接合孢子有無，若有則注意觀察接合孢子的形狀、大小和附屬絲等特征。五、結果記錄與思考題1將上述觀察到的各項結果分別填入表1中。2繪制上述各菌種的形態(tài)特征圖（如有接合孢子，也需繪制）。3根據(jù)觀察結果：分別查閱根霉（附表，常見種檢索表，將以上未知分離菌株鑒定到種。（二）酒釀制作：工藝流程糥米 清洗 浸泡 蒸飯 淋飯 拌藥 搭窩 發(fā)酵各工序要點：(1) 糥米浸泡和般以10到

18、13為宜，時間約24小時，可因溫度不同而調整浸泡時間。(2) 蒸飯即糊化過程，也稱為淀粉的熟化，對蛋白質而言可使其變性，時間一般為上汽后半小時左右，要求飯粒熟而不爛，飯粒完整。(3) 淋飯目的在于：降溫；去除飯粒表面粘物以免發(fā)酵中粘連成團不利發(fā)酵。用潔凈自來水沖淋至35左右。(4) 拌藥：用量和般為千分之一至千分之五，拌藥時注意潔凈。(5) 發(fā)酵時間和溫度視不同酒藥及菌種而定。五、結果與分析：1、描述根霉菌的形態(tài)2、發(fā)酵期間為什么要進行攪拌？制作甜酒釀的關鍵操作是什么？3、描述酒釀發(fā)酵過程中醅的變化，評定所制得的酒釀的品質實驗二孢子懸浮液制備及孢子數(shù)測定一、實驗原理孢子制備是發(fā)酵工業(yè)生產中不可

19、缺少的一個環(huán)節(jié)，孢子質量的好壞將直接影響到發(fā)酵生產的成功與否。孢子制備一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基或一般固體培養(yǎng)基經接種后在適宜的條件下進行培養(yǎng)而得，制備的孢子在外觀上應生長豐滿、色澤正常、無雜菌污染且發(fā)酵單位高、生產性能穩(wěn)定。斜面或其它固體培養(yǎng)基中的孢子數(shù)量是衡量孢子質量的一個重要指標。孢子數(shù)的測定可采用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接進行測定。二、實驗器材（一）材料1PDA培養(yǎng)基2麩皮（市售）3菌種：黑曲霉Co827（檸檬酸產生菌）（二）儀器設備1顯微鏡2三角瓶（250ml）3血球計算板4高壓滅菌鍋三、操作步驟1馬苓薯培養(yǎng)基（PDA）配制：馬鈴薯（去皮）200g、蔗糖（或葡萄糖）20g、瓊脂20g、水1

20、000ml，將馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000ml煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加糖及瓊脂完全溶解后加水補充至1000ml，pH自然。分裝于試管后于121滅菌30分鐘，冷卻放置斜面即可。2麩曲培養(yǎng)基制備：取市售、無霉變麩皮過篩去除細粉（50目篩），稱取8g麩皮，加入250ml三有瓶中，加水約8ml拌均，于121滅菌30min即得。3接種：取Co827菌種一支，采用無菌操作對斜面及麩曲瓶進行接種，其中麩曲瓶中接入一環(huán)原種孢子即可。4培養(yǎng)：將斜面及麩曲瓶置于培養(yǎng)箱內，321培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)時間為67d；麩曲瓶培養(yǎng)810d，麩曲培養(yǎng)過程中要求每天翻動一次，直至有孢子產生時停止翻動。培養(yǎng)完成

21、后即得斜面孢子及麩曲孢子。5孢子數(shù)測定：（1）取已培養(yǎng)好的Co827斜面菌種一支，加入5ml無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，將該孢子懸浮液置于已滅菌50ml三角瓶內，瓶中預先放置數(shù)粒無菌玻璃球，充分振搖后用滅菌的脫脂棉進行過濾，并用無菌水沖洗濾渣23次，最終使濾液體積達到10.0ml，待測孢子懸浮液即得。（2）將孢子懸浮液用無菌水稀釋至10-2、10-3，吸取適量的稀釋液至血球計數(shù)板的計數(shù)室內，然后加上蓋玻片，靜置約5min，先在低倍鏡下找到計數(shù)室，再轉換成高倍鏡觀察并計數(shù)。（3）計數(shù)時用16中格計數(shù)板，要按對角線方位，取左上、在下、右上、右下的4個中格（即100小格）的孢子數(shù)。如果是25中

22、格計數(shù)板，除數(shù)上述四格外，還需數(shù)中央1中格的孢子數(shù)（即80小格）。由于孢子在計數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調節(jié)微調螺旋，方能數(shù)到全部孢子，防止遺漏。如孢子位于中格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。四、實驗結果1正確描述斜面、麩曲瓶培養(yǎng)過程中菌絲生長及孢子形成的基本現(xiàn)象。2計算每ml懸浮液中的孢子數(shù)及每支斜面的孢子數(shù)孢子數(shù)（個/ml懸液）= 稀釋倍數(shù)每支斜面孢子數(shù)=孢子數(shù)/ml懸液懸浮液總體積（ml）n為第小格中的孢子平均數(shù)（個）實驗三醬油種曲孢子數(shù)及發(fā)芽率的測定（一）醬油種曲孢子數(shù)測定1 目的掌握應用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)方法。

23、2 原理種曲是成曲的曲種，是保證成曲的關鍵，是釀制優(yōu)質醬油的基礎。種曲質量要求之一是含有足夠的孢子數(shù)量，必須達到6109/g（干基計）以上，孢子旺盛、活力強、發(fā)芽率達85%以上，所以孢子數(shù)及其發(fā)芽率的測定是種曲質量控制的重要手段。測定孢子數(shù)方法有多種，本實驗采用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，這是一種常用的細胞計數(shù)方法。此法是將孢子懸浮液放在血球計數(shù)板與蓋片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室中的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的孢子數(shù)目來計算單位體積的孢子總數(shù)。實驗中，稱樣時要盡量防止孢子的飛揚。測定時，如果發(fā)現(xiàn)有許多孢子集結成團或成堆，說明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必

24、須重新稱生、振搖、稀釋。生產實驗中應用時，種曲通常以干物質計算。3 材料3.1 樣品醬油種曲。3.2 儀器和器具蓋玻片、旋渦均勻器、血球計數(shù)板、電子天平、顯微鏡。3.3 試劑95%酒精、稀硫酸（110）。4 流程曲種稱量稀釋過濾定容制計數(shù)板觀察計數(shù)計算5 步驟5.1 樣品稀釋精確稱取種曲1g（稱準至0.002g），倒入盛有玻璃株的250mL三角瓶內，加入95%酒精5mL、無菌水20mL、稀硫酸（110）10mL，在旋渦均勻器上充分振搖，使種曲孢子分散，然后用3層紗布過濾，用無菌水反復沖洗，務使濾渣不含孢子，最后稀釋至500mL。5.2 制計數(shù)板取潔凈干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子

25、稀釋液1小滴，滴于蓋玻片的邊緣處（不宜過多），讓滴液自行滲入計數(shù)室中，注意不可有氣泡產生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止5min，待孢子沉降。5.3 觀察計數(shù)5.3.1 觀察用低倍鏡頭和高倍鏡頭觀察，由于稀釋液中的孢子在血球計數(shù)板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計數(shù)時必須逐格調動微調螺旋，才能不使之遺漏，如孢子位于格的線上，數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。5.3.2 計數(shù)使用1625規(guī)格的計數(shù)板時，只計板上4個角上的4個中格（即100個小格），如果使用2516規(guī)格的計數(shù)板，除計4個角上的4個中格外，還需要計中央一個中格的數(shù)目（即80個小格）。每個樣品重復觀察計數(shù)不少于2

26、次，然后取其平均值。5.4 計數(shù)（1）1625的計數(shù)板孢子數(shù)（1/g）=（N/100）40010000（V/G）=4104（NV/G）式中：N為100小格內孢子總數(shù)；V為孢子稀釋液體，mL；G為覆蓋品質量，g。（2）2516的計數(shù)板孢子數(shù)（1/g）=（N/80）40010000（V/G）=5104（NV/G）式中：N為80小格內孢子總數(shù)；V為孢子稀釋液體積，mL；G為樣品質量，g。6 結果樣品稀釋至每個小格所含孢子數(shù)在10個以內較適宜，過多不易計數(shù)，應進行稀釋調整。結果記入下表。計算次數(shù)各中格孢子數(shù)小格平均孢子數(shù)稀釋倍數(shù)孢子數(shù)（1/g）平均值第一次第二次7 思考題用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)有什么優(yōu)

27、缺點？（二）孢子發(fā)芽率測定法1 目的學習孢子發(fā)芽率的測定方法。2 原理測定孢子發(fā)芽率的方法常有液體培養(yǎng)法和玻片培養(yǎng)法，部頒標準采用玻片培養(yǎng)法。本實驗應用液體培養(yǎng)法制片在顯微鏡下直接觀察測定孢子發(fā)芽率。孢子發(fā)芽率除受孢子本身活力影響外，培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等因素也會直接影響到測定的結果。所以測定孢子發(fā)芽率時，要求選用固定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，才能準確反映其真實活力。3 材料3.1 樣品種曲孢子粉。3.2 培養(yǎng)基察氏液體培養(yǎng)基。3.3 儀器及其他用品載玻片、蓋玻片、顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、恒溫搖床。4 流程種曲孢子粉接種恒溫培養(yǎng)制標本片鏡檢計數(shù)5 方法5.1 接種用接種環(huán)挑取種曲少許接入含

28、察氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30下?lián)u床。5.2 制片用無菌滴管取上述培養(yǎng)液于載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，注意不可產生氣泡。5.3 鏡檢將標本片直接放在高倍鏡下觀察發(fā)芽情況，標本片至少同時做2個，連續(xù)觀察2次以上，取平均值，每次觀察不少于100個孢子發(fā)芽情況。5.4 計算發(fā)芽率=A/（A+B）100%式中：A為發(fā)芽孢子數(shù)；B為未發(fā)芽孢子數(shù)。6 結果（1）正確區(qū)分孢子的發(fā)芽和不發(fā)芽狀態(tài)。（2）培養(yǎng)前要檢查調整孢子接入量，以每個視野含孢子數(shù)1020個為宜。（3）實驗結果記入下表。孢子發(fā)芽數(shù)（A）發(fā)芽和未發(fā)芽孢子數(shù)（A+B）發(fā)芽率%平均值7 思考題影響孢子發(fā)芽率的因素有哪些？哪些實驗步驟容易造成結果

29、誤差？實驗四糖化曲的制備及其酶活力的測定1 目的（1）學習制作糖化曲的方法。（2）掌握糖化酶活力的測定原理和方法。2 原理2.1 淀粉糖化可發(fā)酵性糖糖化曲是發(fā)酵工業(yè)中普遍使用的淀粉糖化劑。種類很多，如大曲、小曲、麥曲和麩曲等。曲中菌類復雜，曲霉菌是酒精和白酒生產中常用的糖化菌，含有許多活性強的糖化酶，能把原料中的淀粉轉變成可發(fā)酵性糖。在酒精和白酒生產中應用最廣時，除供給其生長繁殖必需的營養(yǎng)、溫度和濕度外，還必須進行適當?shù)耐L，以供給曲霉呼吸用氧。2.2 糖化酶活力的測定固體曲糖化酶活力的測定，采用可溶性淀粉為底物，在一定的pH值與溫度條件下，使之水解為葡萄糖，以斐林試劑快速法測定。斐林試劑由甲

30、、乙液組成，甲液為硫酸銅溶液，乙液為氫氧化鈉與酒石酸鉀鈉溶液。平時甲、乙液分別貯存，測定時，二者等體積混合?；旌蠒r硫酸銅與氫氧化鈉反應，生成氫氧化銅沉淀，沉淀與酒石酸鉀鈉反應，生成酒石酸鈉銅絡合物，使氫氧化銅溶解。酒石酸鉀鈉銅絡合物中二價銅是一個氧化劑。能使還原糖中的羰基氧化，而二價銅被還原成一價的氧化亞銅沉淀。反應終點用次甲基藍指示顯示。由于次甲基藍氧化能力較二價銅弱，故待二價銅全部被還原后，過量1滴還原糖被次甲基藍氧化，次甲基藍本身被還原，溶液藍色消失以示終點。溫度對糖化酶活力影響甚大，糖化溫度一定要嚴格控制。反應是在強堿性溶液沸騰情況下進行，產物極為復雜，為得到正確的結果，必須嚴格按操作

31、規(guī)程進行。斐林試劑甲、乙液平時應分別貯存，用時混合。反應液的酸堿度要一致，要嚴格控制反應液的體積。反應時溫度需一致，溫度恒定后才加熱，并控制在2min內沸騰。滴定速度需一致（按1滴/45s的速度進行）。反應產物中氧化亞銅極不穩(wěn)定，易被空氣所氧化而增加耗糖量。故滴定時不能隨意搖動三角瓶，更不能從電爐上取下后再行滴定。3 材料3.1 菌種AS3.4309黑曲霉斜面試管菌。3.2 培養(yǎng)料麩皮、稻皮。3.3 試劑斐林試劑、0.1%標準葡萄糖溶液、pH值4.6的乙酸乙酸鈉緩沖液、可溶性淀粉溶液、0.1mol/L NaOH溶液。3.4 儀器和器具恒溫水浴箱、恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、瓷盤、試管、三角瓶、50mL

32、 比色管或容量瓶、酸式滴定管。4 流程4.1 麩曲制備斜面試管菌活化麩皮水拌料潤料裝瓶滅菌冷卻接種培養(yǎng)三角瓶種曲麩水水拌料蒸料冷卻接種裝盤培養(yǎng)晾干麩曲4.2 糖化酶活力測定麩曲浸出液固體糖化液定糖糖化液測定計算結果記錄5 方法5.1 糖化曲制備（以淺盤麩曲為例）5.1.1 菌種的活化無菌操作取原試管菌1環(huán)接入察氏培養(yǎng)基斜面，或用無菌水稀釋法接種，31保溫培養(yǎng)47d，取出，備用。5.1.2 三角瓶種曲培養(yǎng)稱取一定量的麩皮，加入70%80%水，攪攔均勻，潤料1h，裝瓶，料厚1.01.5cm，包扎，在9.8104Pa壓力下滅菌40min。冷卻后接種，3132培養(yǎng)，待瓶內麩皮已結成餅時，進行扣瓶，繼續(xù)

33、培養(yǎng)34d即成熟。要求成熟種曲孢子稠密、整齊。5.1.3 糖化曲制備（1）配料 稱取一定量的麩皮，加入5%稻皮，加入原料量70%水，攪拌混勻。（2）蒸料 圓氣蒸煮4060min。時間過短，料蒸不透對曲質量有影響；時間過長，麩皮易發(fā)黏。（3）接種 將蒸料冷卻，打散結塊，當料冷至40時，接入0.25%0.35%（按干料計）三角瓶種曲，攪拌均勻，將其平攤在滅過菌的瓷盤中，料厚為12cm。（4）前期管理 將接種好的料放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為防止水分蒸發(fā)過快，可在料面上覆蓋滅菌紗布。這段時間為孢子膨脹發(fā)芽期，料醅不發(fā)熱，控制溫度30左右。810h，孢子已發(fā)芽，開始蔓延菌絲，控制品溫3235。若溫度過高，則水

34、分蒸發(fā)過快，影響菌絲生長。（5）中期管理 這時菌絲生長旺盛，呼吸作用較強，放熱量大，品溫迅速上升。應控制品溫不超過3537。（6）后期管理 這階段菌絲生長緩慢，故放出熱量少，品溫開始下降，應降低濕度，提高培養(yǎng)溫度，將品溫提高到3738，以利于水分排除。這是制曲很重要的排潮階段，對酶的形成和成品曲的保存都很重要。出曲水分應控制在25%以下?？偱囵B(yǎng)時間24h左右。（7）糖化曲感官鑒定 要求菌絲粗壯濃密，無干皮或“夾心”，沒有怪味或酸味，曲呈米黃色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲塊結實。5.2 糖化酶活力測定5.2.1 浸出液的制備稱取5.0g固體曲（干重），置入250mL燒杯中，加90mL水和10m

35、L pH值4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，搖勻，于40水浴中保溫1h，每隔5min攪拌1次。用脫脂棉過濾，濾液為5%固體曲浸出液。5.2.2 糖化液的制備吸取2%可溶性溶粉溶液25mL，置入50mL比色管中，于40水浴預熱5min。準確加入5mL固體曲浸出液，搖勻，立即記下時間。于40水浴準確保溫糖化1h。而后迅速加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液15mL，終止酶解反應。冷卻至室溫，用水定容至刻度，同時做一空白液。空白液制備：吸取2%可溶性淀粉25mL，置入50mL比色管中，行0.1mol/L氫氧化鈉溶液15mL，然后準確加入5%固體曲浸出液5mL，40水溶中準確保溫1h后用水定容至刻度。5.2.3

36、 葡萄糖測定空白液測定：吸取斐林試劑甲、乙液各5mL，置入150mL三角瓶中，加空白液5mL，并用滴定管預先加入適量的0.1%標準葡萄糖溶液，使后滴定時消耗0.1%標準葡萄糖溶液在1mL以內，加熱至沸，立即用0.1%標準葡萄糖溶液滴定至藍色消失，此滴定操作在1min內完成。糖化液測定：準確吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。5.2.4 計算固體曲糖化酶活力定義：1g干重固體曲，40，pH值4.6，1h內水解可溶性淀粉為葡萄糖的毫克數(shù)。糖化酶活力=式中：V0為5mL空白液消耗0.1%標準葡萄糖溶液的體積，mL；V為5mL糖化液消耗0.1%標準葡萄糖溶液的體積，mL；c為標準葡萄糖溶液

37、的質量濃度，g/mL； 為5mL糖化液換算成50mL糖化液中的糖量，g； 為5mL浸出液換算成100mL浸出液中的糖量，g；W為干曲稱取量，g；1000為g換算成mg。6 結果（1）記錄制曲過程中觀察到的現(xiàn)象。（2）酶活力測定結果列表記錄。7 思考題（1）固體曲和液體曲相比，各有何優(yōu)缺點？（2）糖化酶活力測定中應注意哪些因素？實驗五綜合實驗：檸檬酸發(fā)酵及產物提?。ㄒ唬?檸檬酸發(fā)酵一、實驗原理檸檬酸發(fā)酵為典型的有機酸發(fā)酵，淀粉質原料經淀粉酶作用水解為葡萄糖，葡萄糖經EMP途徑氧化為丙酮酸，丙酮酸進一步被氧化脫羥生成乙酰CoA，就一般能量代謝過程而言，生成的乙酰CoA與草酰乙酸縮合成檸檬酸后進入三

38、羥酸循環(huán)，通過三羥酸循環(huán)進行有氧呼吸的能量代謝。但就檸檬酸產生菌而言，由于其烏頭酸流水作業(yè)事酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，而檸檬酸合成酶的活性很高，因而大量積累檸檬酸，草酰乙酸的提供則仍通過丙酮酸羧化而成，檸檬酸的生成途徑如下式：國內目前檸檬酸發(fā)酵所采用的原料主要是山芋干及廢糖蜜。二、實驗器材（一）材料1菌種：黑曲霉Co8272液化酶92000u/g）3山芋干粉（二）主要儀器設備1旋轉式搖床2顯生鏡三、操作步驟1種子培養(yǎng)基制備：稱取山芋干粉100g、（NH4）2SO45g、液化酶0.2g，加水至1000ml，pH自然。分裝后于121滅菌30min，三角瓶內裝液量為20%。2種子液培養(yǎng)：將已滅菌的

39、種子培養(yǎng)基接入一環(huán)斜面或麩曲孢子于351、250r.p.m條件下培養(yǎng)2436h。3種子培養(yǎng)液質量要求：鏡檢菌絲生長健壯，結成菊花形小球，球直徑不超過100m，每毫升含菌球數(shù)在12萬之間，無異味、無雜菌污染；pH22.5；酸度1.52.0%。4發(fā)酵培養(yǎng)基制備：稱取山芋干粉200g，加入0.2克液化酶，加水至1000ml，pH自然。分裝后（裝液量為20%）于121滅菌30min冷卻備用。5發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按發(fā)酵培養(yǎng)液體積的10%接入到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于351、250r.p.m條件下發(fā)酵45天。四、實驗結果1對種子液進行鏡檢，畫下菌絲形態(tài)，并測定菌球直徑及粗略估算每ml種子液中的菌球數(shù)。

40、2測定成熟發(fā)酵液的酸度，并就發(fā)酵結束后的菌體形態(tài)作出描述。3計算檸檬酸發(fā)酵的轉化率，即每100克葡萄糖經轉化所能生成的檸檬酸克數(shù)，檸檬酸酵的理論轉化率按下列反應計算應為106.7%。總反應式：2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O2180 2192理論轉化率=（二） 檸檬酸的提取檸檬酸鈣的制備一、實驗原理在成熟的檸檬發(fā)酵液中大部分是檸檬酸，但還含有部分山芋粉渣、菌絲體以及其它的代謝產物的雜質。檸檬酸的提取是檸檬酸生產中極為重要的工序，檸檬酸的提取方法有鈣鹽沉淀法、離子交換法、電滲折法及萃取法等，目前廣泛用于國內生產的是鈣鹽沉淀法，其原理是利用檸檬酸與碳酸鈣反應形成不溶性的檸檬酸鈣而將

41、檸檬酸從發(fā)酵液中分離出來，并利和硫酸酸解從而獲得檸檬酸粗液，經活性炭、離子交換樹脂的脫色及脫鹽，再經濃縮，結晶干燥等精制后獲得檸檬酸成品，其中和及酸解反應式如下：中和：2C6H8O7H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）24H2O+3CO2+H2O酸解：Ca3（C6H5O7）24H2O+3H2SO4+4H2O2C6H8O7H2O +3CaSO42H2O本實驗以提取檸檬酸鈣鹽為主。二、實驗器材（一）實驗材料1檸檬酸發(fā)酵液、輕質碳酸鈣（200目）、0.1429N氫氧化鈉溶液、1%酚酞指示劑（二）儀器設備1制備式離心分離機、滴定管、烘箱三、實驗步驟1發(fā)酵液預處理：將成熟的檸檬酸發(fā)酵液加熱至80，

42、保溫1020分鐘，趁熱進行離心分離，取濾液備用并記錄濾液總體積。2發(fā)酵液總酸的測定：取濾液1ml，加5ml蒸餾水于潔凈三角瓶人加入1滴酚酞指示劑用0.1429N NaoH滴定于初顯紅色為止，記下NaOH的消耗量。3中和：將發(fā)酵濾液加熱至70，同時加入發(fā)酵液總酸量72%的輕質碳酸鈣進行中和至pH 5.8，殘酸0.2%0.3%，并于85條件下攪拌并保溫30min。4離心及洗糖：將中和液趁熱離心，傾去上清液后加入濾液總量1/2的80熱水洗糖，再次離心所得固體即為檸檬酸鈣鹽。5將所得檸檬酸鈣置于干燥潔凈的表面皿中，于105烘干稱重。四、實驗結果1計算發(fā)酵液中總酸濃度及發(fā)酵所得的總酸量。2根據(jù)所得的鈣鹽

43、重量計算鈣鹽提取的提取收率。3簡述發(fā)酵液預處理的意義及洗糖的目的。實驗六酵母發(fā)酵力的測定（一）酒精酵母發(fā)酵力的測定一、目的要求掌握酵母發(fā)酵力的測定方法及表示法。二、實驗原理酵母在微酸性糖液中起發(fā)酵作用，其中的糖逐漸減少，乙醇及CO2則依比例而增大，CO2是氣體，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以測定酵母的發(fā)酵力，或測糖液比重的減小，或測糖的減少，或乙醇的增加，或稱培器為減輕量，以CO2的失去多少，或用NaOH等固定CO2然后稱其量，或將培養(yǎng)器密閉，由其中壓力的增大，而定發(fā)酵的強弱等。以測醪的比重（Brix），可以算出發(fā)酵度（測量時前后溫度要一致），則表現(xiàn)發(fā)酵度AP等于下式：可是發(fā)酵后的醪內有乙

44、醇，所以它的比重不能代表糖的殘留量，前式算出的發(fā)酵度也因此加上“表現(xiàn)”二字。真正發(fā)酵度的計算法，是取發(fā)酵后的醪100毫升，蒸發(fā)至50毫升，將乙醇完全驅逐，用蒸餾水沖成100毫升，然后測定Brix度，以d示之，則真正發(fā)酵度酸度RP等于下式：稱發(fā)酵瓶法，多用發(fā)酵栓（圖）內盛稀釋酸，吸收隨CO2跑出的水汽。三、實驗材料1菌種：酒精酵母及供試菌種。2培養(yǎng)基：15Brix麥芽汁300毫升。3試劑：5N左右的硫酸。4器具：Brix麥1支，無菌1毫升吸管，10毫升，吸管帶發(fā)酵栓的250毫升發(fā)酵瓶，天平。四、方法步驟1將麥芽汁的比重，用Brix表測出，記入附表，然后分裝入發(fā)酵瓶中，每瓶10毫升，加棉栓，另用油

45、紙包發(fā)酵栓，一齊殺菌0.6公斤/厘米220分鐘。2麥芽汁冷至2030（勿）用表號，以手測之，貼標簽，注明菌種及接種日期。將管中麥芽汁培養(yǎng)的酵母搖勻，用無菌吸管移1毫升于發(fā)酵瓶中，再用另一吸管移接到另一發(fā)酵瓶。3打開發(fā)酵栓的油紙，裝于發(fā)酵瓶栓，用吸管裝5N硫酸入發(fā)酵栓，以距離出氣口管半厘米為度。4用于布將發(fā)酵瓶各部分抹干凈，置瓶于粗天平上稱量，記入附表，移瓶于25保溫箱中，以后每天稱量一次，均記入附表，以減輕量小于0.2克為止。5搖動二瓶，使CO2盡量逸去，然后打開，加水化成150毫升用Brix表測出比重，計算真正發(fā)酵度。6取發(fā)酵醪100毫升，蒸發(fā)去約一半，冷涼，加蒸餾水，沖成100毫升，測其B

46、rix，度計算真正發(fā)酵度。五、結果記錄與思考題1將實驗結果記錄填入下表（甲）發(fā)酵瓶減輕量（CO2量）重量(克)菌種名稱原重量第一天第二天第三天第四天第五天第六天第七天第八天第九天第十天總量減輕酒精酵母（乙）發(fā)酵度比重酒精酵母原麥芽汁（Bx）發(fā)酵后醪去乙醇后外觀發(fā)酵度真正發(fā)酵度（%）酒精酵母（二）市售活性干酵母發(fā)酵力的測定二、目的要求掌握市售活性干酵母發(fā)酵力的測定方法。二、實驗原理發(fā)酵力是酵母菌重要的應用特性之一。關于發(fā)酵力的測定，多用Meisse法或Hayduck氏法。前者為測CO2的重量法，其方法是：制好培養(yǎng)基（蔗糖4克，磷酸二氫鉀0.22克，硫酸鎂0.25克，裝入帶有發(fā)酵栓的瓶口，加壓榨酵

47、母一克，稱瓶重至30培養(yǎng)箱內5小時后再稱瓶，減少之數(shù)，即為CO2量。以下式計算之：式中1.75系依麥塞爾（Missel）氏規(guī)定，1克純酵母能發(fā)酵產生1.75克二氧化碳者，稱為規(guī)定酵母，其發(fā)酵力為100。Nageli改良了Hayduck法，在發(fā)酵液中加入無機鹽類，結果與實際制面包發(fā)酵結果相近。在400ml的發(fā)酵液中加壓榨酵母10克，30溫度下，2小時產生CO21000ml以上的為優(yōu)良酵母，800至1000ml的為中等，800ml以下者為劣品。此方法適合于壓榨酵母，固體酵母，活性干酵母發(fā)酵力的檢測，同樣適于酒曲發(fā)酵力的測定。三、材料1菌種：壓榨酵母10克。2培養(yǎng)基：發(fā)酵液400毫升（40克蔗糖），

48、2克磷酸二氫鉀，1克磷酸二氫銨，0.25克硫酸鎂瘃0.2克硫酸鈣）。3器具：測定設備一套，培養(yǎng)箱、天平、水浴（見圖18-1）。四、操作步驟1發(fā)酵液置培養(yǎng)箱中一小時，使其溫度達30，發(fā)酵器置于30水浴中，維持不變。圖6-3 壓榨酵母發(fā)酵力測定裝置2將10克酵母加入發(fā)酵液中和勻，入發(fā)酵器的甲瓶中。記時間，連接管塞，酵母在甲瓶發(fā)酵所生CO2，經導管到乙瓶，排乙瓶的水入量筒，所以量筒內水的毫升數(shù)即等于甲瓶中所生CO2的毫升數(shù)。為免去乙瓶中水吸收CO2，可于水面加石油一層，使CO2與水不接觸，或用食鹽飽和水，減低CO2的溶解量。3六小時后，觀察量筒中水的容量，將所生CO2的毫升數(shù)，或用0.03841乘，

49、得百克酵母所發(fā)酵的蔗糖的克數(shù)；用0.4乘，得百克酵母發(fā)酵葡萄糖的克數(shù)。五、結果記錄與思考題1記錄所生CO2毫升。2計算酵母發(fā)酵葡萄糖的克數(shù)。3請試推算一下發(fā)酵力的計算方法。實驗七酒精發(fā)酵及酒曲中酵母菌的分離一、實驗原理在無氧的培養(yǎng)條件下酵母菌利用已糖發(fā)酵為酒精和二氧化碳的過程，稱為酒精發(fā)酵?？偡磻綖椋篊6H12O62C2H5OH+2CO2酒精發(fā)酵是生產酒精及各種酒類的基礎，通過測定發(fā)酵過程中產生CO2和量和最終產物酒精的量可以得知酵母的發(fā)酵能力。酒曲中含有大量的微生物，其中有霉菌、酵母和細菌，在液體中，酵母生長比霉菌快，而酸性培養(yǎng)基酵母比細菌生長更適宜。因此，利用這一特性，可先將酒曲中的霉菌

50、與細菌數(shù)目減少，甚至消除（生理純化法），然后用平板法分離酵母。此法較為簡單。二、實驗器材1蒸餾燒瓶、冷凝管、容量瓶、量筒、電爐、水浴鍋、酒精燈、接種環(huán)、小刀、無菌平板、酒精度表（0%31%）、溫度計（0100）。2酒曲、釀酒酵母（Shaccharomyces cerevisiae）、-淀粉酶。3麥芽汁培養(yǎng)基三、操作步驟（一）酒精發(fā)酵1酒母的培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基的制備制取濃度為13BX的麥芽汁試管斜面培養(yǎng)基 將濃度為13BX的麥芽100ml，加入2g瓊脂，融化后分裝試管，121滅菌30min。液體試管培養(yǎng)基 將濃度為13BX的麥芽汁分裝試管，121滅菌30min。三角瓶擴大培養(yǎng)基 將濃度為13BX的

51、麥芽汁分裝500ml三角瓶，每瓶80ml，用3molL-1硫酸調節(jié)pH值至4.14.5，121滅菌30min。（2）接種與擴大培養(yǎng) 將釀酒酵母接種于試管斜面，2830培養(yǎng)48h，再將培養(yǎng)好的斜面接種1環(huán)于液體試管中，30培養(yǎng)24h，然后將液體酵母接種于三角瓶中，2830培養(yǎng)24h。（3）酒母質量檢查 好的酒線應該形態(tài)整齊，細胞內原生質稠密，無空泡、無雜菌、細菌數(shù)達0.81.0億/ml，出芽率17%20%，死亡率小于2%。2淀粉的液化與糖化（1）按13.5的山芋粉和水的比例，用80的溫水調粉漿100ml，加入0.1%-淀粉酶（調勻后漿液的溫度應高于65）于水浴加熱到9093，保持10min，并繼

52、續(xù)加熱煮沸1h，不斷補充水分。（2）將上述認化醪冷至6062加入10%麩曲，糖化30min，分裝三角瓶，每瓶量為400ml。（3）糖化醪質量檢查 要求糖度1617BX，還原糖4%6%，酸度23。3發(fā)酵 將培養(yǎng)好的酒母用無菌操作接入盛有400ml糖化醪的發(fā)酵瓶中，30培養(yǎng)6872h。4生成CO2量的測定 酒精發(fā)酵測CO2產生量（失重量）的裝置如圖1所示。（1）培養(yǎng)前，揩干三角瓶外壁，置于百分之一的天平上稱量，記下重量為W1。（2）培養(yǎng)完畢后，取出三角瓶輕輕搖動，使CO2盡量逸出，在同一架天平上稱重，記下重量為W2。（3）二氧化碳重量=W1-W25酒精度的測定（1）酒精生成的檢驗 嗅聞有無酒精氣味

53、；或取發(fā)酵液少許于試管中并滴加1%K2Cr2O7溶液，如管內由橙色變?yōu)辄S綠色，則證明有酒精生成。（2）按圖2裝好蒸餾裝置。圖1 酒精發(fā)酵測二氧化碳產生量的裝置 圖2 酒精發(fā)酵醪蒸餾酒精裝置1.安全回流管 2.蒸餾瓶 3.冷凝管4.石棉板 5.電爐 6.鐵架（3）準確量取100ml發(fā)酵液于500ml蒸餾瓶中，同時加入等量的蒸餾水。連接好冷凝器，勿使漏氣，用電爐加熱，餾了液收集于100ml容量瓶中。待餾出液達到刻度時，立即取出容量瓶搖勻，然后倒入100ml量筒中，以酒精表與溫度計同時插入量筒，測定酒精度和溫度，最后換算成20時酒精度。（二）酒曲中酵母菌的分離1配制培養(yǎng)基（1）酸性蔗糖豆芽汁（加乳酸

54、0.5%）培養(yǎng)液分裝試管，滅菌。（2）蔗糖豆芽汁瓊脂，分裝試管和三角瓶，滅菌。2分離（1）用滅菌過的小刀，割開曲塊，挖其中米粒大小1塊投入酸性培養(yǎng)液中，搖動后將該管置于25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩天后轉到另一管酸性培養(yǎng)液中，見到霉菌絲球即行剔除。然后每隔兩日轉接一次，一周后分離。（2）最后將轉接試管酸性培養(yǎng)液中的酵母直接用稀釋平板法進行分離，培養(yǎng)后，分別移植單獨的酵母菌落于蔗糖豆芽汁斜面上，貼上標簽，標明菌株編號以及移植日期，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出、分純后即可進行鑒定。四、實驗結果1比較酒精生成量及CO2生成量之間的關系。2發(fā)酵培養(yǎng)基液化、糖化及調節(jié)pH的目的、意義？實驗八酵母忍耐酒精濃度的測定二、目的要求掌握和理解測定酵母耐酒精濃度